Abordaje de cuestiones prácticas en la microindentación basada en microscopía de fuerza atómica en explantes de cartílago articular humano

El objetivo de este protocolo fue crear un modelo in vitro para estudiar las propiedades mecánicas del cartílago articular durante el inicio y la progresión de la artrosis. La principal ventaja de la presente técnica es que los explantes de cartílago son fáciles de generar y altamente representativos del cartílago de la edad nativa. Este modelo se puede utilizar para analizar y monitorizar diversos enfoques de artrosis, diagnósticos y terapéuticos a nivel biomecánico.

Para empezar, corta el cartílago del hueso con un bisturí. Con un punzón de biopsia, genere discos de cuatro milímetros de diámetro. Coloque el disco en un dispositivo de corte hecho a medida.

Con una espátula, fije y estabilice el disco cartilaginoso. Corta el disco cartilaginoso con una cuchilla de afeitar. Con una espátula, recoge el disco y colócalo en un tubo de 1,5 mililitros.

Para permanecer en las muestras de cartílago, agregue 130 microlitros de tinte de fluorescencia permeable a las células a cada pocillo de la placa de 96 pocillos y distribuya el disco en la placa como un disco por pocillo. Coloque la placa de 96 pocillos en el soporte de placas del microscopio de fluorescencia. Seleccione el filtro de fluorescencia adecuado y el objetivo.

Coloque el objetivo debajo del pocillo preseleccionado que contiene cartílago individual. Concéntrese en el disco para ver el patrón celular. Seleccione la función de navegador para obtener una visión general de todo el pozo.

Utilice el botón izquierdo del ratón y arrástrelo para navegar a una posición de escenario diferente. Seleccione un cuadrado que abarque el área de interés que se va a escanear. Seleccione la opción de punto de mapa de enfoque del software y luego seleccione cada mosaico individual haciendo clic izquierdo en el centro del mismo.

Seleccione la opción mapa de enfoque en la ventana que aparece con todos los mosaicos seleccionados anteriormente. Haga doble clic en un mosaico para mostrarlo y enfocarlo correctamente. A continuación, haga clic en establecer Z para guardar el plan focal y continúe con el siguiente mosaico.

Después de ajustar el plan focal para cada mosaico individual, comience la adquisición de imágenes presionando iniciar escaneo. Fije cada disco de cartílago preseleccionado que contenga un patrón celular en placas de Petri agregando suficiente pegamento biocompatible en los lados superior, inferior, izquierdo y derecho del disco. Cubrir los discos con 2,5 mililitros de medio Leibovitz sin L-glutamina.

Coloque la placa de Petri en el portamuestras de los dispositivos AFM. Para calibrar el voladizo AFM, colóquelo en la superficie del voladizo del bloque de vidrio de modo que descanse sobre el plano óptico pulido en el centro del bloque de vidrio. Baje el voladizo en pasos de 100 micrómetros utilizando la función de motor paso a paso hasta que esté completamente sumergido en el medio.

Para identificar el sitio de medición de cartílago deseado, inicie un enfoque de escáner con el voladizo en un área limpia libre de muestras de la placa de Petri. A continuación, retraiga el voladizo a 1,5 milímetros de distancia de la parte inferior de la placa. Cambie de la vista de campo claro a la de fluorescencia e identifique visualmente la parte superior del disco.

Mueva el portamuestras AFM exactamente dos milímetros hacia el centro del disco. Ejecute un enfoque de escáner para llegar a la superficie del disco de cartílago y retraer el voladizo 100 micrómetros. Para generar una curva de fuerza-distancia, concéntrese en las celdas colocadas en el sitio de medición deseado.

Haga clic en el botón Ejecutar para iniciar las mediciones y adquirir cinco curvas de fuerza-distancia en cada sitio de medición. Guarde las curvas una vez inspeccionadas. Para estimar los módulos de Young, utilizando la opción abrir un lote de curvas de espectroscopia, abra las curvas de fuerza-distancia generadas para ser analizadas.

Seleccione el modelo de ajuste de Hertz seguido de la opción de ajuste de elasticidad. A continuación, visualiza y documenta el módulo de Young. Adáptese utilizando la relación de poisson de 0,5 y el radio de punta en voladizo adecuado.

A continuación, compruebe visualmente el ajuste de la curva fuerza-distancia para garantizar su corrección. Para determinar la profundidad de indentación, abra cada una de las curvas de fuerza-distancia generadas en el software de análisis de datos y seleccione el modelo de ajuste de Hertz como proceso de análisis. Aplique la opción restar desplazamiento de línea base a poner a cero el eje de deflexión vertical y seleccione la función de desplazamiento más inclinación.

Utilice la función de búsqueda de punto de contacto para identificar automáticamente el punto de contacto. Usando la función de posición de punta vertical, reste la distancia teniendo en cuenta únicamente la deflexión en voladizo de la altura piezoeléctrica bruta durante la indentación. Seleccione la opción de ajuste de elasticidad para mostrar la curva de fuerza-distancia procesada.

A continuación, seleccione el área del gráfico para que se alinee con el valor más negativo en el eje de posición vertical de la punta. En la pestaña de parámetros del cuadro XMIN, lea y documente la sangría. Los discos que contenían cuerdas simples mostraron valores de rigidez más altos con una mediana de 2,6 kilos pascales, que es representativa de áreas de cartílago sanas y sin compromisos.

Con el inicio y la progresión de la osteoartritis, las mediciones de AFM mostraron una fuerte disminución gradual de la rigidez del 42 % en las cuerdas dobles, del 77 % en grupos pequeños y, finalmente, del 88 % en las etapas avanzadas representadas por grupos grandes. Los discos que contienen un patrón difuso se muestran en elevada elasticidad con una variación importante de los valores únicos del módulo de Young. Para todos los discos cartilaginosos con una organización de patrón celular predominante asignada, se encontró que la profundidad de indentación asociada con el punto de ajuste empleado era inversamente proporcional a la rigidez.

Los artefactos observados en las curvas de fuerza-distancia generadas son indicativos de un contacto subóptimo entre el voladizo de AFM y la superficie del cartílago o de una fijación incorrecta de la muestra a la placa de Petri. Nuestros explantes de cartílago se pueden procesar y analizar utilizando una variedad de técnicas biológicas moleculares, como el análisis de proteínas a través de eliza, el etiquetado inmunológico, la modificación occidental o el análisis de genes mediante PCR. Este método se puede utilizar para estudiar el impacto directo de las nuevas terapias en el cartílago articular y puede ayudar a los investigadores a obtener información importante sobre los mecanismos de la osteoartritis.