Name: Modelo animal de pez cebra para el estudio de reacciones alérgicas en respuesta a biomoléculas de saliva de garrapatas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Explore el modelo de pez cebra para estudiar reacciones alérgicas inducidas por saliva de garrapatas y el síndrome alfa-Gal. Este método permite identificar biomoléculas clave y mecanismos inmunitarios involucrados.

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Queremos agradecer a los miembros del grupo SaBio su colaboración en el diseño experimental y asistencia técnica con la instalación experimental de peces y a Juan Galcerán Sáez (IN-CSIC-UMH, España) por proporcionar pez cebra. Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Ciencia e Innovación/Agencia Estatal de Investigación MCIN/AEI/10.13039/501100011033, España y EU-FEDER (Grant BIOGAL PID2020-116761GB-I00). Marinela Contreras está financiada por el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, España, subvención IJC2020-042710-I.

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal de la Universidad de Castilla La Mancha en el marco del estudio "Evaluación de la respuesta inmune a la vacuna inactivada contra M. bovis y desafío con M. marinum en el número de modelo de pez cebra PR-2017-05-12".
Las garrapatas se obtuvieron de la colonia de laboratorio, donde se analizaron muestras representativas de garrapatas en la colonia mediante PCR para detectar patógenos comunes de garrapatas para confirmar la ausencia de patógenos, y se mantuvieron en el Instituto de Parasitología, Centro de Biología de la Academia Checa de Ciencias (IP BC CAS), República Checa.Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Ley de Protección Animal de la República Checa No. 246/1992 Sb (aprobación ética No. 34/2018).
1. Tratamiento del pez cebra
NOTA: El ensayo está diseñado para evaluar las reacciones alérgicas y la respuesta inmune en el pez cebra tratado con saliva de garrapata en respuesta al consumo de carne de mamíferos.
<ol><li>Tratar el pescado (como se explica en la sección 4) con saliva de garrapata, Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) comercial (ver Tabla de materiales), utilizada como control positivo, con solución salina tamponada con fosfato (PBS) como control negativo. El pez cebra adulto se distribuye aleatoriamente en tres grupos de género equilibrado (Figura 1). NOTA: Cualquier otro compuesto deseado relacionado con AGS puede ser evaluado usando este modelo.</li>
</ol>2. Extracción de saliva de garrapata Ixodes ricinus 
<ol><li>Use garrapatas hembras semi-hinchadas libres de patógenos alimentadas durante 6-7 días en conejillos de indias.</li>
	<li>Tratar la garrapata con 5 μL de una solución al 2% (peso / vol) de clorhidrato de pilocarpina en PBS (ver Tabla de materiales) a pH 7.4 en el hemocoel usando una jeringa de 50 μL con una aguja de 0.33 mm como se describió anteriormente28 para inducir la producción de saliva por garrapata. NOTA: Las garrapatas se manejan con fórceps; Tenga cuidado de no aplicar demasiada fuerza al agarrarlos.</li>
	<li>Recoger la saliva con una punta de 10 μL montada en una micropipeta.<ol><li>Introduzca la punta dentro del hipostoma de garrapatas con cuidado.</li>
		<li>Mantenga la saliva en un tubo de 1,5 ml sobre hielo, constrímela y guárdela a -80 °C como se describió anteriormente27.</li>
	</ol></li>
	<li>Determinar la concentración de proteína en saliva, para establecer la cantidad de proteína a inyectar en el pescado como en estudios previos27 utilizando un kit de ensayo de proteína BCA (ver Tabla de materiales) siguiendo las recomendaciones del fabricante.</li>
</ol>3. Mantenimiento del pez cebra
<ol><li>Mantener el pez cebra en un sistema de agua de flujo continuo a 27 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 14 h/10 h (Figura 2).</li>
	<li>Alimente a los peces dos veces al día a las 9:30 a.m. y 1:30 p.m. con alimento seco para peces (50-70 μg / pescado) hasta el día 2.</li>
	<li>Alimente a los peces dos veces al día a las 9:30 a.m. y 1:30 p.m. con alimento seco para perros (50-70 μg / pez) desde el día 2 después de la inyección del tratamiento hasta el final del experimento</li>
</ol>4. Inyección de pez cebra
<ol><li>Seleccione 10 peces por grupo con una proporción similar de hembras / machos y peso similar. NOTA: El grupo 1 contiene pescado inyectado con PBS, el grupo 2 contiene pescado inyectado con saliva de garrapatas y el grupo 3 contiene pescado inyectado con α-Gal.</li>
	<li>Anestesiar brevemente el pescado por inmersión en metanosulfonato de tricaína al 0,02% (MS-222) (Película 1). NOTA: Los peces debidamente anestesiados muestran respiración normal y no nadan, mientras que podrían colocarse en el fondo del tanque de agua o flotando. Cada pez debe ser anestesiado individualmente para evitar posibles daños fisiológicos.</li>
	<li>Capturar los peces anestesiados utilizando una red de pesca.</li>
	<li>Coloque el pez en su mitad de lado usando fórceps o manos con cuidado, sobre una esponja húmeda, con la aleta caudal en el lado derecho para inyectar los compuestos en la misma dirección con el fin de controlar las lesiones.</li>
	<li>Inyectar grupos de peces por vía intradérmica, como en estudios previos26, en el músculo a 5 mm de la aleta caudal y en un ángulo de 45° en relación con el cuerpo del pez (Película 2). Utilizar el tratamiento adecuado en los días 0, 3 y 8 como se ha descrito anteriormente 27 con una jeringa de 100 μL equipada con una aguja de 1 cm, 29 G con 1 μL (con 9 μg/μL de proteína) de I. ricinus saliva en 10 μL de PBS (saliva por garrapata), 5 μg de α-Gal en 10 μL de PBS (α-Gal)27,  y 10 μL de PBS (Figura 3). NOTA: La manipulación debe hacerse rápida y cuidadosamente para evitar cualquier daño físico al animal. Otras biomoléculas en la saliva de garrapatas se pueden evaluar siguiendo este protocolo.</li>
	<li>Coloque los peces tratados nuevamente en un tanque de agua dulce sin anestesia para su recuperación. NOTA: Todos los peces del mismo grupo se pueden colocar en el mismo tanque de agua para su recuperación.</li>
</ol>5. Alimentación del pez cebra
<ol><li>Machaca la comida para perros con un mortero.</li>
	<li>Alimente 50-70 μg/pescado dos veces al día a las 9:30 a.m. y 1:30 p.m. con alimento para peces secos hasta el día 2.</li>
	<li>Alimente 50-70 μg / pescado dos veces al día a las 9:30 a.m. y 1:30 p.m. con puré de alimento para perros desde el día 2 después de la inyección del tratamiento hasta el final del experimento el día 8. NOTA: Si se van a evaluar los marcadores de inmunidad o los títulos de anticuerpos contra el anticuerpo α-Gal o IgE en respuesta a los tratamientos o la alimentación a lo largo de las diferentes inoculaciones, la alimentación sería necesaria hasta el final del experimento.</li>
</ol>6. Evaluación de reacciones alérgicas, lesiones y comportamiento en pez cebra
<ol><li>Examine el tipo hemorrágico de reacciones alérgicas (enrojecimiento de la piel, decoloración y hemorragia) utilizando una lupa o estereomicroscopio para verificar su precisión e indique la ubicación de su aparición en los peces siguiendo la categorización incluida en la Tabla 1 (Figura 4A). NOTA: Las reacciones alérgicas presentadas en la Figura 4 aparecieron después de la inyección de saliva de garrapata y el consumo de alimentos que contienen carne roja. Por lo tanto, las reacciones descritas son el tipo de reacciones asociadas con AGS, ya que aparecen reacciones similares en el contexto clínico.<ol><li>Observe si aparece alguna reacción después de los tratamientos y mientras se administran alimentos dos veces al día mientras los peces están en el tanque de agua.</li>
	</ol></li>
	<li>Examinar el comportamiento de los peces evaluando los cambios27 en los patrones de natación (movilidad, velocidad, permanecer inmóvil en el fondo del tanque de agua y natación en zigzag) siguiendo la categorización incluida en la Tabla 1.</li>
	<li>Evaluar la mortalidad acumulada, informando el número de peces muertos, incluida la hora/día de la muerte (Figura 4B). NOTA: Todos los parámetros se evalúan inmediatamente después del tratamiento o después del cambio de alimento y se siguen diariamente hasta el final del experimento en el día 8 categorizando las variables cualitativas (Tabla 1). Como recomendación, esta evaluación debe ser realizada por un profesional con conocimientos sobre el pez cebra para considerar cambios de comportamiento en función de sus antecedentes y experiencia trabajando con este modelo animal.</li>
	<li>Calcule el número de peces cebra por día con reacciones alérgicas reportadas, comportamiento anormal y cambios en la alimentación en cada grupo y compare entre grupos mediante una prueba ANOVA unidireccional.</li>
</ol>7. Recogida de muestras
<ol><li>Eutanasia de los peces por inmersión en 0.04% MS-222 el día 8. NOTA: También recoja las muestras de los peces que mueren por reacciones alérgicas durante el ensayo.</li>
	<li>Fije el pescado en una placa de parafina con alfileres.</li>
	<li>Recoger suero de los vasos sanguíneos branquiales 29 de los peces inmediatamente después de la eutanasia, cuando las branquias todavía están irrigadas con sangre, utilizando una jeringa de 0,5 ml equipada con una aguja de 1 cm,29 G. Almacénelo en un tubo de 1,5 ml a -20 °C hasta su uso (película 3).</li>
	<li>Cortar el pescado sagitalmente con una cuchilla de bisturí y evaluar las lesiones internas (lesiones hemorrágicas o granulomas)27,30 si aparecen. NOTA: Las lesiones no aparecen necesariamente, pero deben registrarse si lo hacen.</li>
	<li>Recoja el intestino (Película 4) y el riñón (Película 5) de cada pez en tubos vacíos separados de 1,5 ml, como se describió anteriormente31, y almacénelos a -80 C (Figura 4C).</li>
	<li>Extraiga el ARN total de las muestras de intestino y riñón del pez cebra utilizando un kit de purificación de ARN (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Analizar la expresión de genes relacionados con la respuesta inmune como se describió anteriormente30,32 (ver Tabla 2 para secuencias de cebadores) en pez cebra, realizando una reacción en cadena cuantitativa de polimerasa con transcripción inversa (RT-qPCR) utilizando una mezcla de transcripción inversa para RT-qPCR (ver Tabla de materiales), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Normalizar los valores de cT de ARNm contra D. rerio GAPDH y comparar entre grupos (peces tratados con saliva, α-Gal y los grupos tratados con PBS) utilizando una prueba t de Student con varianza desigual.</li>
	<li>Determinar los títulos de anticuerpos IgM que reconocen α-Gal en pez cebra en muestras de suero por ELISA como se describió anteriormente27,30. Registre los títulos de anticuerpos como valores de O.D.450 nm, utilizando un lector de placas, y compare entre los grupos (peces tratados con saliva, α-Gal y los grupos tratados con PBS) utilizando una prueba t de Student con varianza desigual. NOTA: La determinación de los títulos de anticuerpos IgM y el análisis de genes de expresión son opcionales y se realizan solo si se requiere información inmunológica. La mezcla RT-qPCR es un kit de síntesis de ADNc de primera cadena para el análisis de la expresión génica utilizando qPCR en tiempo real.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El pez cebra es un modelo rentable y fácil de manejar que también ha sido una herramienta muy factible para el estudio de los mecanismos moleculares de la respuesta inmune, enfermedades patógenas, pruebas de nuevos medicamentos y vacunación y protección contra infecciones33,34,35. El estudio sobre el comportamiento del pez cebra es útil ya que estudios previos han encontrado que algunas especies de peces permanecen inmóviles en ...

Las garrapatas son vectores de patógenos que causan enfermedades y también son la causa de reacciones alérgicas, afectando la salud de humanos y animales en todo el mundo 1,2. Durante la alimentación por garrapatas, las biomoléculas en la saliva de garrapatas, especialmente proteínas y lípidos, facilitan la alimentación de estos ectoparásitos, evitando las defensas del huésped3. Algunas biomoléculas de saliva con glicano Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) modificaciones conducen a la producción de altos niveles de anticuerpos anti-α-Gal IgE después de la picadura de garrapata, solo en algunos individuos, lo que se conoce como síndrome de α-Gal (AGS)4. Esta es una enfermedad asociada con la alergia mediada por IgE que puede provocar anafilaxia a las picaduras de garrapatas, consumo de carne de mamíferos no primates y algunos medicamentos como cetuximab5. Las reacciones a α-Gal a menudo son graves y a veces pueden ser fatales 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
El α-Gal se encuentra en todos los mamíferos, excepto en los monos, simios y humanos del Viejo Mundo que no tienen la capacidad de sintetizar α-Gal13. Sin embargo, patógenos como bacterias y protozoos expresan este glicano en su superficie, lo que puede inducir la producción de altas cantidades de anticuerpos anti-α-Gal IgM/IgG y puede ser un mecanismo protector contra estos patógenos16,17. Sin embargo, la producción de anticuerpos anti-α-Gal aumenta el riesgo de desarrollar alergias anti-α-Gal mediadas por IgE 7,13. Los anticuerpos naturales anti-α-Gal producidos en humanos, principalmente de los subtipos IgM/IgG, podrían estar asociados a esta modificación presente en bacterias de la microbiota intestinal16. El AGS puede ser un diagnóstico clínico difícil, ya que el principal método de diagnóstico en este momento se basa en una historia clínica de reacciones alérgicas tardías, especialmente asociadas con alergias alimentarias (es decir, prurito, urticaria localizada o angioedema recurrente a anafilaxia, urticaria y síntomas gastrointestinales) y la medición de los niveles de anticuerpos IgE anti-α-Gal9. Los hallazgos actuales sugieren que las picaduras de garrapatas constituyen uno de los principales riesgos en la aparición de AGS 18,19, un aumento de 20 veces o más en los niveles de IgE a α-Gal después de una picadura de garrapata 19, una historia de picaduras de garrapatas en pacientes con AGS20,21,22, la existencia de anticuerpos reactivos a los antígenos de garrapatas en pacientes con AGS 19, y que la IgE anti-α-Gal está fuertemente relacionada con los niveles de IgE anti-garrapatas19,23, pero se necesitan más estudios para evaluar qué biomoléculas están realmente involucradas.
Además, otro escenario posible son los pacientes que presentan fuertes reacciones alérgicas a las picaduras de garrapatas y altos niveles de anticuerpos anti-α-Gal IgE, pero son tolerantes al consumo de carne de mamíferos12. Por lo tanto, la alergia a la carne de mamífero podría ser un tipo particular de alergia relacionada con la picadura de garrapata. Las principales especies de garrapatas asociadas con AGS incluyen Amblyomma americanum (EE.UU.), Amblyomma sculptum (Brasil), Amblyomma testudinarium y Haemaphysalis longicornis (Japón), Ixodes holocyclus (Australia) e Ixodes ricinus (el principal vector de la borreliosis de Lyme en Europa)11,24. 
El único modelo que se ha utilizado para evaluar la producción de IgE relacionada con las picaduras de garrapatas es el modelo de ratón modificado genéticamente con el gen para ratones α-1,3-galactosiltransferasa noqueada (α-Gal KO)25,26 porque al igual que otros mamíferos, los ratones también expresan α-Gal en proteínas y lípidos y no producen IgE a α-Gal. Sin embargo, el pez cebra (Danio rerio) es un modelo útil para la investigación biomédica aplicada a los mamíferos porque comparte muchas similitudes anatómicas con los mamíferos y, al igual que los humanos, también es incapaz de sintetizar α-Gal. Dado que α-Gal no se produce naturalmente en el pez cebra, es un modelo asequible, fácil de manipular y permite un alto tamaño de muestra para el estudio de reacciones alérgicas relacionadas con α-Gal.
En este estudio, el pez cebra se utiliza como organismo modelo para caracterizar y describir las reacciones alérgicas locales, los patrones de comportamiento y los mecanismos moleculares asociados con la respuesta a la sensibilización percutánea a la saliva de garrapatas26,27 y el posterior consumo de carne de mamíferos. Para este propósito, los peces se exponen a la saliva de garrapatas por inyección intradérmica y luego se alimentan con alimento para perros, que contiene productos derivados de la carne de mamíferos adecuados para uso animal que contienen α-Gal27, luego se evalúan posibles reacciones alérgicas relacionadas. Este método se puede aplicar al estudio de otras biomoléculas relacionadas con procesos alérgicos, especialmente las relacionadas con AGS.

<table><tbody><tr><td>Tubo de 1,5 ml</td><td>VWR</td><td>525-0990</td><td></td></tr><tr><td>All Prep DNA/RNA</td><td>Qiagen</td><td>80284</td><td></td></tr> Kit de ensayo de proteínas BCA para <tr><td>instalaciones</td><td></td><td></td><td></td>acuáticas</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Juego de disección</td><td>VWR</td><td>631-1279</td><td></td></tr><tr><td>Alimento para perros - Red Classic</td><td>Acana</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas ELISA-96 pocillos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10547781</td><td></td></tr><tr><td>Gala1-3Gal-BSA 3 (&alpha;-Gal)&nbsp;</td><td>Dextra</td><td>NGP0203</td><td></td></tr><tr><td>iScript Transcripción inversa Supermix</td><td>Supermix</td><td>1708840</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas de microlitros</td><td>Hamilton</td><td>7638-01</td><td></td></tr><tr><td>Lector de placas</td><td>cualquier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>clorhidrato de pilocarpina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6503</td><td></td></tr><tr><td>Punta de pipeta P10&nbsp;</td><td>VWR</td><td>613-0364</td><td></td></tr><tr><td>Punta de pipeta P1000</td><td>VWR</td><td>613-0359</td><td></td></tr><tr><td>Alimento premium peces tropicales</td><td>DAPC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Esponja Soporte para animales&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Hecho de espuma de desecho</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td>, <td>cualquier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>termociclador, PCR en tiempo real,</td><td>cualquier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>metanasulfonato de tricaína (MS-222)</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr></tbody></table>

modelo animal de pez cebra para el estudio de reacciones alérgicas en respuesta a biomoléculas de saliva de garrapatas

Zebrafish Animal Model for the Study of Allergic Reactions in Response to Tick Saliva Biomolecules

Las garrapatas son artrópodos vectores que causan enfermedades por transmisión de patógenos y cuyas picaduras podrían estar relacionadas con reacciones alérgicas que afectan la salud humana en todo el mundo. En algunos individuos, altos niveles de anticuerpos de inmunoglobulina E contra el glicano Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) han sido inducidos por picaduras de garrapatas. Las reacciones anafilácticas mediadas por glicoproteínas y glicolípidos que contienen el glicano α-Gal, presentes en la saliva de garrapatas, están relacionadas con el síndrome alfa-Gal (AGS) o alergia a la carne de mamíferos. El pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en un modelo vertebrado ampliamente utilizado para el estudio de diferentes patologías. En este estudio, el pez cebra se utilizó como modelo para el estudio de las reacciones alérgicas en respuesta al consumo de carne de α-Gal y mamíferos porque, al igual que los humanos, no sintetizan este glicano. Para este propósito, se evaluaron los patrones de comportamiento y las reacciones alérgicas de tipo anafiláctico hemorrágico en respuesta a la saliva de la garrapata Ixodes ricinus y el consumo de carne de mamíferos. Este enfoque experimental permite la obtención de datos válidos que respaldan el modelo animal de pez cebra para el estudio de alergias transmitidas por garrapatas, incluido el AGS.

El protocolo aquí presentado se basa en varios aspectos de experimentos previamente publicados27,30 y resultados realizados en nuestro laboratorio donde se establece y valida el modelo de pez cebra para el estudio del AGS y la respuesta inmune al α-Gal porque tanto los humanos como el pez cebra no sintetizan esta molécula13. Este modelo permite la caracterización y evaluación de una variedad de reacciones alérgicas como resultado de la res...

Aquí, el pez cebra (Danio rerio) se utiliza como modelo para estudiar las reacciones alérgicas y las respuestas inmunes relacionadas con el síndrome alfa-Gal (AGS) mediante la evaluación de las reacciones alérgicas a la saliva de garrapatas y el consumo de carne de mamíferos.

Modelo animal de pez cebra para el estudio de reacciones alérgicas en respuesta a biomoléculas de saliva de garrapatas

Ticks are arthropod vectors that cause disease by pathogen transmission and whose bites could be related to allergic reactions impacting human health ...

La pregunta es por qué solo algunas personas expuestas a picaduras de garrapatas desarrollan reacciones alérgicas. Para nosotros, dilucidar las biomoléculas en la saliva de garrapatas y los mecanismos inmunes que involucran este proceso es clave para abordar esta pregunta. El modelo animal de pez cebra del síndrome alfa-Gal reproduce patrones de comportamiento humano y reacciones alérgicas en respuesta a la saliva de la garrapata.Este enfoque experimental avanza en la comprensión de la interacción molecular garrapata-huésped en la que tenemos conflicto asociado con el síndrome alfa-Gal y la cooperación asociada con la respuesta de anticuerpos a alfa-Gal, que protegen contra la infección por patógenos. Para tratar a los peces con saliva de garrapata, distribuya el pez cebra adulto en tres grupos con equilibrio de género. Utilice Gala1-3Gal-BSA 3 comercial o alfa-Gal como control positivo y PBS como control negativo.Para la extracción de saliva, use garrapatas hembras semi-hinchadas, libres de patógenos, alimentadas durante seis a siete días con conejillos de indias. Trate la garrapata con cinco microlitros de una solución al 2% de clorhidrato de pilocarpina en PBS a pH 7.4 en el hemocoel usando una jeringa de 50 microlitros con una aguja de 0.33 milímetros. Recoja saliva del hipostoma de garrapatas usando una punta de 10 microlitros montada en una micropipeta.Coloque la saliva en un tubo de 1,5 mililitros sobre hielo y guárdela a menos 80 grados centígrados. Determine la concentración de proteína salival para establecer la cantidad de proteína que se inyectará en el pescado utilizando un kit de ensayo de proteína BCA, siguiendo las recomendaciones del fabricante. Mantenga el pez cebra en un sistema de agua de flujo continuo a 27 grados centígrados con un ciclo de luz-oscuridad de 14 a 10 horas.A continuación, seleccione 10 peces por grupo con una proporción similar de hembras a machos y un peso similar para la inyección. Anestesiar brevemente el pescado por inmersión en metanosulfonato de tricaína al 0,02%. Coloque el pez anestesiado en su mitad de lado usando fórceps o manos con cuidado, sobre una esponja húmeda, con la aleta caudal en el lado derecho para inyectar los compuestos en la misma dirección para controlar las lesiones.Inyecte grupos de peces por vía intradérmica en el músculo con una jeringa de 100 microlitros equipada con una aguja de calibre 29 de un centímetro a cinco milímetros de la aleta caudal y un ángulo de 45 grados con respecto al cuerpo del pez. Después de la inyección, coloque el pescado tratado nuevamente en un tanque de agua dulce sin anestesia para su recuperación. Alimente a los peces dos veces al día a las 9:30 a.m.y 1:30 p.m. con 50 a 70 microgramos de alimento para peces secos por pez hasta el segundo día. Luego triture la comida para perros con un mortero para alimentar a los peces desde el segundo día después de la inyección del tratamiento hasta el final del experimento en el día ocho.Para la recolección de muestras, fije el pescado sacrificado en una placa de parafina con alfileres. Recoja el suero de los vasos sanguíneos branquiales de los peces cuando las branquias todavía estén irrigadas con sangre utilizando una jeringa de 0,5 mililitros equipada con una aguja de calibre 29 de un centímetro. Guarde el suero recolectado en un tubo de 1.5 mililitros a 20 grados centígrados hasta que lo use.Corte el pescado sagitalmente con una cuchilla de bisturí y evalúe las lesiones internas. Luego recoja el intestino y el riñón de cada pez en tubos separados de 1.5 mililitros. Extraiga el ARN total del intestino y el riñón utilizando un kit de purificación de ARN.Analizar la expresión de genes relacionados con la respuesta inmune, realizando una reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa con transcripción inversa o RT-qPCR utilizando una mezcla de transcripción inversa para RT-qPCR, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Normalizar los valores de mRNA cT contra el pez cebra GAPDH, y comparar entre grupos utilizando una prueba t de Student con varianza desigual. Determinar los títulos de anticuerpos IgM que reconocen alfa-Gal en muestras de suero mediante ELISA.Registre los títulos de anticuerpos como valores de densidad óptica de 450 nanómetros utilizando un lector de placas, y compare entre grupos utilizando una prueba t de Student con varianza desigual. Este modelo de pez cebra permite la caracterización y evaluación de diversas reacciones alérgicas debidas a la respuesta del huésped a la saliva de la garrapata y su implicación en el síndrome alfa-Gal, o AGS. Además, en comparación con el pez control, se observaron alteraciones en comportamientos como nadar lentamente, acostarse en el fondo del tanque y no comer, vibrar o zigzaguear en el movimiento en peces tratados con saliva de garrapata.Se observó una incidencia significativa de reacciones alérgicas en peces tratados con saliva de garrapata, mostrando una rápida desensibilización y tolerancia. El cambio de comportamiento fue más pronunciado en los peces tratados con saliva de garrapatas que solo con alfa-Gal. El análisis adicional de la expresión de los marcadores inmunes representativos se realizó mediante RT-PCR.Los resultados mostraron diferencias entre los grupos de pez cebra en el riñón, donde los marcadores de respuesta inmune se regularon negativamente en los peces tratados con saliva y alfa-Gal en comparación con el grupo de control. Además, el pez cebra tratado con saliva y alfa-Gal desarrolló anticuerpos IgM contra alfa-Gal que mostraron niveles más altos que en los peces tratados con PBS. La inyección del tratamiento, la evaluación de las reacciones alérgicas y el comportamiento, y el informe del número de peces muertos por reacciones alérgicas son el aspecto más importante del protocolo.El uso de tecnologías ómicas a nivel de ARNm, proteína y microbioma para caracterizar la respuesta a la saliva de garrapatas nos permite identificar las biomoléculas clave involucradas en este proceso.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

La colección de la hemolinfa garrapata infectada, las glándulas salivales y la saliva es importante para estudiar la forma transmitida por garrapatas patógenos causan enfermedades. En este protocolo se demuestra cómo recoger las glándulas salivales y la hemolinfa de la...

La saliva, la glándula salival, y la Colección hemolinfa de las garrapatas Ixodes scapularis

La respuesta inmune innata protege a los organismos contra la infección por patógenos. Un componente fundamental de la respuesta inmune innata, el estallido respiratorio de fagocitos, genera especies reactivas del oxígeno que matan los microorganismos invasores. Se describe un ensayo de estallido respiratorio que cuantifica las especies reactivas del oxígeno producido cuando la respuesta inmune innata es inducida químicamente.

Cuantificación de la respuesta estallido respiratorio como un indicador de la salud inmune innata en el pez cebra

Aquí, presentamos un protocolo para la generación y obtención de imágenes de una infección bacteriana localizada en la vesícula ótica del pez cebra.

Imagen no invasiva de la respuesta inmune innata en un modelo de larvas de pez cebra de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infección

Aquí, presentamos un protocolo de tuberculosis humana modelo en un pez cebra adulto utilizando su patógeno natural marinum de la micobacteria. Extraen ADN y ARN de los órganos internos del pez cebra infectado pueden utilizarse para revelar que el total de micobacterias cargas en los peces y la respuesta inmune del hospedador con qPCR.

Modelado de la Tuberculosis de Mycobacterium marinum infección pez cebra adulto

Aquí se describe un protocolo para la inmunización del adulto pez cebra (Danio rerio) con una vacuna de ADN y demostrar la validación de un evento de éxito de la vacunación. Este método es adecuado para la investigación preclínica de candidatos vacunales en varios modelos de infección.

Inmunización de pez cebra adulto para la evaluación preclínica de vacunas basadas en ADN

Este protocolo describe un modelo de infección por Aspergillus en larvas de pez cebra. Las esporas de Aspergillus se microinyectan en el cerebro posterior de las larvas, y el tratamiento químico se utiliza para inducir la inmunosupresión. La progresión de la infección se supervisa a través de una configuración de imágenes diaria para controlar el crecimiento de hongos y las respuestas inmunitarias, así como la enumeración de esporas vivas por la colonia que forma el revestimiento de la unidad.

Infección De Larvas De Pez Cebra Con Esporas De Aspergillus Para El Análisis De Las Interacciones Huésped-Patógeno

En este artículo se presenta la metodología para la exposición de humanos a larvas de Ixodes scapularis para investigación clínica. La técnica es relativamente simple, tolerable por los voluntarios de investigación, y puede ser modificada de acuerdo con las necesidades experimentales. Dicha investigación con seres humanos debe llevarse a cabo bajo protocolos de estudio clínico aprobados por las autoridades reguladoras correspondientes.

Un modelo para la exposición experimental de humanos a larvas de garrapatas Ixodes scapularis

Aquí, presentamos un protocolo para recolectar saliva, hemolinfa, glándulas salivales e intestino medio, después de la disección de una garrapata alimentada individualmente, para estudiar la localización específica del tejido de los patógenos transmitidos por garrapatas para avanzar en la comprensión de la competencia del vector y las interacciones patógeno-microbioma.

Extracción de saliva, hemolinfa, glándulas salivales e intestino medio de garrapatas individuales (Acari: Ixodidae)

Este método describe el desarrollo de un sistema de alimentación sanguínea in vitro para garrapatas que incorpora una cámara impresa en 3D y una membrana de silicona fabricada en laboratorio. El sistema permite la alimentación artificial de garrapatas, facilitando el muestreo en diversas fases de alimentación y utilizando bajos volúmenes de sangre, proporcionando una herramienta invaluable para estudiar garrapatas ixódidas.

Sangre de garrapata alimentándose a través de una membrana artificial en una cámara impresa en 3D en investigación de garrapatas Ixodid

Para modelar cómo las señales inflamatorias influyen en el neurodesarrollo en organismos genéticamente susceptibles, presentamos un protocolo para microinyectar IL-6 en el conducto de Cuvier (vena cardinal común) de larvas de pez cebra, permitiendo la inducción controlada de la inflamación y la evaluación de su impacto en el desarrollo en el contexto del complejo de esclerosis tuberosa (TSC).

Microinyección de interleucina-6 en el torrente sanguíneo de larvas de pez cebra con TSC para estudiar comportamientos similares a trastornos neuropsiquiátricos

Explore el modelo de pez cebra para estudiar reacciones alérgicas inducidas por saliva de garrapatas y el síndrome alfa-Gal. Este método permite identificar biomoléculas clave y mecanismos inmunitarios involucrados.

Modelo animal de pez cebra para el estudio de reacciones alérgicas en respuesta a biomoléculas de saliva de garrapatas

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