Name: La mecánica de las redes de actomiosina contráctil (poro-)elástica como sistema modelo del citoesqueleto celular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-10T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Aprende a caracterizar la mecánica de geles de actomiosina poroelástica como modelo del citoesqueleto celular. Este método in vitro revela cómo la contractilidad de miosina genera flujo de fluido y correlaciona velocidades de red y citosol.

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Nos gustaría agradecer a Dina Aranovich por la purificación y el etiquetado de proteínas. G.L. agradece al Ministerio de Ciencia, Tecnología y Espacio de Israel por la beca de doctorado Jabotinsky. A.B.G. agradece a la Fundación de Ciencia de Israel (subvención 2101/20) y al Ministerio de Ciencia y Tecnología - Estado de Israel (subvención 3-17491) por su apoyo financiero.

1. Tratamiento y pasivación de superficies de vidrio:
NOTA: Esta sección incluye tres pasos principales (ver Figura 1): (i) limpieza e hidrofilización, (ii) silanización y (iii) pasivación superficial.
<ol><li>Limpieza e hidrofilización<ol><li>Use la solución Piranha para la limpieza de la superficie del vidrio. NOTA: La solución de piraña es una mezcla de 30% deH2O2y 70% deH2SO 4 (Tabla de materiales). Su objetivo principal es eliminar las contaminaciones orgánicas de las superficies de cobertura y exponer los grupos OH en la superficie del vidrio. De esta manera, la superficie del vidrio se vuelve hidrófila.</li>
		<li>Coloque 10-12 #1.5 (22 mm x 22 mm) cubreobjetos de vidrio (Tabla de materiales) en un soporte de politetrafluoroetileno casero (área de la base: 5.5 cm x 5.5 cm). Transfiera el soporte de politetrafluoroetileno a un vaso de precipitados de 400 ml (tabla de materiales) e incube con 300 ml de solución de piraña durante 2 h. Haga este paso sobre hielo y en una campana química. NOTA: El poste de politetrafluoroetileno atornillado a la base del soporte mide 12 cm de largo, más largo que el vaso de precipitados (11 cm), lo que permite la transferencia / extracción segura del soporte hacia / desde la solución de Piranha. Dado que la solución de Piraña todavía puede ser altamente reactiva y muy caliente, es imperativo detener la reacción. La forma más fácil de detener la reacción es verter la solución de piraña en agua (del grifo) para lograr una dilución de 50x (al menos). La solución se puede desechar de forma segura. Nunca guarde la solución de piraña usada en una botella de vidrio cerrada, esto podría terminar en una explosión de la botella.</li>
		<li>Transfiera el soporte de politetrafluoroetileno a un vaso de precipitados limpio lleno de agua fresca de doble destilación (DDW) para lavar el exceso de piraña de los cubreobjetos.</li>
		<li>Transfiera el vaso de precipitados a un baño de sonicación (Tabla de materiales) y sanice a 80 Hz a plena potencia durante 10 minutos a 25 °C. Repita este paso dos veces más con DDW nuevo. Use DDW nuevo en cada momento.</li>
	</ol></li>
	<li>Silanización<ol><li>Transfiera el soporte a un vaso de precipitados limpio (400 ml) lleno de 300 ml de metanol puro (tabla de materiales) y luego a un baño de sonicación (tabla de materiales). Sonicate a 80 Hz a plena potencia durante 30 min a 25 °C.</li>
		<li>Después de la sonicación, transfiera el soporte a una solución de silano preparada con 15 ml de DDW, 3.1 ml de ácido acético (tabla de materiales), 340 ml de metanol y 7.6 ml de silano ((3-mercaptopropil) trimetoxisilano) (tabla de materiales). Sellar el vaso de precipitados con parafilm y mantenerlo en la nevera a 4 °C durante la noche. NOTA: La preparación y manipulación de la solución de silano debe realizarse en una campana química. Después del paso de silanización, coloque la solución de silano usada (residuo) en una botella de vidrio dedicada dentro de la campana química.</li>
		<li>Al día siguiente, transfiera el soporte a un vaso de precipitados limpio lleno de 300 ml de metanol puro durante 15 s. Luego, transfiera el soporte a un vaso de precipitados limpio, no antes de secar la parte inferior del soporte de politetrafluoroetileno para eliminar el exceso de metanol. Transfiera el vaso de precipitados al horno (Tabla de materiales) para secar los cubreobjetos de vidrio durante 5 minutos a 120 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Pasivación superficial con polímero inerte<ol><li>Logre la pasivación superficial incubando los cubobjetos de vidrio con un polímero inerte (Tabla de materiales). Para cada experimento, tome dos cubreobjetos y colóquelos en una placa de Petri recubierta con una capa de parapelícula inicialmente limpiada con etanol (EtOH) (DDW / EtOH: 30/70 vol / vol) (Tabla de materiales).</li>
		<li>Incubar cada cubreobjetos con 1 ml de maleimida de 4 mg·mL−1 5 kDa de peso molecular de metoxipolietilenglicol maleimida (mPEG-mal, Mw = 5 kDa) (Tabla de materiales) en 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Tabla de materiales) durante 1 h a 22 °C. NOTA: La colocación de los cubreobjetos sobre una capa de parafilm hidrófobo confina la solución de polímero PEG hidrófilo a la superficie del cubreobjetos de vidrio. El tiempo de incubación es crítico para lograr una pasivación óptima. Utilizar tiempos de incubación que oscilan entre 45 min y 2 h. Por encima de este tiempo de incubación, la superficie de los cubreobjetos de vidrio puede deteriorarse, lo que lleva a la adhesión de proteínas y una pérdida de transparencia.</li>
		<li>Al final del proceso de incubación, enjuague cada cubreobjetos con 5 ml de DDW y seque con un flujo deN2 (gas). No seque los cubreobjetos al vacío. Dado que los cubreobjetos deben mantenerse húmedos después de la pasivación, aplique inmediatamente 1 ml de 10 mM de Tris en las superficies pegiladas. Utilice los cubreobjetos en un plazo de 2 h. NOTA: Los diversos pasos deben realizarse en una cámara de flujo laminar para evitar la contaminación de la superficie del vidrio.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Purificación de proteínas
<ol><li>Purificar la actina G del polvo de acetona del músculo esquelético del conejo utilizando el método de filtración en gel24.<ol><li>La purificación de actina toma 1 semana. Mantenga la actina G purificada en G-buffer (5 mM Tris pH 7.8, 0.01% NaN3, 0.1 mM CaCl 2,0.2 mM ATP y 1 mM DTT) y guárdela en hielo. Use la solución dentro de las 2 semanas. NOTA: Reemplace el hielo cada dos días.</li>
		<li>Etiquete la actina con un colorante fluorescente modificado con maleimida16 (Tabla de materiales). Purificar el GST-fascin basado en el método de Ono et al.25. Congelar rápidamente ambas proteínas en el líquido N2 y almacenar a -80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilice un protocolo estándar para purificar la miosina II del músculo esquelético del conejo26. El amortiguador de material de miosina II purificada (dímeros) incluye 10 mM Tris pH 7.4, 0.5 M KCl y 35% p/v sacarosa. Congelar rápidamente la miosina en líquido N2 y almacenar a -80 °C. NOTA: La alta concentración de KCl mantiene los motores de miosina en una forma dimérica, mientras que el alto porcentaje de sacarosa asegura que la actividad de los motores no se vea obstaculizada al congelarse. Utilice una pipeta específica para la manipulación de fluidos viscosos cuando trabaje con soluciones madre de miosina II (Tabla de materiales).<ol><li>Marcar los dímeros de miosina II con un colorante fluorescente (Tabla de materiales) en pares de residuos de cisteína diseñados19,27. Use una molleja de pollo RLC mutante A para ese propósito26. Congelar rápidamente la miosina II marcada enN2 líquido y almacenar a -80 °C. NOTA: Este procedimiento de etiquetado asegura que la miosina marcada esté activa como la proteína nativa de miosina II.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilice un espectrofotómetro UV-Vis (Tabla de materiales) para medir la absorbancia de las soluciones de proteínas madre y deduzca las concentraciones de proteínas con la ley de Beer-Lambert utilizando los siguientes coeficientes de extinción: G-actina (ε290 = 26,460 M−1·cm−1), GST-fascin (ε 280 = 99,330 M−1·cm−1), dímero de miosina II (ε280 = 268,800 M−1·cm−1), y RLC mutante A (ε280 = 3.960 M−1,cm−1)19.</li>
</ol>3. Preparación de la muestra
NOTA: Polimerizar los monómeros de actina en presencia de grandes agregados de motores de miosina II y la fuerte fascina reticulante pasiva para producir redes de actomiosina elásticas contráctiles macroscópicamente19,23. La adición de perlas fluorescentes a la solución permite rastrear el flujo de solvente durante la contracción del gel.
<ol><li>Solución de proteína ("actomiosina")<ol><li>Excepto para la actina G, mantener las proteínas a -80 ° C en pequeñas alícuotas y descongelarlas a 37 ° C antes de usarlas. El volumen total de la solución de actomiosina es de 40 μL.</li>
		<li>Preparar la solución mezclando 10 mM Tris pH 7.4, 2 mM MgCl2, 25 mM KCl, 1 mM ATP, un sistema regenerador de ATP (0.5 mg·mL−1 creatina quinasa y 5 mM fosfato de creatina), 200 μM EGTA (quelatosCa 2+ iones), una solución antiblanqueadora (0.1 mg·mL−1 glucosa oxidasa, 0.018 mg·mL−1 catalasa y 5 mg·mL−1 glucosa), 5 μM G-actina, 280 nM GST-fascina y 1,67 nM miosina II. El porcentaje de G-actina marcada es del 5% (porcentaje molar). NOTA: Utilice un bajo porcentaje de actina G marcada para evitar la saturación de la señal fluorescente en las etapas avanzadas de la contracción del gel.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de agregados motores de miosina II<ol><li>Agregue los motores de miosina a la solución de proteína en forma de agregados. Para formar grandes agregados de miosina (150 dímeros de miosina/agregado), diluir la solución madre de miosina con 10 mM Tris pH 7.4 para alcanzar una concentración final de 25 mM KCl.</li>
		<li>Mantenga la solución de miosina diluida durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT) y luego transfiérala al hielo hasta que la use. Los motores están completamente activos durante un máximo de 2 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Medición del flujo de disolvente<ol><li>Para rastrear el flujo de solvente a través de los poros del gel, agregue las perlas fluorescentes a la solución de actomiosina. Reduzca la interacción entre las perlas y la red de actomiosina pasivando las perlas. Prácticamente, incubar 1 μL de perlas (Tabla de materiales) con 5 μM de actina G durante 20 min a RT, y luego eliminar el exceso de G-actina por centrifugación (Tabla de materiales) (condiciones: 6,000 x g durante 5 min a 4 °C).</li>
		<li>Repita este paso con 10 mg·mL−1 de albúmina sérica bovina (BSA) (Tabla de materiales) para bloquear (posiblemente) la superficie restante no recubierta. Utilice las perlas en una dilución final de 1:10.000 vol/vol en los experimentos. NOTA: Es importante adaptar el diámetro de las perlas al tamaño de poro del gel, de modo que la relación perla/tamaño de poro sea <1 en todas las etapas.</li>
	</ol></li>
	<li>Efecto de la viscosidad de la solución<ol><li>Controle la viscosidad de la solución agregando glicerol (Tabla de materiales) a la solución de actomiosina. La adición de glicerol a un porcentaje en peso que oscila entre 0% y 34% induce un aumento correspondiente en la viscosidad de la solución de η ω a 2,76 η ω, donde η ωes la viscosidad del agua a 20 °C28. NOTA: Es esencial utilizar una pipeta dedicada para la manipulación de fluidos viscosos cuando se trabaja con glicerol (Tabla de materiales).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Ejecutar un experimento
<ol><li>Manipulación casera de portamuestras<ol><li>Tome uno de los cubreobjetos pasivados con PEG, coloque un espaciador de parafilm engrasado encima de él y colóquelo en el soporte de muestra. NOTA: Se puede reemplazar el espaciador de parafilm con cualquier espaciador.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de la solución de actomiosina<ol><li>Preparar la solución de actomiosina en hielo en un tubo de microcentrífuga incorporando los diversos componentes microscópicos, añadiendo los agregados motores de miosina II y añadiendo EGTA al final. Mezclar bien la solución. La adición de EGTA inicia la polimerización de la red de actomiosina, que establece el tiempo de inicio del experimento.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque 1,1 μL de esa solución en el cubreobjetos montado en el soporte y coloque el segundo cubreobjetos en la parte superior. Atornille el soporte para sellar la muestra. Este proceso aprieta ligeramente la gota, que adopta una forma de disco. Los diámetros de gota oscilan entre 2.800-3.000 μm.</li>
	<li>Coloque el portamuestras en el microscopio y comience la adquisición. Prepare el microscopio con anticipación para reducir el tiempo de adquisición inicial. Por lo general, toma 1-2 minutos después de la mezcla para comenzar la imagen de la muestra.</li>
</ol>5. Técnicas de microscopía
<ol><li>Imagen de las muestras utilizando un microscopio fluorescente invertido (Tabla de materiales) controlado por un software dedicado (Tabla de materiales).<ol><li>Utilice aumentos bajos de 2.5x/0.075 Plan-NEOFLUAR objetivo (Tabla de materiales) para visualizar toda el área del gel y seguir su contracción macroscópica con el tiempo.</li>
		<li>Utilice un objetivo UPlanFL de 10x/0.3 Ph1 (Tabla de materiales) para caracterizar la porosidad y estructura de la red y para seguir la autoorganización y contracción de la red con el tiempo. NOTA: Este objetivo también es útil para localizar los agregados motores de miosina II dentro de la red y seguir el movimiento de las perlas fluorescentes a través de los poros del gel. Se pueden usar aumentos más altos a expensas de un campo de visión reducido, lo que es aún más significativo en el modo de imagen de doble color (Tabla de materiales).</li>
	</ol></li>
	<li>Excitar las muestras a 488 nm (actina/perlas fluorescentes) y 561 nm (agregados motores de miosina/perlas fluorescentes). Adquiera las imágenes a 100 ms por fotograma con un software dedicado (Tabla de materiales) en modo streaming con una cámara de dispositivo de carga acoplada multiplicadora de electrones (EMCCD) (Tabla de materiales). NOTA: La intensidad de la lámpara fluorescente (Tabla de materiales) debe mantenerse en el valor más bajo posible para evitar la saturación de la señal durante la contracción de la red.</li>
	<li>Imágenes simultáneas en dos colores<ol><li>Utilice este modo para dos propósitos: (i) detectar la localización de los agregados motores de miosina dentro de la red de actina, e (i) caracterizar el flujo de disolvente hacia afuera dentro y fuera durante la contracción de la red.</li>
		<li>Excite los motores de actina y miosina II a 488 nm y 561 nm, respectivamente, y grabe las imágenes simultáneamente en una cámara EMCCD (Tabla de materiales) utilizando un aparato de doble emisión (Tabla de materiales). Utilice el mismo sistema de imágenes para obtener imágenes simultáneas del gel de actina (488 nm) y las perlas fluorescentes (561 nm).</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Cheng, N. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formula+for+the+viscosity+of+a+glycerol%E2%88%92water+mixture%5BTitle%5D)+AND+%22Industrial+%26+Engineering+Chemistry+Research%22%5BJournal%5D)">Formula for the viscosity of a glycerol−water mixture.</a> Industrial & Engineering Chemistry Research. 47 (9), 3285-3288 (2008).</li>
<li>Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+membranes+with+grafted+polymers%3A+Physicochemical+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).</li>
<li>Strychalski, W., Guy, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+pressure+dynamics+in+blebbing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Intracellular pressure dynamics in blebbing cells.</a> Biophysical Journal. 110 (5), 1168-1179 (2016).</li>
<li>Head, D. A., Levine, A. J., MacKintosh, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+regimes+of+elastic+response+and+deformation+modes+of+crosslinked+cytoskeletal+and+semiflexible+polymer+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E%22%5BJournal%5D)">Distinct regimes of elastic response and deformation modes of crosslinked cytoskeletal and semiflexible polymer networks.</a> Physical Review E. 68 (6), 061907(2003).</li>
<li>MacKintosh, F. C., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonequilibrium+mechanics+and+dynamics+of+motor-activated+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Nonequilibrium mechanics and dynamics of motor-activated gels.</a> Physical Review Letters. 100 (1), 018104(2008).</li>
<li>Melero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+molecular+adsorption+of+proteins+using+the+PRIMO+system+for+micro-patterning+to+study+cell+responses+to+extracellular+matrix+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Light-induced molecular adsorption of proteins using the PRIMO system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60092(2019).</li>
<li>Bendix, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analysis+of+contractility+in+active+cytoskeletal+protein+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks.</a> Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, se emplea un enfoque in vitro para caracterizar la mecánica de los geles poroelásticos de actomiosina como un sistema modelo del citoesqueleto celular y, más generalmente, del citoplasma celular, que ha demostrado comportarse como un material poroelástico 3,5. La reología del citoesqueleto celular (citoplasma) se ha caracterizado por una constante de difusión poroelástica, que dicta cuánto tiempo tarda el líquido citosólico intracelular en redistri...

Las células vivas tienen propiedades mecánicas únicas. Además de la capacidad de reaccionar pasivamente a las fuerzas aplicadas, también son capaces de generar activamente fuerzas en respuesta a estímulos externos1. Estas características, que son esenciales para una variedad de procesos celulares, especialmente durante la motilidad celular, se atribuyen principalmente a las propiedades mecánicas y dinámicas del citoesqueleto celular, especialmente el citoesqueleto de actomiosina, que es un gel activo de filamentos de actina polar, motores moleculares de miosina y proteínas accesorias. Estas redes de actomiosina exhiben propiedades intrínsecas de autoorganización y contracción impulsadas por las proteínas motoras de miosina, que entrecruzan los filamentos de actina y generan activamente tensiones mecánicas en la red alimentadas por la hidrólisisde ATP 2.
Se han realizado numerosos estudios experimentales y teóricos para estudiar las propiedades materiales del citoesqueleto3. La opinión comúnmente aceptada es que el citoesqueleto se comporta como un material viscoelástico4. Esto significa que en escalas de tiempo cortas, el citoesqueleto se comporta como un material elástico, y en escalas de tiempo largas, se comporta como un fluido viscoso debido a las proteínas de reticulación y al desprendimiento motor de miosina (y reconexión), lo que permite que la red se mueva dinámicamente. En muchas situaciones, sin embargo, el modelo viscoelástico no puede describir los resultados experimentales, que son más consistentes con una imagen que describe el citoesqueleto y, más generalmente, el citoplasma celular que se describe como un material activo poroelástico 5,6. Dos características principales caracterizan este tipo de materiales. (i) La primera característica principal es la generación de un flujo del citosol penetrante (el "solvente") a través de los poros del gel por gradientes de contractilidad impulsados por los motores de miosina, que subyace a procesos como el blebbing celular7, la motilidad8 y las oscilaciones de la forma celular9. La aparición de tales flujos citosólicos puede ser local, para ampollar, o global, como en la motilidad celular. En este último caso, las tensiones contráctiles aplicadas en la parte posterior de la célula impulsan el flujo del líquido citosólico hacia el frente celular, lo que repone el conjunto de proteínas necesarias para el ensamblaje de lamellipodia8. (ii) La segunda característica principal es que la relajación de las tensiones es difusiva y se caracteriza por una constante de difusión efectiva, , que depende del módulo elástico del gel, la porosidad del gel y la viscosidad del disolvente5. La constante de difusión poroelástica determina qué tan rápido responde el sistema a una tensión aplicada. Las constantes de difusión más altas corresponden a una redistribución de tensiones más rápida. Esto, a su vez, determina cuánto tiempo tarda el líquido citosólico intracelular en redistribuirse dentro de la célula después de la tensión mecánica aplicada, ya sea externa o interna, como las tensiones contráctiles activas generadas por los motores de miosina. Estos ejemplos, por lo tanto, demuestran que la mecánica del citoesqueleto y el citosol están estrechamente acoplados y no pueden ser tratados por separado3.
Como las células pueden regular sus propiedades mecánicas de varias maneras, la interacción entre la mecánica de red y la dinámica del flujo de fluidos sigue siendo poco conocida. Un enfoque alternativo poderoso es el uso de sistemas reconstituidos in vitro que permiten un control total de los diversos componentes microscópicos y los parámetros del sistema, lo que hace que estos sistemas modelo sean óptimos para el análisis físico10,11. Este enfoque se ha empleado con éxito para estudiar el impacto de la composición de proteínas y la geometría del sistema en la motilidad basada en actina 12,13,14,15,16,17,18, el patrón 2D de las redes de actomiosina 19,20,21,22, y la interacción entre la contractilidad de la red y la dinámica del flujo de fluidos de geles de actomiosina poroelástica, que es el foco de este trabajo23.
En este manuscrito se discute la preparación de redes de actomiosina elásticas contráctiles de dimensiones controlables y propiedades del material basadas en el trabajo de Ideses et al.23. Se analiza y cuantifica la dinámica del gel de contracción y el disolvente drenado, a través de los cuales se demuestra que estos geles de actomiosina pueden describirse como un material activo poroelástico. El estudio del efecto de la viscosidad del disolvente sobre la difusividad de tensión confirma aún más la naturaleza poroelástica de estas redes. Se proporcionan las diversas relaciones de escala utilizadas para la cuantificación de datos. Finalmente, también se discuten los desafíos experimentales, las trampas comunes y la relevancia de los resultados experimentales para el citoesqueleto celular.

<table><tbody><tr><td>(3-Mercaptopropyl)trimetoxisilano</td><td>Sigma-Aldrich Company 175617</td><td></td><td>Almacenado bajo atmósfera de argón a 4 & grados; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Bio-Lab ltd</td><td>1070521</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 488</td><td>Invitrogene</td><td>A10254</td><td>Diluido con DMSO, almacenado bajo atmósfera de argón a -20 & grados; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 647</td><td>Invitrogene</td><td>A20347</td><td>Diluido con DMSO, almacenado en atmósfera de argón a -20 & grados; C&nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma -Aldrich Company</td><td>A3059</td><td>almacenado a 4 & deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma -Aldrich Company</td><td>C9322</td><td>La botella de stock se mantiene en atmósfera seca (gel de sílice) a -20 & grados; C</td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Mezel-glaser</td><td>CG2222-1.5</td><td>Conservado en agua miliQ después del tratamiento con Piraña y utilizado en 3 semanas</td></tr><tr><td>Creatina quinasa</td><td>Roche Life Science Products 10736988001</td><td></td><td>Preparado fresco en tampón de glicina, mantenido en hielo y utilizado en 3 días. La botella de caldo se mantiene en atmósfera seca (gel de sílice) a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Fosfato de creatina</td><td>Roche Life Science Products</td><td>10621714001</td><td>Cuando se disuelve debe mantenerse a -20 & grados; C y se utiliza en un plazo de 3 meses. La botella de stock se mantiene bajo atmósfera de argón y se almacena a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Roche Life Science Products 10708984001</td><td></td><td>Cuando se disuelve debe mantenerse a -20 & grados; C y se utiliza dentro de los 3 meses</td></tr><tr><td>Sistema de imágenes simultáneas de doble vista&nbsp;</td><td>Fotometría</td><td>DV2-CUBE</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>MP Biomedicals</td><td>195174</td><td></td></tr><tr><td>Cámara EM-CCD Andor</td><td>Technology Ltd</td><td>DV 887</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCD</td><td>Cámara Photometrics</td><td>Evolve Delta</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Bio-Lab Ltd</td><td>525050300</td><td></td></tr><tr><td>Lámpara de fluorescencia</td><td>Rapp Optoelectrónica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG Microspheres</td><td>Polysciences</td><td>17151-10</td><td>200 nm de diámetro</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>ICN Biomedicals Inc</td><td>194024</td><td>Cuando se disuelve debe mantenerse a -20 & grados; C y se utiliza en un plazo de 3 meses.</td></tr><tr><td>Glucosa oxidasa</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>G7141</td><td>Conservada en -20 &deg; C y se utiliza en un plazo de 3 meses. El polvo de stock se mantiene bajo atmósfera de argón y se mantiene a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>ICN Biomedicals Inc</td><td>800687</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>MP Biomedicals</td><td>808822</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno</td><td>Sigma-Aldrich Company 216763</td><td></td><td>almacenado a 4 & deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>KCl</td><td>EMD Millipore Corp.</td><td></td><td></td>529552</tr><tr><td>Methanol</td><td>Bio-Lab ltd</td><td>1368052100</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>EMD Millipore Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>442615 Leica Microsystems DMI3000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mPEG-mal</td><td>Nanocs</td><td>PG1-ML-5k&nbsp;</td><td>Mw = 5000 Da. Dividido en lotes pequeños por peso. Almacenado bajo atmósfera de argón a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Microesferas rojas del Nilo</td><td>Spherotech</td><td>FP-2056-2&nbsp;</td><td>2300 nm de diámetro</td></tr><tr><td>Objetivo (10x)</td><td>Leica Alemania</td><td>HC PL AP0</td><td>UPlanFL Apertura numérica = 0.3</td></tr><tr><td>Objetivo (2.5x)</td><td>Leica Alemania</td><td>506304</td><td>&nbsp; Plan-NEOFLUAR Apertura numérica = 0.075</td></tr><tr><td>Horno</td><td>WTC Aglutinante</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Amcor</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>PBS Buffer</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de obturador</td><td>Vincet Associates</td><td>VMM D1</td><td></td></tr><tr><td>Gel de sílice</td><td>Merck</td><td>1.01907.5000</td><td></td></tr><tr><td>Sonicador</td><td>Elma</td><td>Elmasonic P</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico</td><td>Reactivos Carlo Erba</td><td>410301</td><td></td></tr><tr><td>DV2 Sistema de imagen simultánea de doble canal</td><td>Fotometría</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>MP Biomedicals</td><td>819620</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro UV-VIS</td><td>Pharmacia</td><td>Ultraspec 2100 pro</td><td></td></tr><tr><td>MICROMAN E</td><td>Gilson</td><td>FD10001</td><td>1&ndash; 10 uL</td></tr><tr><td>MATLAB R2017b</td><td>MathWorks</td><td></td><td>Cuantificación de datos&nbsp;</td></tr><tr><td>MetaMorph&nbsp;</td><td>Dispositivos</td><td></td> moleculares <td>Software de control del sistema óptico de imágenes; cuantificación de datos (análisis de seguimiento de partículas, tamaño de malla de red)</td></tr></tbody></table>

la mecánica de las redes de actomiosina contráctil (poro-)elástica como sistema modelo del citoesqueleto celular

The Mechanics of (Poro-)Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton

Las células pueden cambiar activamente sus formas y volverse móviles, una propiedad que depende de su capacidad para reorganizar activamente su estructura interna. Esta característica se atribuye a las propiedades mecánicas y dinámicas del citoesqueleto celular, en particular, el citoesqueleto de actomiosina, que es un gel activo de filamentos de actina polar, motores de miosina y proteínas accesorias que exhiben propiedades de contracción intrínsecas. La opinión generalmente aceptada es que el citoesqueleto se comporta como un material viscoelástico. Sin embargo, este modelo no siempre puede explicar los resultados experimentales, que son más consistentes con una imagen que describe el citoesqueleto como un material activo poroelástico, una red elástica incrustada con citosol. Los gradientes de contractilidad generados por los motores de miosina impulsan el flujo del citosol a través de los poros del gel, lo que infiere que la mecánica del citoesqueleto y el citosol están estrechamente acoplados. Una característica principal de la poroelasticidad es la relajación difusiva de las tensiones en la red, caracterizada por una constante de difusión efectiva que depende del módulo elástico del gel, la porosidad y la viscosidad del citosol (solvente). Como las células tienen muchas formas de regular su estructura y propiedades materiales, nuestra comprensión actual de cómo se acoplan la mecánica del citoesqueleto y la dinámica del flujo del citosol sigue siendo poco conocida. Aquí, se emplea un enfoque de reconstitución in vitro para caracterizar las propiedades materiales de los geles de actomiosina poroelásticos como un sistema modelo para el citoesqueleto celular. La contracción del gel es impulsada por la contractilidad motora de la miosina, lo que conduce a la aparición de un flujo del disolvente penetrante. El documento describe cómo preparar estos geles y realizar experimentos. También discutimos cómo medir y analizar el flujo de solvente y la contracción del gel tanto a escala local como global. Se dan las diversas relaciones de escala utilizadas para la cuantificación de datos. Finalmente, se discuten los desafíos experimentales y las trampas comunes, incluida su relevancia para la mecánica del citoesqueleto celular.

Se utilizan dos cubreobjetos de vidrio por experimento. Los cubreobjetos de vidrio se limpian y pasivan con polímeros PEG. La pasivación es esencial para evitar que las proteínas solubilizadas se adhieran a las superficies de vidrio en las primeras etapas experimentales y para minimizar la interacción de la red de contracción con las paredes de vidrio. No lograr una buena pasivación puede conducir a una contracción ineficiente y, en casos extremos, incluso puede inhibir la formación de la red de actina.
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En este trabajo, se emplea un enfoque de reconstitución in vitro para estudiar la poroelasticidad de los geles de actomiosina en condiciones controladas. Se cuantifica la dinámica del gel de actomiosina y el disolvente incrustado, a través de la cual se demuestra la porosidad de la red. También discutimos los desafíos experimentales, las trampas comunes y la relevancia para la mecánica del citoesqueleto celular.

La mecánica de las redes de actomiosina contráctil (poro-)elástica como sistema modelo del citoesqueleto celular

Cells can actively change their shapes and become motile, a property that depends on their ability to actively reorganize their internal structure. This ...

Hemos desarrollado un enfoque in vitro para caracterizar la mecánica de los geles poroelásticos de actomiosina como un sistema modelo del citoesqueleto celular y, más generalmente, del citoplasma, que se ha demostrado que se comporta como un material activo poroelástico. Este método proporciona información sobre cómo la contractilidad de la miosina contribuye a la aparición de un flujo de fluido y cómo las velocidades de la red y el citosol se correlacionan en el tiempo y el espacio. Este enfoque simple nos permite extraer las propiedades mecánicas de los sistemas que evolucionan dinámicamente sin utilizar ningún equipo o técnica sofisticada donde no se puedan emplear herramientas convencionales como AFIM.Este método puede proporcionar información sobre la reología de los materiales activos poroelásticos independientemente de la especificidad del gel activo y el fluido incrustado. Para comenzar, coloque de 10 a 12 cubreobjetos de vidrio número 1.5 en un soporte casero de politetrafluoroetileno y prepare la solución de piraña en un vaso de precipitados de 400 mililitros. Prepare la solución en hielo en una campana química.Transfiera el soporte al vaso de precipitados relleno de Pira

the-mechanics-poro-elastic-contractile-actomyosin-networks-as-model

Research

Investigación

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Bioengineering

Bioingeniería

Se presenta y discute la formación de haces de actomiosina in vitro y la medición de la generación de fuerza del conjunto de miosina utilizando pinzas ópticas.

Sondeo de la mecánica del conjunto de miosina en haces de filamentos de actina utilizando pinzas ópticas

La microscopía dinámica diferencial (DDM) combina características de dispersión dinámica de luz y microscopía. Aquí, se presenta el proceso de uso de DDM para caracterizar redes de citoesqueletos reconstituidos mediante la cuantificación de la dinámica subdiffusiva y enjaulada de partículas en redes de vimentina y el movimiento balístico de compuestos activos de actina-microtúbulos impulsados por miosina.

Cuantificación de la dinámica del citoesqueleto mediante microscopía dinámica diferencial

Este protocolo describe la formación de bicapas lipídicas soportadas y la adición de filamentos citoesqueléticos y proteínas motoras para estudiar la dinámica de las redes citoesqueléticas reconstituidas y atadas a la membrana utilizando microscopía de fluorescencia.

Reconstitución de corticidades mínimas de actina atadas a la membrana en bicapas lipídicas soportadas

En este manuscrito, demostramos las técnicas experimentales para encapsular el citoesqueleto de actina F en vesículas lipídicas unilamelares gigantes (también llamadas liposomas), y el método para formar una capa de actina F que imita la corteza en la valva interna de la membrana liposómica.

In vitro Reconstitución del citoesqueleto de actina dentro de vesículas unilamelares gigantes

Este artículo presenta protocolos para la ingeniería y caracterización de redes compuestas tridimensionales sintonizables de filamentos de actina coentrelazados y microtúbulos. Los compuestos experimentan una reestructuración activa y movimiento balístico, impulsado por motores de miosina II y quinesina, y están sintonizados por las concentraciones relativas de actina, microtúbulos, proteínas motoras y reticulantes pasivos.

Reconstitución y caracterización de compuestos de actina-microtúbulos con dinámica y mecánica accionada por motor sintonizable

La contractilidad de la actomiosina juega un papel importante en la morfogénesis celular y tisular. Sin embargo, es difícil manipular la contractilidad de la actomiosina in vivo de forma aguda. Este protocolo describe un sistema optogenético que inhibe rápidamente la contractilidad de la actomiosina mediada por Rho1 en embriones de Drosophila , revelando la pérdida inmediata de la tensión epitelial después de la inactivación de la actomiosina in vivo.

Inhibición optogenética de la contractilidad de la actomiosina mediada por Rho1 junto con la medición de la tensión epitelial en embriones de Drosophila

Aquí, presentamos métodos para preparar ensamblajes de actina cuasi-bidimensionales (2D) entrelazados, reticulados y de cristal líquido a partir de proteínas purificadas.

Ajuste de los modos de contractilidad y deformación de ensamblajes activos basados en actina in vitro: de redes activas bidimensionales a gotas de cristal líquido

Este protocolo describe un ensayo de movilidad de perlas con colas de cometa de actina ajustable para investigar cuantitativamente cómo la actividad del motor de miosina influye en el ensamblaje de actina ramificada y en la arquitectura de la red en una interfaz similar a una membrana.

Reconstitución del ensamblaje de actina ramificada mediado por miosina I en un ensayo de motilidad de colas de cometa de actina basado en microesferas

Tradicional de dos dimensiones técnicas de cultivo de células a menudo resultan en características alteradas con respecto a los marcadores de diferenciación, citoquinas y factores de crecimiento. En tres dimensiones de cultivo de células en el sistema de rotación de cultivo celular (RCC) restablece la expresión de muchos de estos factores, como se muestra aquí con una línea de células trofoblásticas extravelloso.

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Hemos optimizado una técnica de microencapsulación como una plataforma efectiva en 3D para la propagación y la diferenciación de células madre embrionarias para endodermo y las neuronas dopaminérgicas (DA). También proporciona una oportunidad para inmune-aislamiento de células del huésped durante el trasplante. Esta plataforma se puede adaptar para otros tipos de células.

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Aprende a caracterizar la mecánica de geles de actomiosina poroelástica como modelo del citoesqueleto celular. Este método in vitro revela cómo la contractilidad de miosina genera flujo de fluido y correlaciona velocidades de red y citosol.

La mecánica de las redes de actomiosina contráctil (poro-)elástica como sistema modelo del citoesqueleto celular

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