Optimización de los parámetros de clasificación por citometría de flujo para el aislamiento y purificación de alto rendimiento de pequeñas vesículas extracelulares

Este protocolo proporciona un método de solución rápido y específico para pequeñas vesículas extracelulares mediante la optimización de los parámetros de clasificación por citometría de flujo. Estas optimizaciones proporcionan un panel de configuraciones de ordenación críticas que permiten obtener poblaciones representativas de pequeñas vesículas extracelulares utilizando dispersión directa frente a dispersión de tamaño solamente. Comience realizando el procedimiento de inicio estándar del clasificador de celdas de flujo.

Encienda la máquina presionando el botón de inicio, luego haga clic en el botón de encendido láser en el panel de control láser. Pulse el botón de cambio de tanques en el submenú Smart Sampler para presurizar la fluidos. Use un chorro de 50 micrómetros y una boquilla de aire limpiados por ultrasonidos e instálela hasta el conjunto de la boquilla.

Ajuste la presión a 80 SI para el fluido de la vaina y 80,3 SI para el flujo de muestra en la consola de presión. Presione el botón de flujo de la vaina de inicio para iniciar el flujo de la corriente de la vaina. Haga clic en el botón de burbuja en el submenú Smart Sampler para desburbular automáticamente durante 10 minutos y, a continuación, desactívelo.

Para alinear la corriente y determinar el punto láser, encienda la luz de la cámara de iluminación para ver la corriente sobre los agujeros de alfiler. Ajuste los micrómetros hacia arriba y hacia abajo, izquierda y derecha, y delantero y trasero para centrar la corriente en el agujero de alfiler y enfocar la corriente. Abra todos los obturadores láser, seleccione la pestaña de intercepción láser y de flujo y luego presione el botón de flecha verde continuamente según se le solicite para completar el proceso de calibración de intercepción láser y alineación de boquillas.

Acceda a la pantalla de alineación láser fina. Seleccione el láser de 640 nanómetros y el canal de paso de banda de 44 barras de 772 bar como parámetro del eje x y el láser de 405 nanómetros y el canal de paso de banda de 448 bar 59 como parámetro del eje y. Presione el selector de parámetros de disparo y elija el parámetro de dispersión directa del láser de 488 nanómetros.

A continuación, diluya las partículas fluorescentes del arco iris agregando una gota en un mililitro de agua destilada doble a una concentración final de una vez 10 a la sexta perlas por mililitro. Abra la puerta de la cámara de muestras y cargue un tubo de partículas fluorescentes arco iris preparadas. Presione el botón de inicio de muestra y ajuste los micrómetros hacia arriba y hacia abajo para optimizar la intensidad de la fluorescencia, haciendo que cada señal sea lo más intensa posible.

Presione el botón de control de calidad de inicio o control de calidad en el panel de control de la pantalla táctil para realizar el control de calidad automáticamente. A continuación, presione el botón de inicialización IntelliSort. El instrumento ajusta automáticamente la frecuencia y amplitud de la oscilación de gotas para obtener el retardo de caída de aproximadamente 25 y poder visualizar claramente el punto de ruptura de la caída.

A continuación, presione el botón de retardo de caída y el botón de mantenimiento. Seleccione tubo como tipo de salida de ordenación. Coloque un soporte de tubo de 15 mililitros en la cámara de clasificación.

Encienda el voltaje de la placa y ajuste el voltaje de la placa a aproximadamente 4, 000 voltios. A continuación, active el patrón de prueba seleccionando el botón de configuración de transmisión. Ajuste el control deslizante de fase de carga y el control deslizante de deflexión para asegurarse de que la imagen de la corriente esté en línea con el tubo de recolección.

A continuación, seleccione el botón de marca de verificación. Inicie sesión en la estación de trabajo Summit en el equipo. Cree un nuevo protocolo desde el menú principal del archivo.

A continuación, cree un diagrama de puntos seleccionando la pestaña de histograma en el panel de control de Summit Software. Elija la dispersión hacia adelante como parámetro del eje x y la dispersión lateral como parámetro del eje y. A continuación, haga clic con el botón derecho en el eje del nuevo diagrama de puntos en el espacio de trabajo y presente la dispersión hacia adelante y la dispersión lateral en forma logarítmica.

Seleccione la ficha de adquisición y localice el panel de parámetros de adquisición. Habilite todas las señales en el submenú de habilitación de parámetros. Elija la dispersión hacia adelante como parámetro de activación y establezca el umbral de 0,01.

Ajuste el voltaje y la ganancia de dispersión directa y dispersión lateral a 250 y 0,6 para garantizar que los eventos dentro del gráfico y las poblaciones de dispersión directa frente a dispersión lateral estén separados. Diluya las microesferas de poliestireno fluorescente en suspensiones de 100, 200 y 300 nanómetros agregando un microlitro de microesferas a un mililitro de agua destilada doble. A continuación, cargue la suspensión de microesferas sucesivamente.

Seleccione Inicio en el menú de adquisición de Summit Software para grabar 20, 000 eventos y luego haga clic en Detener después de grabar los eventos. Haga clic con el botón derecho en el diagrama de puntos de dispersión hacia adelante frente a dispersión lateral para crear rectángulos y arrastre para cambiar el tamaño. Reposicione las regiones de ruido electrónico y la población de microesferas de 100 nanómetros haciendo clic derecho en las regiones para cambiarles el nombre como R7 y R4 respectivamente.

Repita los pasos para enmarcar las microesferas de 200 y 300 nanómetros con rectángulos sucesivamente, y cámbieles el nombre como R5 y R6 respectivamente. Finalmente, determine la región de clasificación de 50 a 200 nanómetros en función del ruido electrónico y la posición de las partículas de 200 nanómetros para definirla como R8. Edite las decisiones de ordenación en el panel de lógica de ordenación y estadísticas haciendo doble clic en el campo en blanco de la secuencia izquierda o L1 y seleccionando la región denominada R8 para crear la lógica de ordenación. Elija el modo de anulación de pureza y seleccione un sobre de gota por encima de una gota para la secuencia L1.

Cargar 500 microlitros de muestra de vesículas extracelulares o mezcla de EVs previamente preparadas. Presione el botón Inicio debajo del menú de adquisición en Summit para adquirir los datos y luego haga clic en Detener. A continuación, presione Inicio en el menú de clasificación para recolectar pequeñas vesículas extracelulares de 50 a 200 nanómetros o sEV en un tubo de centrífuga de 15 mililitros.

El análisis de citometría de flujo de microesferas de poliestireno de tamaño estándar para localizar el rango de tamaño de 50 a 200 nanómetros en el gráfico de dispersión directa versus dispersión lateral reveló señales de partículas distinguibles. R4, R5 y R6 se refieren a las posiciones de partículas de 100, 200 y 300 nanómetros respectivamente. R7 es el ruido electrónico como límite de detección para partículas de 50 nanómetros y R8 representa el rango de posición de partículas de 50 a 200 nanómetros.

La distribución del tamaño de partícula de la mezcla de EV derivada de células pancreáticas mediante análisis de seguimiento de nanopartículas, o NTA, estaba en el amplio rango de 40 a 400 nanómetros después de la ultracentrifugación. Se realizó una clasificación citométrica de flujo para aislar y purificar el sEV de 50 a 200 nanómetros dentro de la región R8. La calidad del aislamiento fue verificada por NTA y se encontró que el rango de tamaño de partícula de sEV después de la clasificación fue de entre 50 y 200 nanómetros.

La presencia de sEV se observó además mediante TEM y se confirmó que los sEV aislados contenían marcadores de CD6, CD63 y CD81 mediante análisis de Western Blot. Este método permite la separación de pequeñas vesículas extracelulares y la clasificación o análisis provisional de la expresión génica de pequeñas vesículas extracelulares, abriendo numerosas aplicaciones de investigación posteriores.