Name: Microscopía de superresolución del complejo sinaptonémico dentro de la línea germinal Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Aprende microscopía de superresolución del complejo sinaptonémico en Caenorhabditis elegans usando inmunotinción y localización de moléculas individuales. Este protocolo alcanza 30 nanómetros de resolución en tejidos intactos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nos gustaría agradecer a Jonas Ries y al laboratorio de Ries por compartir búferes de imágenes para imágenes SMLM. También agradecemos a Yumi Kim por la cepa C. elegans utilizada en este protocolo y a Abby F. Dernburg por el anticuerpo pollo-anti-HTP-3. Agradecemos a Marko Lampe y Stefan Terjung del Centro de Microscopía Óptica Avanzada del EMBL Heidelberg por su apoyo en el uso del microscopio confocal Olympus iXplore SPIN SR. Este trabajo fue apoyado por el Laboratorio Europeo de Biología Molecular y la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación - 452616889, SK). Reconocemos el acceso y los servicios proporcionados por el Centro de Imágenes del Laboratorio Europeo de Biología Molecular (EMBL IC), generosamente apoyado por la Fundación Boehringer Ingelheim.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

La organización en forma de escalera del SC, que es esencial para la correcta recombinación y segregación de cromosomas homólogos, se observó por primera vez hace casi 70 años en microscopía electrónica 3,4. Si bien la organización general del SC se resuelve fácilmente en microscopía electrónica, la localización de componentes individuales dentro de este complejo requiere un enfoque más específico. Con su ancho de sólo ~100 nm, la subestructura del SC no puede ser resuelta por microscopía de fluorescencia convencional. Sin embargo, la microscopía de súper resolución se ha convertido en un importante impulsor de nuevos descubrimientos sobre la estructura y función del complejo sinaptonémico 16,19,24,25,26,27,28,29,30. Para facilitar esta investigación, hemos demostrado un procedimiento de montaje que permite estudiar la arquitectura del SC dentro del tejido de la gónada de C. elegans con microscopía SMLM y STED.
Un paso crítico para optimizar la resolución en las imágenes SMLM es la reticulación directa del tejido de la línea germinal a un cubrecubierto recubierto de poli-L-lisina (paso 4). La unión covalente del tejido al cubreobjetos es esencial para reducir los movimientos dentro de la muestra que darían lugar a grandes derivas y harían imposible la obtención de imágenes durante largos períodos de tiempo para SMLM. Además, incluso una unión subóptima que deja los núcleos que contienen SC a una distancia del cubreobjetos conduce a una caída significativa en la resolución alcanzable como resultado de aberraciones esféricas (Figura 4). Alternativamente a la unión covalente utilizada aquí, el tejido de la línea germinal teñido también se puede inmovilizar entre dos cubreobjetos sellados en una pequeña gota de tampón de imagen19,30. Sin embargo, este método de inmovilización reduce severamente el volumen de tampón de imagen en la muestra de 1 ml utilizado en el protocolo optimizado aquí a solo unos pocos μL, lo que resultará en una acidificación del tampón de imágenes y reducirá severamente el tiempo durante el cual se puede obtener una imagen de la muestra 38,53,54.
Los largos tiempos de adquisición para la microscopía SMLM y STED limitan el uso de estos métodos a la obtención de imágenes de muestras fijadas químicamente. Aquí, la fijación de paraformaldehído asegura que la estructura del SC se conserve durante la preparación de la muestra y la obtención de imágenes. Sin embargo, a pesar de las precauciones tomadas aquí para obtener imágenes del SC dentro del tejido intacto, la estructura resultante del SC después de la fijación no es necesariamente idéntica a la estructura en su estado nativo dentro de un organismo vivo. Además, dado que una sola imagen del SC fijo representa una única "instantánea" de la estructura biológica, este enfoque permanece ciego a la dinámica de la estructura nativa in vivo.
Sin embargo, la información sobre la dinámica y la variabilidad de las estructuras macromoleculares también se puede obtener adquiriendo no solo una sino muchas "instantáneas". Si bien este enfoque puede resolver cambios en la estructura del SC durante el paquiteno19, hay varios factores que limitan el número de imágenes que se pueden adquirir de una sola muestra preparada utilizando este protocolo. En primer lugar, las altas potencias láser utilizadas durante la adquisición de imágenes conducen a un blanqueamiento permanente de los fluoróforos e impiden la obtención de imágenes de regiones adyacentes de interés o múltiples planos z, lo que reduce significativamente el número de imágenes que se pueden adquirir de una sola muestra. En segundo lugar, la densidad de muestra/tejido en el cubreobjetos preparado por este método es baja, lo que limita significativamente el número de imágenes que se pueden adquirir de un solo cubreobjetos. La baja densidad de la muestra también prohíbe el uso de tuberías automatizadas de adquisición de imágenes que ayudaron a arrojar luz sobre otras cuestiones biológicas 34,55,56,57,58,59. Sin embargo, la densidad de la muestra puede ser aumentada ligeramente por un usuario experimentado.
El protocolo presentado aquí está optimizado para obtener una alta densidad de etiquetado que es necesaria para lograr una resolución óptima en SMLM35. Mientras que los protocolos anteriores unen covalentemente el tejido al cubreobjetos antes de la inmunotinción16, este nuevo protocolo vincula el tejido al cubreobjetos solo después de que las muestras se tiñeron en solución. Esta modificación permite que los anticuerpos utilizados para el inmunomarcaje accedan libremente al tejido desde todos los lados, mientras que la unión covalente del tejido al cubreobjetos puede restringir que los anticuerpos lleguen a los núcleos más cercanos al cubreobjetos, reduciendo así el grado de marcado. En conjunto, las modificaciones descritas aquí mejoran la resolución de 40-50 nm (resolución FRC)16 a 30-40 nm (este protocolo).
Es importante destacar que, si bien una alta densidad de etiquetado y una alta concentración de anticuerpos son esenciales para SMLM, encontramos que se obtienen mejores imágenes de microscopía STED utilizando concentraciones de anticuerpos más bajas (paso 3). Con una resolución de decenas de nanómetros, el tamaño de las moléculas utilizadas para etiquetar la proteína de interés se vuelve cada vez más importante. Por lo tanto, empleamos fragmentos F(ab')2 que son la mitad del tamaño de los anticuerpos de longitud completa. La mejora en el contraste local debido a una fuente de señal más pequeña, y por lo tanto la resolución obtenida por esta modificación en comparación con el uso de anticuerpos secundarios de longitud completa, permitió la resolución de los dos C-terminales de SYP-5 dentro de la región central por TauSTED, que no se resuelven mediante ETS convencionales utilizando anticuerpos de longitud completa (16 y datos no mostrados). Anticipamos que este protocolo optimizado para obtener imágenes de SC en líneas germinales intactas de C. eleganfacilitará la investigación de la relación estructura-función del SC durante la meiosis.

Reducir el número de cromosomas a la mitad durante la meiosis es clave para generar una progenie saludable en los organismos que se reproducen sexualmente. Para lograr esta reducción en el número de cromosomas, los cromosomas homólogos deben emparejarse y segregarse durante la meiosis I. Para garantizar la segregación precisa de los cromosomas homólogos, las células germinales se someten a una profase I extendida, durante la cual los cromosomas homólogos se emparejan, hacen sinapsis y se recombinan para generar vínculos físicos entre homólogos1. El SC se ha convertido en la estructura central clave para regular la correcta progresión a través de la profasemeiótica 2.
El SC es un complejo cuya estructura general se conserva evolutivamente, aunque hay poca homología entre sus componentes proteicos. El SC se identificó por primera vez en micrografías electrónicas como una estructura tripartita, similar a una escalera, que consta de dos elementos laterales o ejes, una región central formada por filamentos transversales y un elemento central 3,4. Determinar la organización de los componentes individuales dentro del complejo es clave para avanzar en nuestra comprensión del papel del SC durante la profase meiótica.
El organismo modelo C. elegans es ideal para estudiar la estructura y función del SC ya que sus líneas germinales contienen un gran número de núcleos meióticos con SCs completamente ensamblados5. Estudios genéticos y bioquímicos han revelado que los ejes cromosómicos están formados por tres complejos distintos de cohesina6,7 y cuatro proteínas de dominio HORMA llamadas HTP-1/2/3 y HIM-3 7,8,9,10,11 en C. elegans. En la región central del SC, se han identificado seis proteínas que contienen dominios de bobina enrollada hasta la fecha 12,13,14,15,16,17. Para salvar la distancia entre los dos ejes, SYP-1, -5 y -6 dimerizan de manera cara a cara (Figura 1), mientras que tres proteínas adicionales estabilizan su interacción en el elemento central16,17,18,19.
Obtener información detallada sobre la organización de estas proteínas es esencial para comprender las muchas funciones del SC durante la meiosis. Dado que el ancho de la región central del SC es solo ~ 100 nm, su subestructura no puede resolverse mediante microscopía de fluorescencia limitada por difracción. Sin embargo, la visualización de componentes dentro de una estructura de este tamaño es fácilmente alcanzable por microscopía de súper resolución. De hecho, la microscopía de iluminación estructurada (SIM), la microscopía de expansión 20, la microscopía de agotamiento de emisión estimulada (STED) 21 y la microscopía de localización de molécula única (SMLM)22,23 han surgido como herramientas esenciales para estudiar la arquitectura molecular del SC en especies 16,24,25,26,27,28,29, 30.
Para superar el límite de resolución, la microscopía STED se basa en superponer el punto limitado por difracción de la luz de emisión con un haz en forma de rosquilla del láser STED, que teóricamente constriñe la función de dispersión puntual hasta dimensiones moleculares31,32. Sin embargo, la resolución que es prácticamente alcanzable por STED dentro de muestras biológicas permanece en el rango de unas pocas decenas de nanómetros en xy33.
Se puede obtener una resolución aún mayor en muestras biológicas con técnicas SMLM. SMLM aprovecha las propiedades de parpadeo de fluoróforos específicos para resolver objetos a nivel de subdifracción separando fluoróforos espacialmente superpuestos en el tiempo. Luego, la muestra se visualiza repetidamente para capturar diferentes subconjuntos de fluoróforos. La posición de los fluoróforos dentro de la muestra se determina ajustando la función de dispersión puntual (PSF) a las señales obtenidas en todas las imágenes, que pueden resolver estructuras de hasta 15 nm23,34.
En conjunto, las imágenes localizadas codifican las posiciones de todos los fluoróforos. La resolución de SMLM está determinada por la densidad de etiquetado y las características de parpadeo del fluoróforo. De acuerdo con el criterio de Nyquist-Shannon, es imposible resolver de manera confiable objetos que son menos del doble de la distancia promedio de etiqueta a etiqueta. Por lo tanto, se necesita una alta densidad de etiquetado para imágenes de alta resolución. Para el SC en C. elegans, se puede lograr una alta densidad de etiquetado mediante el uso de etiquetas de epítopos unidas a sitios específicos de proteínas endógenas utilizando la edición del genoma. Las etiquetas de epítopos pueden teñirse a una alta densidad utilizando anticuerpos monoclonales específicos con altas afinidades19,30. Al mismo tiempo, el ciclo de fluoróforos individuales debe ser lo suficientemente corto como para garantizar que los fluoróforos espacialmente superpuestos no se capturen al mismo tiempo35.
Debido a estos dos requisitos, resolver la estructura de grandes complejos macromoleculares como el SC requiere obtener imágenes de un número suficientemente grande de imágenes y, por lo tanto, puede llevar varias horas. La trampa de los largos tiempos de obtención de imágenes es que las muestras tienden a desplazarse debido al movimiento de la etapa o a pequeñas corrientes dentro del búfer de muestra; Incluso pequeños movimientos del orden de 10 nm son perjudiciales a la resolución de nm y deben corregirse. Sin embargo, los métodos de corrección de deriva comúnmente utilizados no son lo suficientemente robustos como para superponer con precisión imágenes de dos canales fotografiados secuencialmente36. Esto es problemático porque las preguntas biológicas a menudo requieren la detección precisa y la localización de múltiples objetivos dentro de la misma muestra. Para evitar estos problemas, se han desarrollado métodos como la imagen ratiométrica. La imagen ratiométrica permite la obtención simultánea de múltiples fluoróforos con espectros de excitación y emisión superpuestos, con una asignación posterior de cada señal detectada a su respectivo fluoróforo basado en la relación de intensidades en canales espectralmente distintos37,38.
Además, el estudio de la organización de complejos macromoleculares como el SC requiere información tridimensional (3D). Para lograr una superresolución en tres dimensiones (3D-SMLM), se incorpora una lente cilíndrica en la trayectoria óptica de la luz emitida que distorsiona la forma del PSF de un fluoróforo dependiendo de su distancia del plano focal. Por lo tanto, la posición precisa de un fluoróforo en el plano z se puede extrapolar analizando la forma de su señal de emisión35,39. La combinación de estos avances en SMLM permite obtener imágenes de la organización 3D de complejos macromoleculares, incluido el SC.

<table><tbody><tr><td>Objetivo de aceite 100x/1.5</td><td>Olympus</td><td>UPLAPO100XOHR</td><td>UPLAPO100XOHR</td></tr><tr><td>2-mercaptoetilamina (MEA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30070-10G</td><td>Disuelto en agua MilliQ a una solución de 5 M, pH &nbsp; 8.7 ajustado con HCl. Alicuota a un volumen de un solo uso, congelado y mantenido a -80 &deg;C.</td></tr><tr><td>Láser booster adicional de 640 nm</td><td>Toptica</td><td>IBEAM-SMART-640-S-HP</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 594, NHS ester</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A37572</td><td>Disuelto en DMSO a 1 mM de solución, alícuota a volumen de un solo uso, congelado y mantenido a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647, éster del NHS</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A37573</td><td>Disuelto en DMSO a 1 mM de solución, alícuota a volumen de un solo uso, congelado y mantenido a -80 °C; C</td></tr><tr><td>anti-HA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2-2.2.14</td><td>Monoclonal de ratón, 1:250 (SMLM), 1:1.000 (Microscopía STED)</td></tr><tr><td>anti-HTP-3</td><td>un regalo de Abby F. Dernburg</td><td>MacQueen et al., 2005</td><td>Policlonal de pollo, 1:250 (SMLM), 1:1.000 (Microscopía STED)</td></tr><tr><td>Caenorhabditis elegans cepa&nbsp; YKM349</td><td>un regalo de Yumi Kim</td><td>Hurlock et al., 2020</td><td>syp-5(kim9[syp-5::HA]) I; meIs8[pie-1p::GFP::cosa-1, unc-119(+)] II</td></tr><tr><td>CF6680, NHS éster</td><td>Biotium</td><td>92139</td><td>Disuelto en DMSO a una solución de 1 mM, alícuota a un volumen de un solo uso, congelado y mantenido a -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Cubreobjetos circular 12 mm Nº 1</td><td>Menzel-Gl&auml; ser; VWR</td><td>631-0713</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos circular 24 mm Nº 1,5</td><td>Carl Roth</td><td>PK26.1</td><td></td></tr><tr><td>Lentes cilíndricas</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1516RM-A, LK1002RM-A</td><td></td></tr><tr><td>Egg Buffer (10x)</td><td></td><td>Edgar 1995</td><td>250 mM HEPES, 1,18 M NaCl, 480 mM KCl, 20 mM EDTA, 5 mM EGTA, pH 7,4</td></tr><tr><td>Etanol (absoluto para análisis)</td><td>Merck</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>F(ab')2 fragmentos anti-pollo IgY</td><td>Jackson Immunoresearch AB_2340347</td><td></td><td>Burro policlonal, 1:100 (SMLM), 1:1.000 (Microscopía STED)</td></tr><tr><td>F(ab')2 fragmentos anti-ratón IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>AB_2340761</td><td>Burro policlonal, 1:100 (SMLM), 1:1.000 (Microscopía STED)</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio Fisherbrand T/F Ground 0,8-1,0 mm de espesor</td><td>Fisher scientific</td><td>7107</td><td></td></tr><tr><td>Gauge Worm Pick 30 diámetro 0,254 mm - Iridium 10%</td><td>Kisker</td><td>789265</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de enzimas glucosa oxidasa/catalasa (GlOX/Cat</td>) <td>un regalo de Jonas Ries</td><td>Hoess, Mund, Reitberger y Ries, 2018</td><td>20x, 1916 U/mL glucosa oxidasa (Sigma G7141), 42350 U/mL catalasa (Sigma C3155), 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 51% glicerol, agua MilliQ. Almacenado a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Base de amortiguación de imágenes</td><td>un regalo de Jonas Ries</td><td>Hoess, Mund, Reitberger y Ries, 2018</td><td>50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM NaCl, 10% D-glucosa. Alicuota a un volumen de un solo uso (950 &mu; L), congelado y mantenido a -80 &°C.</td></tr><tr><td>Invitrogen ProLong Glass Montaje Antidecoloración</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>P36982</td><td></td></tr><tr><td>Leica Stellaris 8 STED FALCON</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td>El microscopio está equipado con la última generación de láser de luz blanca, un láser STED pulsado de 775 nm, el módulo FALCON Fluorescence Lifetime IMaging, Objetivo de aceite HC PL APO CS2 100x/1.40 y detector Leica HyD X. El sistema es capaz de aumentar el módulo FLIM Tau-STED que mide la vida útil de fluorescencia específica de un colorante y, por lo tanto, es capaz de eliminar la señal de fondo en función de las diferencias en la vida útil de fluorescencia de los tintes y las condiciones del tinte en la muestra. Además, la resolución se incrementa al tener en cuenta la variación de los tiempos de vida de la fluorescencia en diferentes áreas de la rosquilla de agotamiento.</td></tr><tr><td>Filtro de emisión de canal de onda larga</td><td>AHF Analysentechnik</td><td>F47-702</td><td>Paso de banda de 700/100 nm</td></tr><tr><td>Metanol (absoluto para análisis)</td><td>Merck</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>S5761-500G</td><td>100 mM NaHCO3, pH 8,3</td></tr><tr><td>Láser acoplado a fibra de infrarrojo cercano</td><td>Toptica</td><td>IBEAM-SMART-PT-CD</td><td>Diseño personalizado, 808 nm - 75mW</td></tr><tr><td>Objetivo lente piezo montura (PIFOC )</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-726.1.CD</td><td>100 &micro; Rango de recorrido</td></tr><tr><td>Orca Fusion BT Cámara sCMOS</td><td>Hamamatsu</td><td>C15440-20UP</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de PCR</td><td>Greiner Bio-One</td><td>673283</td><td>0,2 mL</td></tr><tr><td>Tampón salino de fosfato (PBS 10x)</td><td></td><td>N/A</td><td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4</td></tr><tr><td>Pierce 16% formaldehído (p/v), sin metanol</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>28906</td><td>16% formaldehído se transfiere de la ampolla de vidrio original a un tubo de 1,5 mL y se mantiene a temperatura ambiente.</td></tr>La solución de <tr><td>hidrobromuro de poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>P2636-25MG</td><td>al 0,1% p/v se preparó en agua Milli-Q y se almacenó en alícuotas a -20 °C.</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primario dicroico (reflector de iluminación)</td><td>AHF Analysentechnik</td><td>F73-866S</td> paso <td>de banda cuádruple @ 405, 488, 561, 640</td></tr><tr><td>Filtro de cuatro muescas</td><td>AHF Analysentechnik</td><td>F40-072</td><td>405/488/561/640 nm</td></tr><tr><td>Fotodiodo de cuadrante (QPD)</td><td>Componentes láser</td><td>SD197-23-21-041, LC301DQD-PV</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de afeitar</td><td>Apollo Herkenrath Solinger</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>El conformador de haz refractivo</td><td>AdlOptica</td><td>PiShaper 6_6_VIS</td><td></td></tr><tr><td>el reactivo de bloqueo Roche</td><td></td><td>11096176001</td> solución <td>10x se preparó de acuerdo con la recomendación. Las alícuotas congeladas se almacenaron a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Hoja de bisturí (Marca de plumas #11, n.º 3)</td><td>Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH</td><td>1110911</td><td></td></tr><tr><td>Caja de extracción de bisturí</td><td>Fisher scientific</td><td>10002-50</td><td></td></tr><tr><td>Dicroico secundario (reflectante de emisiones)</td><td>AHF Analysentechnik</td><td>F38-785S</td><td>750 nm</td></tr><tr><td>paso largo Filtro de paso corto</td><td>Semrock</td><td>BSP01-785R-25</td><td>&nbsp; </td></tr><tr><td>Filtro de emisión de canal de onda corta</td> de 750 nm <td>AHF Analysentechnik</td><td>F37-677</td><td>&nbsp; Paso de banda de 676/37 nm</td></tr><tr><td>Microscopio de localización de molécula única</td><td>EMBL Imaging Centre</td><td>Diekmann et al., 2020 con modificaciones</td><td>El microscopio proporciona epiiluminación de campo amplio a través de un motor láser monomodo acoplado a fibra, láser de refuerzo adicional y moldeador de haz de refracción para proporcionar un campo de iluminación uniforme (Stehr et al, 2019). Las imágenes de campo amplio se capturan en una cámara sCMOS&nbsp; y óptica de relé apropiada para un aumento del sistema de 61x y un tamaño de píxel de 106 nm. Para la obtención de imágenes radiométricas de tintes rojos lejanos superpuestos espectralmente, un divisor de imagen produce dos imágenes espectralmente distintas en la cámara (dicroica de división: paso largo de 665 nm, filtro de emisión de canal de onda corta: paso de banda de 676/37 nm, filtro de emisión de onda larga: paso de banda de 700/100 nm. Un filtro cuádruple adicional de 405/488/561/640 nm y un filtro de paso corto de 750 nm son comunes a las dos rutas y proporcionan un bloqueo láser adicional). Una lente cilíndrica compuesta proporciona el astigmatismo necesario para las imágenes 3D. Para mantener un enfoque fijo en las adquisiciones que superan las 2 horas en el tiempo (que comprenden 200 000 - 250 000 imágenes), El bloqueo del enfoque se logra mediante la reflexión interna total de un láser acoplado a fibra de infrarrojo cercano&nbsp; del cubreobjetos y la posterior detección sensible a la altura en un fotodiodo de cuadrante (QPD). La señal QPD proporcionó un control de circuito cerrado de la montura piezoeléctrica de la lente del objetivo. Para acceder a este microscopio, consulte https://www.embl.org/about/info/imaging-centre o póngase en contacto con ic-contact@embl.de</td></tr><tr><td>Motor multiláser monomodo acoplado a fibra</td><td>Toptica</td><td>iCHROME MLE-LFA-HP</td><td>Proporciona una epiiluminación de campo amplio de 100 mW a 405, 488, 561, 640 nm</td></tr><tr><td>Análisis, dicroico</td>, <td>AHF</td>, <td>F48-665SG</td><td>665 nm paso largo</td></tr><tr><td>Cubreobjetos cuadrado 22 x 22 mm n.º 1</td><td>Menzel-Gl&auml; ser; VWR</td><td>630-2882</td><td></td></tr><tr><td>STAR 635P, NHS ester</td><td>Abberior</td><td>ST635P-0002-1MG</td><td>Disuelto en DMSO a 1 mM de solución, alícuota a volumen de un solo uso, congelado y mantenido a -80 °C; C</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico Stemi 305 Stand K LAB</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>La solución de clorhidrato de tetramisol</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>T1512-2G</td> al <td>1% (p/v) se preparó en agua Milli-Q. Las alícuotas congeladas se almacenaron a -20 &deg;C. Las alícuotas descongeladas se mantuvieron a 4 &deg; C y se utiliza durante varios meses.</td></tr><tr><td>Microesferas TetraSpeck</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>T7279</td><td>&nbsp; 0,1 y micro; m, azul fluorescente/verde/naranja/rojo oscuro</td></tr><tr><td>Tampón salino Tris (TBS 10x)</td><td></td><td>N/A</td><td>200 mM Tris-HCl, 1,5 M NaCl, pH 7,5</td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>P9416-50ML</td><td>Conservado a temperatura ambiente en su embalaje original.</td></tr><tr><td>WormStuff súbilo de gusano</td><td>Kisker</td><td>789277</td><td></td></tr><tr><td>platina de microscopio XY</td><td>&nbsp; Smaract</td><td>N/A</td><td>Diseño Personalizado</td></tr><tr><td>Zeba Micro Columna Desalinizadora de Centrifugación</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>89877</td><td>&nbsp; 7K MWCO, 75 y micro; L</td></tr></tbody></table>

microscopía de superresolución del complejo sinaptonémico dentro de la línea germinal caenorhabditis elegans

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Durante la meiosis, los cromosomas homólogos deben reconocerse y adherirse entre sí para permitir su correcta segregación. Uno de los eventos clave que asegura la interacción de cromosomas homólogos es el ensamblaje del complejo sinaptonémico (SC) en la profase meiótica I. A pesar de que hay poca homología de secuencia entre los componentes proteicos dentro del SC entre diferentes especies, la estructura general del SC ha sido altamente conservada durante la evolución. En las micrografías electrónicas, el SC aparece como una estructura tripartita, similar a una escalera, compuesta de elementos o ejes laterales, filamentos transversales y un elemento central. 
Sin embargo, la identificación precisa de la localización de componentes individuales dentro del complejo por microscopía electrónica para determinar la estructura molecular del SC sigue siendo un desafío. Por el contrario, la microscopía de fluorescencia permite la identificación de componentes proteicos individuales dentro del complejo. Sin embargo, dado que el SC tiene solo ~ 100 nm de ancho, su subestructura no puede resolverse mediante microscopía de fluorescencia convencional limitada por difracción. Por lo tanto, la determinación de la arquitectura molecular del SC requiere técnicas de microscopía óptica de súper resolución, como la microscopía de iluminación estructurada (SIM), la microscopía de agotamiento por emisión estimulada (STED) o la microscopía de localización de molécula única (SMLM). 
Para mantener la estructura y las interacciones de los componentes individuales dentro del SC, es importante observar el complejo en un entorno cercano a su entorno nativo en las células germinales. Por lo tanto, demostramos un protocolo de inmunohistoquímica e imagen que permite el estudio de la subestructura del SC en tejido germinal intacto, extruido de Caenorhabditis elegans con microscopía SMLM y STED. La fijación directa del tejido al cubreobjetos reduce el movimiento de las muestras durante la obtención de imágenes y minimiza las aberraciones en la muestra para lograr la alta resolución necesaria para visualizar la subestructura del SC en su contexto biológico.

Para obtener imágenes del SC dentro del tejido de la línea germinal de C. elegans por SMLM, hemos empleado 3D-SMLM ratiométrico de 2 colores para localizar HTP-3, un componente de los ejes cromosómicos, y el extremo C del filamento transversal SYP-5 marcado endógenamente con una etiqueta de hemaglutinina (HA). La localización de ambas proteínas dentro del SC de C. elegans fue previamente determinada por otros estudios16,30.
Para minimizar la dispersión de la luz y las aberraciones ópticas inherentes a las muestras biológicas gruesas, obtuvimos imágenes de la sección z más inferior de los núcleos meióticos que contienen los SC (Figura 3, líneas amarillas). Para cada imagen adquirida, la posición de la etapa piezoeléctrica del plano de imagen se marcó en relación con la posición de la etapa piezoeléctrica cuando el objetivo se centró en el cubreobjetos. Esto permitió el cálculo de la distancia piezoeléctrica desde el cubreobjetos. Las muestras montadas con éxito se fijan de manera estable cerca del cubreobjetos y conservan la forma de la gónada (es decir, el tejido no se aplasta entre los dos cubreobjetos durante el paso posterior a la fijación). La calidad del montaje de la muestra puede evaluarse fácilmente bajo un microscopio estereoscópico, ya que las gónadas bien unidas no muestran ningún movimiento en la solución (paso 4.2.6). Sin embargo, debido a la estocasticidad del proceso de montaje, el tejido de la gónada no necesariamente se colocará completamente plano sobre el cubreobjetos. Por lo tanto, el plano inferior de los núcleos que contienen SC se puede encontrar a distancias variables en relación con el cubreobjetos dentro de la misma gónada.
Para ilustrar cómo cambia la resolución dependiendo de la unión del tejido al cubreobjetos, adquirimos imágenes a diferentes distancias piezoeléctricas al cubreobjetos. Para evaluar la calidad de una imagen individual, se calcularon las curvas de correlación de anillo de Fourier (FRC)50,51 y la resolución se determinó utilizando el complemento FRCResolution dentro del software SMAP48. En la Figura 4 se muestran dos núcleos representativos extraídos de dos imágenes 3D-SMLM separadas tomadas a diferentes distancias del cubreobjetos. En los SC situados cerca del cubreobjetos, los ejes cromosómicos y el extremo C de SYP-5::HA están bien resueltos en las tres dimensiones (Figura 4A, 0,8 μm del cubreobjetos). Para resolver dos estructuras separadas por una distancia dada, la resolución FRC alcanzada generalmente debe ser menor que la mitad de esta distancia en la resolución axial.
Para separar lateralmente las mismas estructuras, es necesario alcanzar valores de resolución FRC aún más pequeños. De hecho, en muestras que se encuentran muy cerca del cubreobjetos, la resolución FRC es de 38 nm para el canal AlexaFluor 647 y 34 nm para el canal CF680, y por lo tanto muy por debajo de la distancia esperada de 84 nm entre los C-termini de SYP-516. Por lo tanto, esta resolución resuelve fácilmente la organización del SC no sólo en vistas frontales sino también laterales (Figura 4B i,ii). Por el contrario, la resolución se deteriora en los SC ubicados a una distancia de 5 μm del cubreobjetos debido a la dispersión de la luz y las aberraciones esféricas (Figura 4B). Las resoluciones FRC a esta distancia caen a 47 nm (AlexaFluor 647) y 41 nm (CF680), que no pueden resolver completamente los extremos C de SYP-5. Dado que las aberraciones ópticas perjudican la resolución lateral más severamente que la resolución axial, las bandas HTP-3 y SYP-5 ya no se resuelven claramente en la sección transversal de la vista lateral en muestras ubicadas a una distancia de 5 μm del cubreobjetos (Figura 4B ii). La comparación de la resolución FRC de las imágenes adquiridas a diferentes distancias piezoeléctricas del cubreobjetos reveló que el tejido fotografiado no debería estar a más de 2 μm del cubreobjetos (Figura 5). Este resultado resalta la importancia de la ejecución correcta de la etapa posterior a la fijación, durante la cual el tejido debe ser reticulado con éxito al recubrimiento de poli-L-lisina del cubreobjetos.
Para demostrar la resolución alcanzable con otra técnica de súper resolución, también tomamos imágenes de SC en tejido germinal intacto fijo con microscopía TauSTED. La Figura 6A muestra imágenes TauSTED con la resolución más alta y más baja alcanzada dentro de este estudio según lo estimado a partir de perfiles de línea del SC en vista frontal (Figura 6B). En ambos núcleos, podríamos resolver las dos bandas de localización de HTP-3 en los ejes cromosómicos y los C-terminales de SYP-5 en la región central, demostrando que la resolución alcanzable en TauSTED utilizando este protocolo optimizado es inferior a 84 nm. En condiciones óptimas (Figura 6A, arriba), pudimos resolver los extremos C en vistas ligeramente inclinadas del SC que estaban separadas por solo 50 nm (Figura 6A, rectángulo amarillo y 6C).
<img alt="Diagrama de estructura cromosómica homóloga; vistas frontales, laterales, transversales; filamentos transversales." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Esquema de la organización del complejo sinaptonémico en Caenorhabditis elegans. La caricatura muestra una estructura simplificada del SC en C. elegans uniendo dos cromosomas homólogos (gris). La estructura se muestra en vistas frontales, laterales y transversales. Los ejes cromosómicos se muestran como barras rojas, mientras que los filamentos transversales se muestran en cian. Las proteínas de filamentos transversales (SYP-1, 5, 6 en C. elegans) están orientadas de manera cabeza a cabeza (gráficos de bola cian) en la región central para salvar la distancia entre los dos ejes. Se indican las distancias esperadas entre los ejes y los extremos C de los filamentos transversales. Abreviatura: SC = complejo sinaptonémico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Método de disección y fijación de C. elegans, diagrama; preparación de microscopía para imágenes STED y SMLM." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Ilustración de la preparación de la muestra utilizada en el estudio. (A) Los adultos jóvenes de C. elegans se diseccionan en la cabeza o la cola (líneas verdes y discontinuas) y se procesan como se describe en el protocolo. (B) Los pasos individuales del método se indican con gráficos que están conectados con flechas grises. Abreviaturas: STED = agotamiento de emisiones estimuladas; SMLM = microscopía de localización de molécula única; PBS = solución salina tamponada con fosfato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Imagen de microscopía de fluorescencia; proteínas HTP-3, SYP-5: HA; Análisis de sección transversal de tejido biológico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Ubicación de la sección de tejido que se puede observar mediante microscopía de localización de molécula única. MIP de una imagen confocal de disco giratorio de una gónada completa de C. elegans. El tejido se tiñó para HTP-3 y el extremo C de SYP-5 (SYP-5::HA), y la señal combinada se muestra en gris. Las imágenes confocales individuales se unieron utilizando el plugin Grid/Collection stitching Fiji52 para crear una imagen de toda la gónada. El recuadro muestra una vista xy del plano z inferior que contiene los SC. La localización de este plano se muestra en vistas ortogonales de la sección de tejido indicada por un rectángulo en la imagen MIP de la gónada (líneas amarillas). Barras de escala = 10 μm. Abreviaturas: MIP = proyección de intensidad máxima; SCs = complejos sinaptonemales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Diagrama de microscopía confocal de distribución de proteínas sinápticas; Vistas a una distancia de 0,8 μm y 5,0 μm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: Microscopía de localización de molécula única de HTP-3 y los C-terminales del SYP-5. (A,B) Izquierda: Imágenes SMLM que muestran núcleos de paquiteno teñidos para HTP-3 (rojo) y el extremo C de SYP-5 (SYP-5::HA, cian) (barra de escala = 1 μm). Centro: Imágenes ampliadas de regiones de interés que se indican en A y B con las correspondientes vistas transversales que se muestran debajo de cada imagen (i, ii; barra de escala = 100 nm). Los tramos del SC dentro de las imágenes ampliadas se giran para orientar los ejes cromosómicos paralelos al eje y. Derecha: Representación gráfica de la localización de las proteínas de interés dentro del SC retratando la orientación del SC en las regiones ampliadas que se muestran en el centro de la figura. Abreviaturas: SMLM = microscopía de localización de molécula única; SC = complejo sinaptonémico. Los datos brutos para reconstruir imágenes SMLM están disponibles a través de la base de datos BioStudies60 (ID de acceso: S-BIAD504). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Gráfico de contraste de resolución de fluoróforo (FRC) de AlexaFluor647 y CF680 con análisis de frecuencia espacial." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5: La resolución de correlación de anillo de Fourier de las imágenes de microscopía de localización de molécula única depende de la distancia del plano z fotografiado desde el plano del cubreobjetos. Las líneas de color muestran curvas FRC de imágenes adquiridas a diferentes distancias (como se muestra en la barra de color) desde el cubreobjetos. El umbral de 1/7 utilizado para determinar la resolución FRC se indica mediante una línea horizontal negra. Los recuadros muestran la dependencia de la resolución FRC en la distancia piezoeléctrica desde el cubreobjetos. El trazado se realizó mediante un script R escrito a medida (versión 4.1.2, Archivo Suplementario 1) en el que las curvas originales se suavizaron con funciones del paquete "ggplot2". Abreviaturas: FRC = correlación de anillo de Fourier; SMLM = microscopía de localización de molécula única; SC = complejo sinaptonémico. Los datos para las curvas FRC y los datos SMLM están disponibles a través de la base de datos BioStudies60 (ID de acceso: S-BIAD504). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Microscopía de superresolución de localización de proteínas; Microscopía de fluorescencia, tabla de perfil de intensidad." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64363/64363fig06.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Figura 6: La microscopía de agotamiento de emisión estimulada mejorada por información basada en la vida útil de fluorescencia (TauSTED) resuelve dos bandas de localización tanto para HTP-3 como para el extremo C de SYP-5. (A) Dos imágenes representativas de TauSTED muestran núcleos de paquiteno teñidos para HTP-3 (rojo) y el extremo C de SYP-5 (SYP-5::HA, cian) con definición estructural más alta (arriba) e inferior (abajo) (barra de escala = 1 μm). Los rectángulos marcan regiones con los extremos C resueltos de SYP-5 en frontal (blanco) y una vista ligeramente inclinada (amarillo) del SC. (B,C) Distribución de la señal HTP-3 (rojo) y C-terminal de SYP-5 (cian) resuelta por TauSTED. Los perfiles de línea de las regiones de interés que contienen el SC en vistas frontales (B) o ligeramente inclinadas (C) se muestran como líneas completas con intensidad normalizada al valor máximo. Los perfiles de línea se generaron utilizando Fiji ImageJ. Las líneas discontinuas en B muestran los datos promediados para cada proteína. La línea cian gruesa en C corresponde al perfil de línea con la distancia resuelta más corta entre los C-terminales de SYP-5. Para determinar las distancias entre los anticuerpos dirigidos a proteínas específicas, los perfiles de línea (n = 9 (B), n = 7 (C)) se ajustaron con gaussianos dobles utilizando un script R escrito a medida (versión 4.1.2, Archivo Suplementario 1). La distancia media ± la desviación estándar (B) y el rango con el valor mínimo resaltado en negrita (C) se indican en la parte superior de cada gráfico, respectivamente. Abreviaturas: STED = microscopía de agotamiento por emisión estimulada; SC = complejo sinaptonémico. Las imágenes mostradas y los puntos de datos de los perfiles de líneas trazadas están disponibles a través de la base de datos BioStudies60 (ID de acceso: S-BIAD504). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/64363fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Composición de tampones y soluciones utilizadas en este protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/63463_Table%201%20(1).xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Video complementario 1: Adquisición de microscopía de localización de molécula única. Video que muestra fluoróforos parpadeando a una velocidad adecuada (se muestran 50 cuadros, barra de escala = 5 μm, 20 ms / cuadro). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/SupplementalVideo1.mov" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
Archivo complementario 1: Script de análisis de datos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64363/SupplementalFile1.Rmd" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

La microscopía de superresolución puede proporcionar una visión detallada de la organización de los componentes dentro del complejo sinaptonémico en la meiosis. Aquí, demostramos un protocolo para resolver proteínas individuales del complejo sinaptonémico Caenorhabditis elegans .

Microscopía de superresolución del complejo sinaptonémico dentro de la línea germinal Caenorhabditis elegans

During meiosis, homologous chromosomes must recognize and adhere to one another to allow for their correct segregation. One of the key events that secures ...

El complejo sinaptonémico es un componente clave para la meiosis. Para estudiar su función, también debemos entender su estructura para la cual la microscopía de súper resolución ha resultado ser increíblemente útil. Hemos optimizado nuestro protocolo para unir de forma estable la gónada C.elegans inmunoteñida a un cubreobjetos que ayuda a mejorar la resolución hasta 30 nanómetros en tejidos intactos.El diseño de experimentos de microscopía de localización de moléculas individuales, el análisis posterior y también la interpretación de los datos pueden ser bastante desafiantes y deberían configurarse mejor junto con un experto. Demostrando el procedimiento estará Ivana Cavka, becaria predoctoral en el laboratorio. La adquisición de las imágenes de microscopía de localización de molécula única también será mostrada por Rory Power, un ingeniero óptico en el MBL Imaging Center.Comience recogiendo gusanos Caenorhabditis elegans de las placas de agar NGM. Transfiera los gusanos a una gota de 30 microlitros de EBTT en un cubreobjetos. Lave los gusanos con 30 microlitros adicionales de EBTT.Retire 30 microlitros de la solución dejando una gota de 30 microlitros con los gusanos en el cubreobjetos. Use una hoja de bisturí para cortar las cabezas de los gusanos y / o las colas para extruir la gónada. En una disección exitosa, el tejido de las gónadas se extruirá completamente fuera del cuerpo del gusano.Pipetear 30 microlitros de la solución fijadora en la gota de los gusanos disecados. Mezclar por pipeteo y dejar las muestras para fijar durante un minuto. Detenga la fijación exactamente después de un minuto transfiriendo los gusanos usando una pipeta de 20 microlitros a un tubo de PCR lleno de TBST.Luego realice un lavado girando las muestras diseccionadas en una mini centrífuga de sobremesa. Una vez que se retire el sobrenadante, vuelva a suspender los gusanos en 200 microlitros de TBST fresco. Después del lavado final, resuspender los gusanos en 200 microlitros de PBST y colocar el tubo de PCR en hielo.Gire las muestras diseccionadas en una mini centrífuga de sobremesa y retire el sobrenadante. Agregue de 50 a 100 microlitros de metanol frío, mezcle por pipeteo y deje las muestras en metanol durante 30 a 60 segundos en hielo. Lave las muestras dos veces con 200 microlitros de PBST.Después de girar las muestras y retirar el sobrenadante, agregue la solución de bloqueo a las muestras y manténgala a temperatura ambiente durante 45 a 60 minutos. Diluir los anticuerpos primarios contra las soluciones de trabajo en el tampón de bloqueo. Gire las muestras en una mini centrífuga de sobremesa, retire la solución de bloqueo y agregue de 30 a 50 microlitros de la solución de anticuerpos primarios.Incubar durante la noche a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación, lavar las muestras tres veces en PBST. Diluya los dos fragmentos de Fab Prime etiquetados en las soluciones de trabajo en el búfer de bloqueo.Después del tercer lavado, gire las muestras hacia abajo, retire el sobrenadante y agregue de 30 a 50 microlitros de la solución de anticuerpos secundarios. Coloque la muestra en una cámara oscura e incube durante 30 minutos a dos horas a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados centígrados. Luego lave las muestras tres veces con PBST durante cinco a 15 minutos.Gire las muestras manchadas y retire el sobrenadante. Agregue 50 microlitros de PBST y transfiera los gusanos manchados a un cubreobjetos. Pipetear de 5,7 a 6,3 microlitros de la solución postfijadora sobre un cubreobjetos de poli-l-lycine.Pipetear los gusanos disecados en el mismo volumen y transferirlos a la gota de fijador en el cubreobjetos de poli-l-lisina. Cubra la muestra con un pequeño cubreobjetos. Retire el exceso de líquido con un pequeño trozo de papel de filtro y fije la muestra durante tres a cinco minutos en una cámara oscura.Congele las muestras colocándolas en un bloque de aluminio en hielo seco. Después de al menos 20 minutos, retire el cubreobjetos más pequeño con una maquinilla de afeitar. Sumerja el cubreobjetos en un tubo cónico de 50 mililitros que contenga PBS helado o metanol enfriado a menos 20 grados centígrados durante aproximadamente 10 segundos.Coloque el cubreobjetos en un pocillo de una placa de seis pocillos llena de tampón PBST. Retire el PBST del pozo, agregue PBST fresco y deje la muestra durante cinco minutos. Después de lavar con PBST una vez más, deje las muestras a cuatro grados centígrados hasta que se obtengan imágenes.Antes de obtener imágenes, evalúe la calidad del montaje de la muestra bajo un microscopio estéreo. Si utiliza el portamuestras hecho a medida que se muestra aquí, envuelva el anillo magnético con parafilm y luego prepare un mililitro de tampón de imágenes. Tome un cubreobjetos de la placa de seis pocillos.Colóquelo en el soporte hecho a medida y fije el cubreobjetos en el soporte con el anillo magnético envuelto en parafilm. Pipetear suavemente el tampón de imágenes en la cámara creado por el anillo magnético en la parte superior de la muestra y sellar la cámara con parafilm. Para montar la muestra, agregue una gota de aceite de inmersión al objetivo de aceite limpio.Sin introducir aire en el aceite de inmersión, coloque suavemente el portamuestras con la muestra montada en la platina del microscopio. Con la ventana del plug-in EMU de MicroManager 2, mueva la etapa piezoeléctrica hasta que se detecte la señal del láser de bloqueo de enfoque en el fotodiodo del cuadrante. Adquiera una imagen de plano focal posterior a menor potencia con un láser a 640 nanómetros de excitación para confirmar la ausencia de burbujas de aire en el aceite de inmersión.Localice el tejido de la gónada utilizando la iluminación de campo claro. Usando una iluminación de baja intensidad a 640 nanómetros, concéntrese en la sección de tejido que contiene muchos complejos sinaptonemales. Proceda a exponer la muestra a alta irradiancia con iluminación a 640 nanómetros durante aproximadamente 30 segundos hasta que se logre una velocidad de parpadeo adecuada.Adquiera 200.000 fotogramas con un tiempo de exposición de 20 milisegundos utilizando la herramienta de adquisición multidimensional de MicroManager 2. Mientras tanto, configure la activación UV utilizando la opción de activación del complemento EMU para mantener la velocidad de parpadeo deseada. El plano inferior de los núcleos meióticos que contienen complejos sinaptonemales se visualizó dentro de una gónada de Caenorhabditis elegans utilizando tinción HTP-3 y SYP-5.Los ejes cromosómicos en el extremo C de SYP-5 HA estaban bien resueltos en las tres dimensiones en complejos sinaptonemales ubicados cerca del cubreobjetos. Sin embargo, la resolución se deteriora en complejos sinaptonemales ubicados a una distancia de cinco micrómetros del cubreobjetos debido a la dispersión de la luz y las aberraciones esféricas. Las imágenes adquiridas a diferentes distancias piezoeléctricas del cubreobjetos revelaron que el tejido fotografiado no debería estar a más de dos micrómetros del cubreobjetos.El protocolo de preparación de muestras también se puede utilizar con microscopía TauSTED. Con la preparación optimizada de la muestra, HTP-3 en los ejes cromosómicos y los C-terminales de SYP-5 en la región central se resolvieron en vista frontal y vista ligeramente inclinada. Para obtener la mejor resolución, las gónadas deben estar reticuladas firmemente al cubreobjetos para garantizar que los complejos sinaptonemales no estén a más de dos micrómetros del cubreobjetos.Utilizamos este protocolo no solo para microscopía de localización de moléculas individuales, sino también para microscopía de agotamiento por emisión estimulada. También puede ser útil para otras técnicas de microscopía de súper resolución.

super-resolution-microscopy-synaptonemal-complex-within

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este artículo se describe una técnica para la visualización de los primeros eventos de la embriogénesis en el...

Time-lapse microscopía de embriogénesis temprana en Caenorhabditis elegans

Este protocolo describe cómo reproducir la división de células dentro de un tejido en Caenorhabditis elegans embriones. Mientras que varios protocolos describen cómo la división celular imagen en el embrión temprano, este protocolo se describe cómo la imagen de la división celular dentro de un tejido en desarrollo durante la embriogénesis tardía mediados.

Visualizar Neuroblast Citocinesis Durante<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriogénesis

La imagen del comportamiento y la actividad neuronal a largas escalas de tiempo sin inmovilización del animal es un requisito previo para comprender el comportamiento. Las imágenes de cámaras microfluídicas de agarosa (AMI) se pueden utilizar para obtener imágenes de la actividad y el comportamiento neuronal de todas las etapas de la vida de Caenorhabditis elegans.

Microcámaras de agarosa para Imagen de calcio a largo plazo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Presentamos un método automatizado para la reconstrucción tridimensional de lo elegans de Caenorhabditis del germline. Nuestro método determina el número y la posición de cada núcleo dentro de la línea germinal y análisis del germline proteínas distribución y estructura citoesquelética.

Análisis computacional de lo elegans de Caenorhabditis del Germline para estudiar la distribución de núcleos, proteínas y citoesqueleto

Aquí, presentamos un enfoque combinatorio usando microscopía de alta resolución, herramientas computacionales y etiquetado de una sola célula en los embriones vivos de C. elegans para entender la dinámica de una sola célula durante el neurodesarrollo.

Microscopía de lámina de luz isotrópica y análisis de linaje celular automatizado para catalogar Caenorhabditis elegans embriogénesis con resolución subcelular

Este estudio describe las mediciones cuantitativas del tamaño y localización sináptica, la morfología muscular y la forma mitocondrial en C. elegans utilizando herramientas de procesamiento de imágenes disponibles libremente. Este enfoque permite que estudios futuros en C. elegans comparen cuantitativamente la extensión de los cambios estructurales de tejidos y orgásis como resultado de mutaciones genéticas.

Enfoques cuantitativos para el estudio de las estructuras celulares y la morfología de los organélilos en Los cenoheman

Este trabajo describe un protocolo de semi-alto rendimiento que permite imágenes simultáneas de lapso de tiempo 3D de embriogénesis en embriones de 80-100 C. elegans en una sola carrera nocturna. Además, se incluyen herramientas de visualización y procesamiento de imágenes para agilizar el análisis de datos. La combinación de estos métodos con cepas de reportero personalizadas permite un seguimiento detallado de la embriogénesis.

Un método de imágenes de semi-alto rendimiento y un kit de herramientas de visualización de datos para analizar el desarrollo embrionario de C. elegans

Aquí, presentamos un protocolo para preparar y montar embriones de Caenorhabditis elegans , registrar el desarrollo bajo un microscopio 4D y rastrear el linaje celular.

Microscopía 4D: Desentrañando el desarrollo embrionario de Caenorhabditis elegans usando Microscopía Nomarski

Este es un método comúnmente utilizado para la disección de gónadas de C. elegans seguida de grieta por congelación, que produce muestras de línea germinal para inmunofluorescencia a través de tinción de anticuerpos, o para tinción DAPI simple para visualizar el ADN. Este protocolo ha sido exitoso para los estudiantes universitarios en un laboratorio de investigación y en una experiencia de investigación de pregrado basada en cursos.

C. elegans Disección de gónadas y grieta por congelación para inmunofluorescencia y tinción DAPI

Aquí, se presenta un protocolo para la implementación de microscopía de expansión en embriones tempranos de Drosophila para lograr imágenes de superresolución utilizando un microscopio confocal convencional de barrido láser.

Uso de microscopía de expansión para agrandar físicamente embriones de Drosophila de montaje completo para obtener imágenes de superresolución

Este protocolo describe la obtención de imágenes de lapso de tiempo de C. elegans basadas en microfluidos a lo largo de todo el desarrollo postembrionario.

Imágenes de alta resolución de C. elegans en todas las etapas larvales

Aprende microscopía de superresolución del complejo sinaptonémico en Caenorhabditis elegans usando inmunotinción y localización de moléculas individuales. Este protocolo alcanza 30 nanómetros de resolución en tejidos intactos.

Microscopía de superresolución del complejo sinaptonémico dentro de la línea germinal Caenorhabditis elegans

Explorar más videos