Name: Un modelo de ratón de intubación orotraqueal y cirugía de reperfusión de isquemia pulmonar ventilada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Aprenda un modelo quirúrgico de isquemia-reperfusión pulmonar ventilada en ratón para estudiar la patofisiología pulmonar específica. Esta técnica microquirúrgica minimiza la inflamación por atelectasia e hipoxia, manteniendo el sistema inmune circulatorio intacto.

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Este trabajo fue financiado por el apoyo departamental del Departamento de Anestesia y Atención Perioperatoria, la Universidad de California en San Francisco y el Hospital General de San Francisco, así como por un premio NIH R01 (a AP): 1R01HL146753.

Todos los procedimientos y pasos descritos a continuación fueron aprobados por el comité institucional de cuidado y uso de animales (IACUC) de la Universidad de California en San Francisco. Se puede utilizar cualquier cepa de ratón, aunque algunas cepas tienen una respuesta inflamatoria IR pulmonar más robusta en comparación con otras12. Los ratones que tienen aproximadamente 12-15 semanas de edad (30-40 g) o más toleran y sobreviven a la cirugía IR pulmonar mejor que los ratones más jóvenes. Tanto los ratones machos como las hembras se pueden usar para estas cirugías.
1. Protocolo de intubación del ratón
<ol><li>Anestesia y preparación para la intubación<ol><li>Limpie el abdomen del ratón con un hisopo de etanol. Anestesiar al ratón con una inyección intraperitoneal de tribromoetanol (250-400 mg/kg). Evaluar la profundidad apropiada de la anestesia por la falta de reflejo de retirada del pedal. Coloque la pomada lubricante para los ojos ahora o más tarde (paso 2.1.4). NOTA: Para este procedimiento, el tribromoetanol (y el etomidato como una opción alternativa) proporciona un plano anestésico estable sin afectar las condiciones hemodinámicas requeridas para esta cirugía. Este anestésico solo se usa una vez para evitar el riesgo de adherencias peritoneales. El isoflurano también podría usarse, pero no lo usamos aquí. El practicante es libre de usar cualquier receta anestésica que considere adecuada.</li>
		<li>Coloque el ratón anestesiado en un soporte de intubación o soporte de plástico en posición supina, suspendido por sus incisivos superiores en suturas 4-0 en bucle (seda u otras) a través de dos anclajes de soporte.</li>
		<li>Para mantener al ratón inmovilizado durante el procedimiento de intubación, pegue con cinta adhesiva la parte inferior del tórax (o ambas extremidades superiores) a la plataforma.</li>
		<li>Coloque la luz flexible de fibra óptica suavemente sobre la tráquea del ratón, ligeramente por debajo de las cuerdas vocales. Ajuste el nivel de iluminación para que solo se vea un campo oscuro cuando se mira dentro de la orofaringe del ratón, excepto la luz roja que emana de debajo de las cuerdas vocales, demostrando el objetivo para la eventual colocación del tubo endotraqueal. Tenga en cuenta que los movimientos de las cuerdas vocales deben ser visibles a simple vista o, si es necesario, bajo aumento.</li>
	</ol></li>
	<li>Procedimiento de intubación<ol><li>Sostenga las pinzas con la mano dominante y úselas para agarrar suavemente y sacar la lengua de la cavidad oral.</li>
		<li>Abra la mandíbula inferior con fórceps sostenidos por la mano no dominante y luego empuje los fórceps hacia la laringe para levantar suavemente la epiglotis. En este momento, suelte la lengua de las pinzas.</li>
		<li>Busca las cuerdas vocales. Deben abrirse y cerrarse de acuerdo con cada respiración. Sosteniendo la cánula con el alambre guía precargado, inserte la punta del cable a través de las cuerdas vocales.</li>
		<li>Teniendo mucho cuidado de no mover el alambre sosteniendo una porción que está fuera de la cánula pero justo por encima de las cuerdas vocales, retire la cánula, dejando solo el cable en su lugar con su extremo distal dentro de la tráquea.</li>
		<li>En este punto, realice una segunda visualización de las cuerdas vocales para confirmar que la punta distal del alambre permanece pasada a través de las cuerdas vocales iluminadas y hacia la tráquea, y no está en el esófago no iluminado.</li>
		<li>Sostenga el alambre fuera de la boca con las pinzas curvas en la mano izquierda, estabilizado contra una superficie dura, y avance cuidadosamente el catéter 20G con alas de cinta sobre el cable.</li>
		<li>Una vez que el extremo distal del alambre emerja del extremo posterior del catéter 20G o tubo endotraqueal, sostenga ese extremo con los fórceps curvos y avance suavemente el catéter 20G hacia la tráquea.</li>
		<li>Retire con cuidado el cable del extremo distal del catéter 20G con las pinzas curvas sin desalojar la colocación del catéter.</li>
		<li>Conecte brevemente el catéter al ventilador antes de asegurarlo para confirmar la colocación adecuada en la tráquea y no en el esófago. Confirmar la colocación traqueal mediante la observación de movimientos bilaterales de la pared torácica dependientes de la ventilación mecánica y la ausencia de inflado del estómago.</li>
	</ol></li>
	<li>Post-intubación<ol><li>Desconecte el catéter del ventilador. Fije las alas de la cinta (unidas al catéter) a través del labio inferior del ratón con una sutura de vicryl 4-0 para asegurar firmemente el tubo endotraqueal (ETT) al ratón durante todos los procedimientos/manipulaciones posteriores. NOTA: Alternativamente, se puede usar cinta de seda u otra cinta para asegurar el ETT, sin embargo, se debe tener cuidado para evitar el desplazamiento del ETT durante el movimiento del animal desde el trineo de intubación hasta la superficie quirúrgica.</li>
		<li>Retire con cuidado el ratón del trineo de intubación. Conecte brevemente el catéter al ventilador configurado a un volumen tidal de 0.2-0.225 ml y una frecuencia respiratoria de 120-150 respiraciones por minuto para confirmar la colocación traqueal correcta del tubo orotraqueal y luego desconecte con el ratón respirando espontáneamente a través del tubo orotraqueal.</li>
		<li>No deje al animal desatendido a partir de este momento hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal al final del procedimiento.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Protocolo quirúrgico de isquemia pulmonar y reperfusión (RI)
<ol><li>Analgesia y preparación del sitio quirúrgico<ol><li>Limpie el abdomen del ratón con un hisopo de etanol e inyecte buprenorfina (0.05-0.1 mg / kg) por vía intraperitoneal.</li>
		<li>Afeite el vello sobre el área izquierda del tórax hasta la escápula izquierda. Elimine el exceso de vello afeitado con hisopos con alcohol. NOTA: Los pasos 2.1.1 y 2.1.2 también se pueden realizar antes de la intubación si existe preocupación por el desplazamiento del ETT cuando se asegura con cinta de seda.</li>
		<li>Coloque el ratón en una almohadilla de calentamiento en una posición lateral izquierda o 3/4 girada y conecte el tubo traqueal en el ventilador con un volumen corriente de 0.2-0.225 ml (~ 8 mg / kg) y una frecuencia respiratoria de 120-150 respiraciones por minuto. No use oxígeno suplementario para este procedimiento.</li>
		<li>Aplique lubricante para los ojos con un hisopo estéril de punta de algodón. Gire el ratón a 3/4 del lado izquierdo hacia arriba e inmovilice las cuatro extremidades y la cola con cinta de laboratorio.</li>
		<li>Desinfecte el área de la piel afeitada y el pelaje circundante con povidona yodada y espere a que la solución se seque. Luego cubra el campo quirúrgico con una cortina estéril o una película de plástico transparente y cree una abertura rectangular en la cortina o película plástica para el campo quirúrgico.</li>
	</ol></li>
	<li>Procedimiento quirúrgico<ol><li>Confirme el nivel apropiado de anestesia (proporcionado por la administración de tribromoetanol y buprenorfina como se describió anteriormente) mediante la prueba de respuesta al pellizco del dedo del pie.</li>
		<li>Usando un par de tijeras afiladas y un par de pinzas más grandes (pinzas de patrón estrecho o similares), haga una incisión transversal de piel de 2 cm por debajo del ángulo inferior de la escápula en el tórax lateral izquierdo. Use las tijeras y un par más fino de fórceps (pinzas graefe extra finas o similares) para cortar la capa muscular y diseccionar hasta las costillas.</li>
		<li>Identifique el segundo espacio intercostal y sostenga la segunda costilla con las pinzas extra finas. Tirando de la costilla hacia arriba, use una hoja de bisturí estéril #11 o #12 (curva) (sin necesidad de mango) para ingresar al espacio pleural separando y cortando los músculos intercostales del espacio 2º-3º. Considere pausar la ventilación para reducir la lesión en el ápice pulmonar izquierdo.</li>
		<li>Inserte tres retractores esterilizados. Use la cefalada retractora más pequeña/más estrecha a lo largo de la orientación de las costillas, el retractor de tamaño mediano a la izquierda a lo largo de la 2ª costilla y el retractor más grande a la derecha a lo largo de la superficie de la3ª costilla.</li>
		<li>Abra el pecho con una retracción lenta y progresiva utilizando los cordones retractores elásticos. Exponga e identifique la arteria pulmonar izquierda (PA) alejando el ápice pulmonar izquierdo con un hisopo estéril de punta de algodón.</li>
		<li>Use los micro fórceps, los fórceps ultrafinos en la mano derecha y la PA o las pinzas dilatadoras de vasos en la mano izquierda, para exponer suavemente y crear el campo en el que la PA izquierda y el bronquio son visibles.</li>
		<li>Usando los fórceps de PA, levante el PA izquierdo y tire suavemente pero firmemente hacia arriba y cefálico para visualizar el bronquio transparente debajo. Aumente el aumento en el microscopio de disección (consulte la lista de equipos para obtener más detalles) en este punto hasta el máximo (2x). NOTA: Esterilice todo el equipo antes de usarlo. Además, para mantener la esterilidad, solo las puntas de los instrumentos quirúrgicos deben ingresar al campo quirúrgico estéril.</li>
		<li>Mientras retrae la PA lejos del bronquio, pase cuidadosamente las pinzas ultrafinas cerradas a través del espacio entre la PA izquierda y el bronquio. Luego, use estos fórceps para sostener y tirar de un 7-0 u 8-0 Sutura de Proleno a través del espacio entre la arteria pulmonar izquierda (arriba) y el bronquio (abajo).</li>
		<li>Rodee el PA izquierdo atando un nudo deslizante para crear una oclusión en el PA. La interrupción del flujo sanguíneo se visualiza fácilmente bajo el microscopio. Esto marca el inicio del período isquémico.</li>
		<li>Externalice el extremo libre del nudo a través de un punto de entrada diferente en el tórax izquierdo anterior con una aguja 24G-28G y asegure el extremo de la sutura con un pequeño trozo de cinta para facilitar la identificación más adelante.</li>
		<li>Vuelva a inflar el pulmón para expulsar la mayor cantidad de aire posible de la cavidad torácica utilizando una válvula / tubo PEEP en el ventilador para roedores. Luego, cierre la caja torácica con dos suturas de nylon 4-0 interrumpidas.</li>
		<li>Cierre el músculo y la capa subcutánea con una sutura de nylon 4-0. Luego aplique dos o tres gotas de bupivacaína tópica (0.5%) en la incisión. Use una sutura de nylon 4-0 para cerrar la capa de piel con una sutura para correr.</li>
	</ol></li>
	<li>Cuidados postoperatorios<ol><li>Cuando se haya reanudado la ventilación espontánea, desconecte el tubo endotraqueal del ventilador y extube al ratón.</li>
		<li>Coloque el ratón en la almohadilla de calentamiento para mantener la temperatura corporal durante la recuperación temprana posterior a la anestesia.</li>
		<li>Controle cuidadosamente al ratón mientras se recupera de la anestesia general. Tire del nudo deslizante exteriorizado suavemente al final del período isquémico (30 min o 1 h).</li>
		<li>Mueva el ratón de la almohadilla de calentamiento a una jaula una vez que haya mostrado signos de recuperación: autoenderezamiento y/o movimiento.</li>
		<li>Después del período de reperfusión (1 h o 3 h), sacrificar al animal y recolectar sangre por punción cardíaca y tejido pulmonar para su posterior análisis. Para 1 h de reperfusión, recolectar plasma para ELISA, tejido para ARN y análisis de proteínas; Para la reperfusión de 3 h, además recolectar tejido para histología.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Este manuscrito detalla los pasos involucrados en la realización del modelo IR de pulmón ventilado desarrollado por Dodd-o et al.9. Este modelo ha ayudado a identificar vías moleculares implicadas en la generación y resolución de la inflamación de la RI pulmonar aislada 14,15,16,17, la RI pulmonar en combinación con la infección coexistente 18, y la RI pulmonar en relación con el eje intestino-pulmón y la contribución del microbioma intestinal13,18,19</sup...

La lesión por isquemia reperfusión (RI) puede ocurrir cuando se restablece el flujo sanguíneo a un órgano o lecho de tejido después de un período de interrupción. En el pulmón, la RI puede ocurrir de forma aislada o en asociación con otros procesos perjudiciales como infección, hipoxia, atelectasia, volutrauma (por volúmenes corrientes altos durante la ventilación mecánica), barotrauma (altas presiones máximas o sostenidas durante la ventilación mecánica) o lesión por contusión pulmonar contundente (no penetrante) 1,2,3 . Sigue habiendo varias lagunas en el conocimiento acerca de los mecanismos de LIRI y el impacto de los procesos concurrentes (p.ej., infección) en los resultados de LIRI, y también las opciones de tratamiento para LIRI son limitadas. Se requiere un modelo in vivo de LIRI puro para identificar la fisiopatología de la lesión pulmonar IR de forma aislada y para estudiar su contribución a cualquier proceso de múltiples golpes del cual la lesión pulmonar sea un componente.
Los modelos de IR pulmonar murina se pueden utilizar para estudiar la fisiopatología específica del pulmón de múltiples procesos, incluido el trasplante pulmonar3, la embolia pulmonar4 y la lesión pulmonar después de un traumatismo hemorrágico con reanimación5. Los modelos utilizados actualmente incluyen trasplante quirúrgico de pulmón6, pinzamiento hiliar7, perfusión pulmonar ex vivo 8 y pulmón ventilado IR9. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para un modelo IR pulmonar ventilado murino de lesión pulmonar estéril. Hay múltiples beneficios de este enfoque (Figura 2), incluyendo que induce hipoxia mínima y atelectasia mínima, y es un modelo de cirugía de supervivencia que permite estudios a largo plazo.
Las razones para elegir este modelo de LIRI sobre otros modelos como el pinzamiento hiliar y los modelos de perfusión ex vivo son las siguientes: este modelo minimiza las contribuciones inflamatorias de la atelectasia, la ventilación mecánica y la hipoxia; preserva la ventilación cíclica; mantiene intacto el sistema inmunitario circulatorio in vivo que puede responder a la lesión IR; y, por último, como procedimiento de supervivencia, permite el análisis a más largo plazo de los mecanismos de generación de lesiones secundarias (modelos de 2 golpes) y la resolución de lesiones. En general, creemos que este modelo IR de pulmón ventilado proporciona la forma "más pura" de lesión IR que se puede estudiar experimentalmente.
Otras publicaciones han descrito el uso de la intubación orotraqueal de ratones para realizar inyecciones o instalaciones IT10,11, pero no como punto de partida para una cirugía de supervivencia como lo es en este modelo. La colocación de un tubo orotraqueal permite la realización de la cirugía pulmonar al permitir el colapso del pulmón operatorio. También permite la reinflación del pulmón al final del procedimiento, lo cual es crítico para el neumotórax y para la capacidad del ratón para volver a la ventilación espontánea al final de los procedimientos. Finalmente, la extracción del tubo orotraqueal asegurado es un procedimiento simple que, a diferencia de una traqueotomía invasiva, es compatible con una cirugía de supervivencia. Esto permite estudios de investigación a largo plazo centrados en la comprensión de la progresión y resolución de LIRI y trastornos asociados, así como la creación de modelos de lesiones crónicas.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Equipo</fuerte>Tubo de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>luz de fibra óptica</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-41720-65 Tubo de</td><td>luz de fibra</td></tr><tr><td>óptica Fuente de luz de fibra óptica</td><td>AmScope</td><td>SKU: CL-HL250-B Fuente de</td><td>luz para luces de fibra óptica</td></tr><tr><td>Germinador 500</td><td>Cell Point Scientific, Inc.</td><td>No.5-1450</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td> del esterilizador de perlas <td>AIMS</td><td>14-370-223</td><td>Opción alternativa</td></tr><tr><td>Kits de aseo de iones de litio (cortadora de pelo)</td><td>WAHL productos para el hogar</td><td>SKU 09854-600B</td><td>Para eliminar el pelo del ratón en el sitio quirúrgico</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Nikon</td><td>SMZ-10</td><td>Otras opciones más nuevas disponibles en el sitio web de la empresa</td></tr><tr><td>Modelo de aparato Havard MiniVent Ventilator</td><td></td><td> 845</td><td>Ventilador de ratón</td></tr><tr><td>Limpiador ultrasónico</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-08895-05</td><td>Limpie las herramientas que se han utilizado en el funcionamiento</td></tr><tr><td>Almohadilla de calentamiento</td><td>Kent Scientific</td><td>RT-0501</td><td>Para mantener caliente al ratón mientras se recupera de una cirugía</td></tr><tr><td>Báscula de pesaje</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-11003-41</td><td>Báscula de pesaje</td></tr><tr><td><fuerte>Herramientas de cirugía</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-0 Sutura de seda</td><td>Ethicon</td><td>683G</td><td>Para el cierre de la capa muscular</td></tr><tr><td>7-0 Sutura Prolene</td><td>Ethicon Industry EP8734H</td><td></td><td>Uso para hacer un nudo corredizo de la arteria pulmonar izquierda</td></tr><tr><td>Bard-Parker (11) Bisturí (Cuchilla quirúrgica de acero al carbono con espalda acanalada, estéril, de un solo uso)</td><td>Aspen Surgical</td><td>372611</td><td>Para entrar en la cavidad torácica (opción 1)</td></tr><tr><td>Bard-Parker (12) Bisturí</td><td>Aspen Surgical</td><td>372612</td><td>Para entrar en la cavidad torácica (opción 2)</td></tr><tr><td>Pinza de Graefe extrafina</td><td>FST</td><td>11150-10</td><td>Pinza de sujeción de músculos/costillas</td></tr><tr><td>Sistema de retracción con fijador magnético</td><td>FST</td><td>1. Placa base (Nº 18200-03) 2. Fijadores (Nº 18200-01) 3. Retractores (Nos. 18200-05 a 18200-12) 4. Elastómero (Nos.18200-07) 5. Retractor (No.18200-08)Sistema de</td> <td>retracción para animales pequeños</td></tr><tr><td>Monoject Aguja hipodérmica estándar</td><td>COVIDIEN</td><td>05-561-20</td><td>Para la administración de medicamentos</td></tr><tr><td>Pinzas de patrón estrecho</td> IP <td>FST</td><td>11002-12</td><td>Pinzas a nivel de la piel</td></tr><tr><td>Portaagujas/Destornillador de agujas</td><td>FST</td><td>12565-14</td><td>para sujetar agujas</td></tr><tr><td>Agujas</td><td>BD</td><td>305110</td><td>Aguja de calibre 26 para externalizar el nudo corredizo (la aguja de calibre 24 o 26 también está bien)</td></tr><tr><td>PA / Vaso Pinza de dilatación</td><td>FST</td><td>00125-11</td><td>Para sujetar PA; pinza no dañina</td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>FST</td><td>14060-09</td><td>Se utiliza para incisiones y cortes en la cirugía de drenaje de la capa muscular</td></tr><tr><td>Pinzas ultrafinas Dumont micro fórceps</td><td>FST</td><td>11295-10 (pinzas Dumont # 5, punta de biología, dimensión de la punta: 0,05 * 0,02 mm, 11 cm)</td><td>Para pasar a través del espacio entre la arteria pulmonar izquierda y los bronquios</td></tr><tr><td><reactivos fuertes> </fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.25% Bupivacaína</td><td>Hospira, Inc.</td><td>0409-1159-02</td><td>Analgésico tópico utilizado durante el cierre de heridas quirúrgicas</td></tr><tr><td>Avertin (2,2,2-Tribromoetanol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402-25G</td><td>Anestésico, utilizado para anestesiar al ratón para la cirugía IR, la concentración utilizada en la cirugía IR es de 250-400 mg / kg.</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Covetrus North America</td><td>59122</td><td>Analgésico: la concentración utilizada para la cirugía es de 0,05-0,1 mg/kg</td></tr><tr><td>Eye Lubricant</td><td>BAUSCH+LOMB</td><td>Omada Ocular Lubricante</td><td>Calmante Alivia la sequedad ocular</td></tr><tr><td>Povidona Yodada 10% Solución</td><td>MEDLINE INDUSTRIES INC</td><td>SKU MDS093944H (2 FL OZ, antiséptico tópico)</td><td>Líquido tópico aplicado para un antiséptico eficaz de primeros auxilios al comienzo de la cirugía</td></tr><tr><td><fuerte>Materiales</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcohol Swab</td><td>BD marca</td><td>&nbsp; BD 326895</td><td>para la esterilización de la zona de inyección y cirugía</td></tr><tr><td>Película plástica</td><td>KIRKLAND</td><td>Stretch-Tite premium</td><td>Alternativa para cubrir el campo quirúrgico esterilizado (más rentable)</td></tr><tr><td>Paños quirúrgicos para roedores</td><td>Stoelting</td><td>50981</td><td>Campo estéril o paño para campo quirúrgico</td></tr><tr><td>Aplicación estéril con punta de algodón</td><td>Pwi-Wnaps</td><td>703033</td><td>utiliza para aplicar lubricante ocular</td></tr><tr><td>Top Esponjas</td><td>Dukal Corporaton</td><td>Reorder # 5360</td><td>Detener el sangrado de la piel/músculo</td></tr></tbody></table>

un modelo de ratón de intubación orotraqueal y cirugía de reperfusión de isquemia pulmonar ventilada

A Mouse Model of Orotracheal Intubation and Ventilated Lung Ischemia Reperfusion Surgery

La lesión por isquemia de reperfusión (RI) con frecuencia resulta de procesos que implican un período transitorio de flujo sanguíneo interrumpido. En el pulmón, la RI aislada permite el estudio experimental de este proceso específico con ventilación alveolar continua, evitando así los procesos perjudiciales compuestos de hipoxia y atelectasia. En el contexto clínico, la lesión por isquemia pulmonar por reperfusión (también conocida como IRI pulmonar o LIRI) es causada por numerosos procesos, que incluyen, entre otros, embolia pulmonar, traumatismo hemorrágico resucitado y trasplante pulmonar. Actualmente hay opciones de tratamiento efectivas limitadas para LIRI. A continuación, presentamos un modelo quirúrgico reversible de IR pulmonar que incluye la primera intubación orotraqueal seguida de isquemia pulmonar izquierda unilateral y reperfusión con ventilación alveolar preservada o intercambio gaseoso. Los ratones se someten a una toracotomía izquierda, a través de la cual la arteria pulmonar izquierda se expone, visualiza, aísla y comprime usando un nudo deslizante reversible. La incisión quirúrgica se cierra durante el período isquémico, y el animal es despertado y extubado. Con el ratón respirando espontáneamente, la reperfusión se establece liberando el nudo deslizante alrededor de la arteria pulmonar. Este modelo de supervivencia clínicamente relevante permite la evaluación de la lesión pulmonar IR, la fase de resolución, los efectos posteriores sobre la función pulmonar, así como los modelos de dos golpes que involucran neumonía experimental. Si bien técnicamente es un desafío, este modelo se puede dominar en el transcurso de unas pocas semanas o meses con una eventual tasa de supervivencia o éxito del 80% -90%.

Inflamación generada por lesión unilateral ventilada estéril por isquemia pulmonar (RI): Después de 1 h de isquemia, observamos un aumento de los niveles de citoquinas en el suero y dentro del tejido pulmonar tanto por ELISA como por qRT-PCR que alcanzó su punto máximo a 1 h después de la reperfusión y regresó rápidamente a la línea de base dentro de las 12-24 h después de la reperfusión13. Para las muestras recogidas a las 3 h después de la reperfusión, observamos una intensa infiltración de neut...

Un modelo quirúrgico de ratón para crear una lesión por isquemia de reperfusión (RI) del pulmón izquierdo mientras se mantiene la ventilación y se evita la hipoxia.

Un modelo de ratón de intubación orotraqueal y cirugía de reperfusión de isquemia pulmonar ventilada

Ischemia reperfusion (IR) injury frequently results from processes that involve a transient period of interrupted blood flow. In the lung, isolated IR ...

La cirugía de isquemia-reperfusión pulmonar ventilada se puede utilizar para estudiar la fisiopatología específica del pulmón de múltiples procesos, incluido el trasplante de pulmón, la embolia pulmonar y la lesión pulmonar después de un traumatismo hemorrágico con reanimación. Este modelo minimiza las contribuciones inflamatorias de la atelectasia, la ventilación mecánica y la hipoxia. Mantiene intacto el sistema inmune circulatorio in vivo y permite los estudios a largo plazo.Este modelo podría proporcionar información sobre cómo se controla y regula la inflamación estéril dentro del pulmón. La técnica microquirúrgica requiere primero horas de práctica. La organización y planificación cuidadosas son importantes antes de comenzar.Además, puede ser practicado inicialmente por el ratón sacrificado sin la distracción de la actividad cardíaca y el movimiento que causa. La estasis sanguínea en el PA izquierdo permite que sea más fácilmente visualizado y manipulado. Para comenzar, coloque suavemente la luz flexible de fibra óptica en la tráquea de un ratón anestesiado, ligeramente por debajo de las cuerdas vocales.Ajuste los niveles de iluminación de tal manera que solo se vea un campo oscuro cuando se mira dentro de la faringe oral del ratón, excepto la luz roja que emana de debajo de las cuerdas vocales. Para la intubación, sostenga las pinzas con la mano dominante y úselas para agarrar suavemente y sacar la lengua de la cavidad oral. Abra la mandíbula inferior usando fórceps sostenidos por la mano no dominante y empuje los fórceps hacia la laringe para levantar la epiglotis.En este punto, suelte la lengua de las pinzas. Observa las cuerdas vocales. Deben abrirse y cerrarse de acuerdo con cada respiración.Sosteniendo la cánula con el alambre guía precargado, inserte la punta del cable a través de las cuerdas vocales. Luego, teniendo mucho cuidado de no mover el cable sosteniendo una porción que está fuera de la cánula pero justo por encima de las cuerdas vocales, retire la cánula, dejando solo el cable en su lugar con su extremo distal dentro de la tráquea. En este punto, realice una segunda visualización de las cuerdas vocales para confirmar que la punta distal del alambre permanece pasada a través de las cuerdas vocales iluminadas y hacia la tráquea, y no está en el esófago no iluminado.Luego, sostenga el cable fuera de la boca con las pinzas curvas en la mano izquierda estabilizadas contra una superficie dura, y avance cuidadosamente el catéter de calibre 20 con alas de cinta sobre el cable. Una vez que el extremo distal del alambre emerge del extremo posterior del catéter o tubo endotraqueal, sostenga ese extremo con los fórceps curvos y avance suavemente el catéter hacia la tráquea. Luego, retire cuidadosamente el alambre del extremo distal del catéter con los fórceps curvos sin desalojar la colocación del catéter.Luego, conecte brevemente el catéter al ventilador antes de asegurarlo para confirmar la colocación adecuada en la tráquea y no en el esófago. Confirmar la colocación traqueal mediante la observación de la ventilación mecánica dependiente de los movimientos bilaterales de la pared torácica y la ausencia de inflado del estómago. Después de la intubación, conecte el catéter al ventilador configurado a un volumen de título de 0.2 a 0.225 mililitros, y una frecuencia respiratoria de 120 a 150 respiraciones por minuto para confirmar la colocación traqueal correcta del tubo orotraqueal.Luego desconecte con el ratón respirando espontáneamente a través del tubo orotraqueal. Afeite el pelo del ratón sobre el área del tórax izquierdo hasta la escápula izquierda. Retire el exceso de vello afeitado con hisopos con alcohol y desinfecte el área quirúrgica.Luego coloque el mouse en una almohadilla de calentamiento en una posición lateral izquierda o tres cuartos girada. Conecte el tubo traqueal al ventilador. Después de hacer la incisión en la piel, inserte tres retractores esterilizados debajo de la capa muscular.A continuación, identifique el segundo espacio intercostal y sostenga la segunda costilla con las pinzas extra finas. Luego, tirando de la costilla hacia arriba, use una hoja de bisturí curva número 12 estéril para ingresar al espacio plural separando y cortando los músculos intercostales del segundo al tercer espacio. Considere pausar la ventilación para reducir la lesión en el ápice pulmonar izquierdo.Use la cefalada retractora más pequeña y estrecha a lo largo de la orientación de las costillas, y el retractor de tamaño mediano a la izquierda a lo largo de la tercera costilla, y el retractor más grande a la derecha a lo largo de la superficie de la segunda costilla. Abra el pecho con una retracción lenta y progresiva utilizando los cordones retractores elásticos. Exponga e identifique la arteria pulmonar izquierda, o AF, alejando el ápice pulmonar izquierdo con un hisopo estéril de punta de algodón o una esponja quirúrgica.Use las pinzas ultrafinas micro fórceps en la mano derecha y las pinzas dilatadoras de PA o vasos en la mano izquierda para exponer y crear suavemente el campo en el que la PA izquierda y el bronquio son visibles. Usando los fórceps de PA, levante el PA izquierdo y tire suavemente pero firmemente hacia arriba y cefálico para visualizar el bronquio transparente debajo. Aumente el aumento en el microscopio de disección a cuatro X.Mientras retrae el PA lejos del bronquio, pase con cuidado las pinzas ultrafinas cerradas a través del espacio entre el PA izquierdo y el bronquio.Luego use estos fórceps para sostener y tirar de un 7-0 u 8-0 Sutura Prolene a través del espacio entre la arteria pulmonar izquierda arriba y el bronquio abajo. A continuación, rodee el PA izquierdo atando un nudo deslizante para crear una oclusión en el PA. La interrupción del flujo sanguíneo se visualiza fácilmente en este punto, marcando el inicio del período isquémico. Externalice el extremo libre del nudo a través de un punto de entrada diferente en el tórax izquierdo anterior con una aguja de calibre 24 a 28 y asegure el extremo de la sutura con un pequeño trozo de cinta para facilitar la identificación posterior.Luego, usando una válvula de presión positiva y espiratoria o un tubo en el ventilador para roedores, vuelva a inflar el pulmón para expulsar la mayor cantidad de aire posible de la cavidad torácica. Luego, cierre la caja torácica con dos suturas de nylon 4-0 interrumpidas, seguido de cerrar la capa muscular y de piel, y aplicar anestesia local. Desconecte el ratón del ventilador y colóquelo con cuidado en la almohadilla de calentamiento para el cuidado postoperatorio para mantener la temperatura corporal durante la recuperación.Asegúrese de que el nudo deslizante exteriorizado se controla y visualiza claramente durante el movimiento del ratón. Tire del nudo deslizante exteriorizado suavemente al final del período isquémico. Aquí se muestra la histología de las secciones pulmonares en ratones de tipo salvaje de las cepas C3H y C57 black six.Después de una hora de isquemia y tres horas de reperfusión, se observó una intensa infiltración neutrofílica dentro del tejido izquierdo del pulmón en ambas cepas. Sin embargo, la cepa C3H mostró niveles marcadamente mayores de inflamación en comparación con C57 black six. Los errores durante el paso del monofilamento entre la PA izquierda y el bronquio izquierdo pueden conducir a una cirugía no recuperada con sangrado catastrófico de la PA izquierda o lesión irreversible en el bronquio izquierdo.Este es el paso que es más desafiante técnicamente y requiere repetir la práctica cuando se aprende este procedimiento por primera vez. Después de la recuperación del ratón de la cirugía de isquemia-reperfusión pulmonar aproximadamente una hora o menos después de la reperfusión, se puede administrar una instilación intratraqueal de bacterias vivas a las tres horas o de 24 a 48 horas más tarde para simular una infección que sigue a la lesión pulmonar estéril causada por isquemia-reperfusión. La instalación intratraqueal de otros agentes que pueden modular la inflamación estéril también se puede hacer después de la isquemia-reperfusión de manera similar.Esta técnica ayudó a descubrir y confirmar el tráfico gradual y la activación de neutrófilos en respuesta a lesiones e infecciones estériles en el pulmón.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un modelo murino de lesión pulmonar inducida por ventilador es una herramienta importante para el estudio de una lesión pulmonar...

La presión de la ventilación controlada para inducir la lesión pulmonar aguda en ratones

Un modelo de gran alcance para los cuidados perioperatorios y críticos relacionados con la insuficiencia renal aguda se presenta. Utilizando todo el cuerpo hipoperfusión inducida por paro cardíaco, es posible reproducir casi los cambios histológicos y funcionales de la clínica AKI.

Arresto normotérmica cardiaca y reanimación cardiopulmonar: un modelo de ratón de la lesión por isquemia-reperfusión

El trauma quirúrgico induce una respuesta inflamatoria. Las citocinas y los ligandos endógenos se sabe que modulan el tamaño del infarto de miocardio después de la isquemia y la reperfusión. Se presenta una versión modificada de tórax cerrado, el modelo murino de isquemia y reperfusión con pesas colgantes para minimizar los efectos de la toracotomía.

Un murino tórax cerrado modelo de isquemia y reperfusión miocárdica

Se introduce un método quirúrgico para inducir experimental de isquemia / reperfusión (I / R) lesión para simular el infarto de miocardio (MI) en modelos de ratón que permite una mayor claridad en el posicionamiento de la ligadura en la arteria descendente anterior izquierda (LAD) para aumentar la reproducibilidad de experimentos en ratones MI.

Un modelo murino de isquemia-reperfusión miocárdica lesión a través de la ligadura de la arteria descendente anterior

La neumonectomía en ratón es un modelo comúnmente empleado de crecimiento pulmonar compensatorio. Este procedimiento se puede utilizar junto con el rastreo de linaje o modelos de ratones transgénicos para dilucidar los mecanismos subyacentes.

Ratón neumonectomía Modelo de Compensatoria crecimiento pulmonar

A continuación se describe el procedimiento detallado de isquemia-reperfusión intestinal en ratones que produce lesiones reproducibles sin mortalidad para fomentar la estandarización de esta técnica a través del campo. Este modelo de lesión de isquemia-reperfusión intestinal puede ser utilizado para estudiar los mecanismos celulares y moleculares de la lesión y regeneración.

Modelo murino de isquemia-reperfusión intestinal Lesiones

En este trabajo describimos un método sencillo y reproducible que puede inducir infarto de miocardio o lesión por isquemia-reperfusión miocárdica en ratones mediante ligadura de precisión de la arteria coronaria descendente anterior izquierda mediante micromanipulación.

Inducción de infarto de miocardio y lesión por isquemia-reperfusión miocárdica en ratones

Este protocolo demuestra un modelo único de ratón de paro cardíaco por asfixia que no requiere compresión torácica para la reanimación. Este modelo es útil para monitorizar y obtener imágenes de la dinámica de la fisiología cerebral durante el paro cardíaco y la reanimación.

Modelo de paro cardíaco en ratón para la obtención de imágenes cerebrales y la monitorización de la fisiología cerebral durante la isquemia y la reanimación

El modelo de trasplante traqueal intrapulmonar murino (IPTT, por sus siglas en inglés) es valioso para estudiar la enfermedad obliterante de las vías respiratorias (OAD, por sus siglas en inglés) después del trasplante de pulmón. Ofrece información sobre el comportamiento inmunológico y angiogénico específico del pulmón en la obliteración de las vías respiratorias después del alotrasplante con alta reproducibilidad. A continuación, describimos el procedimiento IPTT y sus resultados esperados.

Trasplante de tráquea intrapulmonar murina: un modelo para investigar la enfermedad obliterante de las vías respiratorias después de un trasplante de pulmón

El protocolo describe un método factible, fiable y reproducible de pinzamiento del hiliar pulmonar izquierdo que puede utilizarse para estudiar la lesión por isquemia-reperfusión pulmonar en modelos de ratón.

Modelo murino de pinzamiento del hiliar pulmonar izquierdo de lesión por isquemia pulmonar y reperfusión

Aprenda un modelo quirúrgico de isquemia-reperfusión pulmonar ventilada en ratón para estudiar la patofisiología pulmonar específica. Esta técnica microquirúrgica minimiza la inflamación por atelectasia e hipoxia, manteniendo el sistema inmune circulatorio intacto.

Un modelo de ratón de intubación orotraqueal y cirugía de reperfusión de isquemia pulmonar ventilada

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