Name: Seguimiento del tráfico de células T inducido por anticuerpos biespecíficos utilizando células T humanas transducidas por luciferasa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:05:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Aprende a rastrear células T humanas transducidas con luciferasa en modelos tumorales in vivo. Este método permite evaluar la eficacia de anticuerpos biespecíficos sin sacrificar animales, facilitando estudios longitudinales.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores desean agradecer al Dr. Vladimir Ponomarev por compartir las construcciones de luciferasa utilizadas en los experimentos descritos en la sección de resultados representativos de este artículo.

Los siguientes procedimientos han sido evaluados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Memorial Sloan Kettering.
1. Transfección de células 293T con luciferasa y recolección de sobrenadante viral
<ol><li>Cultivo de células 293T<ol><li>Prepare los medios agregando lo siguiente a un litro de DMEM cada uno: 110 ml de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS), 11 ml de penicilina-estreptomicina.</li>
		<li>Descongelar 5 x 106 293T y transferirlas a un matraz T175 con el medio preparado como se ha descrito anteriormente.</li>
		<li>Divida las células 293T 1:10 cada 3 días durante 6 días. No permita que las células se vuelvan más del 90% confluentes.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfección de células 293T NOTA: Se calculan las siguientes cantidades de reactivos para transfectar un matraz T175 de células 293T. Ajustar en consecuencia si se van a transducir más matrazs.<ol><li>Transfiera 1,5 ml de medio a cada uno de los dos tubos de 50 ml utilizando una pipeta. A un tubo, agregue 10 μg de plásmido VSV-G, 20 μg de Gag/pol y 20 μg de plásmido luciferasa de tomate rojo TD (CBR-TDR) y mezcle. Al otro tubo, añadir 100 μL de ADN in vitro reactivo de transfección y mezclar. Incubar ambos tubos a temperatura ambiente (RT) durante 5 min. NOTA: Todos los plásmidos descritos en este manuscrito fueron proporcionados por el Dr. Vladimir Ponomarev.</li>
		<li>Transfiera el medio que contiene el reactivo de transfección in vitro de ADN gota a gota al tubo que contiene los plásmidos de ADN (durante aproximadamente 30 s) y mezcle suavemente con una pipeta. Incubar a RT durante 20 min.</li>
		<li>Durante esta incubación de 20 minutos, separe las células 293T agregando 5-10 ml de tripsina al 0,05%. Una vez que las células se hayan desprendido, añadir 10 ml de medio y centrifugar a 800 x g durante 5 min. Resuspender las células en 1,5 ml de medios.</li>
		<li>Añadir los medios que contienen el reactivo de transfección in vitro de ADN y los plásmidos de ADN a las células 293T e incubar a 37 °C durante 30 min.</li>
		<li>Transferir a un matraz T175 y añadir 18 ml de soporte. Incubar a 37 °C durante la noche.</li>
		<li>Al día siguiente, aspire cuidadosamente el medio con una pipeta de vidrio sin separar las células. Reemplácelo con 18 ml de medios nuevos. Incubar a 37 °C durante la noche en una incubadora.</li>
	</ol></li>
	<li>Recolección de sobrenadante viral<ol><li>Retire el sobrenadante viral con una pipeta sobre hielo. Centrifugar a 800 x g durante 5 min para granular las células y los residuos. NOTA: Si el pellet celular es grande, es probable que las células se interrumpieron del matraz cuando se retiró el sobrenadante. Estas células se pueden volver a colocar en un matraz nuevo con medios frescos.</li>
		<li>Filtrar el sobrenadante viral con un filtro de 0,22 μm.</li>
		<li>Use el sobrenadante viral inmediatamente. Manténgalo en hielo o a 4 ° C durante un máximo de 24 h, o congélelo a -80 ° C para un almacenamiento a largo plazo.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Expansión y transducción de células T humanas activadas con luciferasa
<ol><li>Activación de células T humanas in vitro
	<ol><li>Lave las perlas agregando 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenga 0.1% de albúmina sérica bovina (BSA) y 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) a un tubo estéril de 15 ml, agregando perlas (una perla por cada dos células T), colocándolas en un estante magnético durante 2 minutos y succionando el PBS.</li>
		<li>Prepare los medios como se describe en el paso 1.1.1, luego agregue IL-2 a una concentración final de 30 UI / ml y agregue las perlas lavadas. Producir 2,5 ml de medios por cada dos millones de células T que se activan.</li>
		<li>Contar las células T (recién purificadas o previamente purificadas, congeladas, descongeladas y lavadas) usando un hemocitómetro y tinción azul de tripano. Añadir linfocitos T al medio preparado en el paso 2.1.2 e invertir suavemente el tubo para mezclar. Las células T se expandirán al menos 20 veces dependiendo de la fuente y la salud general de las células. Determine el número de células T a activar calculando el número necesario para tratar a los ratones y dividiendo por 20. Aquí, se utilizaron 20 x 106 células T por ratón basadas en experimentos preliminares.</li>
		<li>Placa de 2,5 ml de medios que contienen dos millones de células T, perlas e IL-2 en cada pocillo de una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos. Cultivo a 37 °C en una incubadora humidificada al 5% deCO2 .</li>
		<li>Examine las células T bajo un microscopio 20x todos los días durante los próximos 3 días para determinar cuándo transducir con luciferasa. Las células están listas cuando se agrupan y agotan el medio, convirtiéndolo de rojo / rosa a naranja claro.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de placas de retronectina NOTA: La retronectina se utiliza para recubrir las placas utilizadas en la transducción, ya que mejora la transducción génica15.<ol><li>Agregue 2 ml de retronectina de 20 μg/ml en PBS a un pocillo de una placa de 6 pocillos sin tratar. Incubar durante 2 h a RT o 1 h a 37 °C. Se requiere un pocillo recubierto de retronectina por cada dos millones de células T que se transducen.</li>
		<li>Aspirar la retronectina sin rayar el fondo de la placa.</li>
		<li>Agregue 3 ml de BSA al 2% en PBS (filtrado estéril) por pocillo en la placa de 6 pocillos. Incubar durante 30 min en RT.</li>
	</ol></li>
	<li>Espinoculación<ol><li>Aspire el BSA sin rayar el fondo de la placa.</li>
		<li>Lave los pocillos una vez con 3 ml de PBS por pocillo. Continuar o sustituir por PBS fresco y dejar la placa tapada a 4 °C durante la noche.</li>
		<li>Añadir 2 ml de sobrenadante viral de luciferasa CBR-TDR (recogido en el paso 1.3) por pocillo.</li>
		<li>Centrifugadora a 1.240 x g durante 90 min a 32 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Transducción<ol><li>Cuenta las células T.</li>
		<li>Aspire el sobrenadante viral sin rayar el fondo de la placa.</li>
		<li>Placa de dos millones de células T por pocillo en 6 ml del medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene 30 UI / ml de IL-2 humana.</li>
		<li>Examine las células T diariamente. Las células T están listas para expandirse cuando son casi confluentes, generalmente después de 2 días.</li>
		<li>Cuando las células estén casi confluentes, lávelas suavemente del fondo de la placa con una pipeta y transfiera cada pocillo a un matraz T75 separado. Añadir 9 ml de medios para un total de 15 ml de medio por matraz.</li>
		<li>Al día siguiente, agregue 15 ml adicionales de medios. Las células deben estar listas para inyectarse en ratones el día después de esta adición de medios. Confirmar el éxito de la transducción mediante la realización de citometría de flujo (la construcción de luciferasa contiene un fluoróforo de tomate TD que es visible en el canal PE)16.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Injerto de células T transducidas por luciferasa en ratones inmunocomprometidos
<ol><li>Preparar y contar las células T para inyección.<ol><li>Retire las células T de los matraces y cuente. Las células están listas para inyectarse cuando se han expandido 20x-30x, generalmente en el día 7 después de la activación.</li>
		<li>Centrifugar las células T a 800 x g durante 5 min. Vuelva a suspender en 2 ml de soporte y retire las perlas con un estante magnético.</li>
		<li>Para experimentos en los que las células T se inyectarán por separado de anticuerpos biespecíficos, cuente las células T y resuspenda de modo que la concentración final sea de 20 millones de células T por 100 μL de medios. Vaya al paso 3.2. Para experimentos con células T armadas ex vivo (EAT), vaya al paso 3.1.4.</li>
		<li>Para experimentos con células T armadas ex vivo , cuente las células T y sepárelas en tubos individuales de 1,5 ml para cada grupo, con 20 millones de células por ratón. Por ejemplo, si hay tres grupos de cinco ratones cada uno, prepare tres tubos de 1,5 ml con 100 millones de células T cada uno.</li>
		<li>Centrifugar los tubos de 1,5 ml a 800 x g durante 5 min. Retire el medio con cuidado sin alterar el pellet de células T. Resuspender en no más de 50 μL de medios que contengan los anticuerpos biespecíficos. Incubar a RT durante 30 min. NOTA: Para los propósitos de los experimentos realizados en este estudio, se utilizaron anticuerpos biespecíficos patentados de compromiso de células T IgG-[L]-scFv generados en el laboratorio. Para el armado de células T, use 5 μg de anticuerpos por 20 x 106 células T. También podrían utilizarse anticuerpos biespecíficos disponibles comercialmente.</li>
		<li>Lave el exceso de anticuerpos agregando 1,450 μL de medios a cada tubo. Centrifugar a 800 x g durante 5 min, aspirar cuidadosamente el medio y resuspender a una concentración de 20 millones de células T armadas por medio de 100 μL.</li>
	</ol></li>
	<li>Inyección e injerto en ratones<ol><li>Anestesiar a los ratones en una cámara que suministre 3,5% (v/v) de isoflurano inhalado en 1 L/min de oxígeno. Los ratones están completamente anestesiados cuando el reflejo de retirada del pedal de las extremidades posteriores ha desaparecido. NOTA: Proporcione soporte térmico durante todo el procedimiento.</li>
		<li>Usando una aguja de 26 G, inyecte 20 millones de células T en 100 μL de medios retroorbitalmente por ratón.</li>
		<li>Administrar 1.000 U de IL-2 recombinante por vía subcutánea para apoyar la supervivencia de las células T in vivo.</li>
		<li>Administrar los anticuerpos biespecíficos retroorbitariamente (en el ojo no utilizados para la inyección de células T) o intraperitonealmente. Permita que los ratones se recuperen de la anestesia y regresen a sus jaulas. NOTA: Una vez más, aquí, se usaron anticuerpos patentados que se generaron en el laboratorio, pero en su lugar se podrían usar anticuerpos disponibles comercialmente. En los experimentos aquí, se administraron 0.3-10 μg de anticuerpos por ratón por dosis. Los anticuerpos se administraron dos veces por semana durante 3-4 semanas.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Imágenes in vivo de ratones injertados con células T transducidas por luciferasa
NOTA: Este paso debe realizarse el día de la obtención de imágenes, que no es necesariamente el mismo día en que se administran las células T y/o los anticuerpos a los ratones. Por lo general, realizamos imágenes 24 h después de la administración de las células T transducidas por luciferasa.
<ol><li>Preparación de D-luciferina<ol><li>Disolver 1 g de D-luciferina en 33,3 mL de PBS estéril (concentración final: 30 mg/mL).</li>
		<li>Alícuota la D-luciferina disuelta en tubos de microcentrífuga de 33 x 1,5 ml y mantener los tubos a -20 °C.</li>
		<li>El día de la obtención de imágenes, descongelar suficientes alícuotas de 30 mg/ml de D-luciferina para obtener imágenes del número de animales. Un tubo es suficiente para 10 animales. NOTA: Vuelva a congelar la D-luciferina restante después de su uso. La D-luciferina es estable durante al menos cinco ciclos de congelación/descongelación.</li>
	</ol></li>
	<li>Administración de D-luciferina a ratones NOTA: Antes de administrar D-luciferina a los ratones, abra el software de imágenes e inicialice el sistema. La cámara puede tardar varios minutos en enfriarse, y esto debe hacerse antes de que los ratones sean inyectados con D-luciferina para garantizar que la imagen pueda tener lugar 5 minutos después de la administración del sustrato.<ol><li>Anestesiar hasta cinco ratones en una cámara que suministre 3,5% (v/v) de isoflurano inhalado en 1 L/min de oxígeno. Los ratones están completamente anestesiados cuando el reflejo de retirada del pedal de las extremidades posteriores ha desaparecido.</li>
		<li>Una vez que los ratones estén completamente anestesiados, administrar 100 μL de 30 mg/ml de D-luciferina por ratón (3 mg por ratón) mediante inyección retroorbitaria con una aguja de 26 G. Imagen de este grupo de ratones antes de administrar D-luciferina al siguiente grupo. Coloque el siguiente grupo de ratones en la cámara de isoflurano para ser anestesiados mientras se toman imágenes del grupo anterior.</li>
	</ol></li>
	<li>Obtención de imágenes de células T transducidas por luciferasa<ol><li>Mover los ratones anestesiados a la cámara hermética a la luz del generador de imágenes y continuar administrando isoflurano al 3% a 0,5 L/min. Coloque los ratones de lado de tal manera que el flanco que lleva el xenoinjerto esté mirando hacia la cámara. Tome otro conjunto de imágenes con los ratones en posición supina para evaluar la presencia de células T en los pulmones.</li>
		<li>Con el Panel de control de adquisición, seleccione Luminiscente, Fotografía y Superposición. Establezca el tiempo de exposición en automático, el binning en medio y F/Stop en 1. Adquirir imágenes. Después de la primera imagen, establezca el tiempo de exposición para que coincida con el que se calculó automáticamente para la primera imagen para que las imágenes posteriores puedan compararse directamente. Puede ser útil capturar imágenes con múltiples tiempos de exposición para determinar el tiempo de exposición óptimo para lograr la señal más brillante sin saturación de píxeles.</li>
		<li>Retire a los ratones del isoflurano, regrese a sus jaulas y observe hasta que estén despiertos y ambulatorios.</li>
		<li>Repita los pasos del paso 4.2.1 hasta que se haya creado una imagen de todos los grupos.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Gökbuget, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blinatumomab+for+minimal+residual+disease+in+adults+with+B-cell+precursor+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Blinatumomab for minimal residual disease in adults with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 131 (14), 1522-1531 (2018).</li>
<li>Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-specific+and+tri-specific+antibodies-+the+next+big+thing+in+solid+tumor+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics.</a> Molecular Medicine. 24 (1), 50(2018).</li>
<li>Dreier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cell+costimulus-independent+and+very+efficacious+inhibition+of+tumor+growth+in+mice+bearing+subcutaneous+or+leukemic+human+B+cell+lymphoma+xenografts+by+a+CD19-%2FCD3-+Bispecific+single-chain+antibody+construct%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">T Cell costimulus-independent and very efficacious inhibition of tumor growth in mice bearing subcutaneous or leukemic human B cell lymphoma xenografts by a CD19-/CD3- Bispecific single-chain antibody construct.</a> The Journal of Immunology. 170 (8), 4397-4402 (2003).</li>
<li>Offner, S., Hofmeister, R., Romaniuk, A., Kufer, P., Baeuerle, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+regular+cytolytic+T+cell+synapses+by+bispecific+single-chain+antibody+constructs+on+MHC+class+I-negative+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Induction of regular cytolytic T cell synapses by bispecific single-chain antibody constructs on MHC class I-negative tumor cells.</a> Molecular Immunology. 43 (6), 763-771 (2006).</li>
<li>Santich, B. H., Cheung, N. V., Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editorial%3A+Bispecific+antibodies+for+T-cell+based+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Editorial: Bispecific antibodies for T-cell based immunotherapy.</a> Frontiers in Oncology. 10, 628005(2020).</li>
<li>Santich, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interdomain+spacing+and+spatial+configuration+drive+the+potency+of+IgG-%5BL%5D-scFv+T+cell+bispecific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Interdomain spacing and spatial configuration drive the potency of IgG-[L]-scFv T cell bispecific antibodies.</a> Science Translational Medicine. 12 (534), eaax1315(2020).</li>
<li>Wang, L., Hoseini, S. S., Xu, H., Ponomarev, V., Cheung, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+Fc+domains+in+T+cell-engaging+bispecific+antibodies+improves+T-cell+trafficking+and+antitumor+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Silencing Fc domains in T cell-engaging bispecific antibodies improves T-cell trafficking and antitumor potency.</a> Cancer Immunology Research. 7 (12), 2013-2024 (2019).</li>
<li>Park, J. A., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GD2+or+HER2+targeting+T+cell+engaging+bispecific+antibodies+to+treat+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">GD2 or HER2 targeting T cell engaging bispecific antibodies to treat osteosarcoma.</a> Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 172(2020).</li>
<li>Wu, Z., Guo, H. F., Xu, H., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+tetravalent+anti-GPA33%2Fanti-CD3+bispecific+antibody+for+colorectal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Development of a tetravalent anti-GPA33/anti-CD3 bispecific antibody for colorectal cancers.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 17 (10), 2164-2175 (2018).</li>
<li>Lin, T. Y., Park, J. A., Long, A., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+potent+anti-STEAP1+bispecific+antibody+to+redirect+T+cells+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Novel potent anti-STEAP1 bispecific antibody to redirect T cells for cancer immunotherapy.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (9), e003114(2021).</li>
<li>Hoseini, S. S., Espinosa-Cotton, M., Guo, H. F., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+leukemia+heterogeneity+by+combining+T+cell+engaging+bispecific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Overcoming leukemia heterogeneity by combining T cell engaging bispecific antibodies.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), e001626(2020).</li>
<li>Hoseini, S. S., Guo, H., Wu, Z., Hatano, M. N., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potent+tetravalent+T-cell-engaging+bispecific+antibody+against+CD33+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">A potent tetravalent T-cell-engaging bispecific antibody against CD33 in acute myeloid leukemia.</a> Blood Advances. 2 (11), 1250-1258 (2018).</li>
<li>Hoseini, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+engaging+bispecific+antibodies+targeting+CD33+IgV+and+IgC+domains+for+the+treatment+of+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">T cell engaging bispecific antibodies targeting CD33 IgV and IgC domains for the treatment of acute myeloid leukemia.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002509(2021).</li>
<li>Li, H., Er Saw, P., Song, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+strategies+for+next-generation+bispecific+antibody-based+antitumor+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Challenges and strategies for next-generation bispecific antibody-based antitumor therapeutics.</a> Cellular and Molecular Immunology. 17 (5), 451-461 (2020).</li>
<li>Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinoculation+and+retronectin+highly+enhance+the+gene+transduction+efficiency+of+Mucin-1-specific+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+in+human+primary+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57(2021).</li>
<li>Kleeman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+protein+combinations+for+flow+cytometric+analysis+based+on+spectral+overlap%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent protein combinations for flow cytometric analysis based on spectral overlap.</a> Cytometry Part A. 93 (5), 556-562 (2018).</li>
<li>Park, J. A., Santich, B. H., Xu, H., Lum, L. G., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+ex+vivo+armed+T+cells+using+recombinant+bispecific+antibodies+for+adoptive+immunotherapy+with+reduced+cytokine+release%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Potent ex vivo armed T cells using recombinant bispecific antibodies for adoptive immunotherapy with reduced cytokine release.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002222(2021).</li>
<li>Park, J. A., Wang, L., Cheung, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+tumor+infiltrating+myeloid+cells+to+enhance+bispecific+antibody-driven+T+cell+infiltration+and+anti-tumor+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">Modulating tumor infiltrating myeloid cells to enhance bispecific antibody-driven T cell infiltration and anti-tumor response.</a> Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 142(2021).</li>
<li>Ströhlein, M. A., Heiss, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trifunctional+antibody+catumaxomab+in+treatment+of+malignant+ascites+and+peritoneal+carcinomatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Oncology%22%5BJournal%5D)">The trifunctional antibody catumaxomab in treatment of malignant ascites and peritoneal carcinomatosis.</a> Future Oncology. 6 (9), 1387-1394 (2010).</li>
<li>Rabinovich, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+fewer+than+10+mouse+T+cells+with+an+enhanced+firefly+luciferase+in+immunocompetent+mouse+models+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (38), 14342-14346 (2008).</li>
<li>Skovgard, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+CAR+T-cell+kinetics+in+solid+tumors%3A+Translational+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Imaging CAR T-cell kinetics in solid tumors: Translational implications.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 22, 355-367 (2021).</li>
</ol>

NKC informa haber recibido subvenciones de investigación comercial de Y-mAbs Therapeutics. NKC es el inventor y propietario de las patentes emitidas con licencia de MSK a Y-mAbs Therapeutics, Biotec Pharmacon/Lallemand y Abpro-labs. MSK y NKC tienen intereses financieros en Y-mAbs. NKC informa haber recibido opciones sobre acciones de Eureka Therapeutics. HFG y MEC no tienen divulgaciones relevantes.

Si bien el Blinatumomab T-BsAb ha sido aprobado para neoplasias hematológicas CD19 positivas, la implementación exitosa de T-BsAbs en tumores sólidos ha demostrado ser mucho más difícil. El catumaxomab, un T-BsAb dirigido contra la molécula de adhesión de células epiteliales (EPCAM), fue aprobado para el tratamiento de la ascitis maligna en pacientes con cáncer de ovario, pero la producción del fármaco se detuvo posteriormente por razones comerciales19. No se han aprobado otros T-BsAb para tumores...

Los anticuerpos biespecíficos que se involucran con células T (T-BsAbs) son anticuerpos diseñados que se usan para proporcionar especificidad artificial a las células T policlonales al involucrar a las células T a través de un brazo de unión y un antígeno tumoral a través de otro brazo de unión. Esta tecnología se ha aplicado con éxito a cánceres hematológicos (blinatumomab1 dirigido a CD19), y numerosos T-BsAbs están en desarrollo preclínico y clínico para una variedad de tumores sólidos también2. Los T-BsAbs involucran a las células T policlonales de una manera independiente del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y, por lo tanto, incluso los tumores que regulan negativamente los antígenos leucocitarios humanos (HLA) son susceptibles a este tipo de terapia 3,4. Los T-BsAbs se han desarrollado en docenas de formatos diferentes, con diferencias en la valencia y disposición espacial de los brazos de unión de células T y tumores, distancias entre dominios y la inclusión de un dominio Fc, que afecta la vida media y puede inducir funciones efectoras si están presentes5. Trabajos previos en nuestro laboratorio han demostrado que estos factores afectan significativamente la eficacia antitumoral de T-BsAbs, con diferencias de hasta 1.000 veces en la potencia6. A través de este trabajo, identificamos el formato IgG-[L]-scFv como la plataforma ideal para T-BsAbs (consulte la sección Resultados representativos para obtener más detalles sobre los formatos T-BsAb), y hemos aplicado esta plataforma a objetivos que incluyen GD2 (neuroblastoma), HER2 (cáncer de mama y osteosarcoma), GPA33 (cáncer colorrectal), STEAP1 (sarcoma de Ewing), CD19 (neoplasias malignas de células B) y CD33 (neoplasias malignas de células B)7, 8,9,10,11,12,13.
Uno de los principales desafíos para implementar con éxito la terapia T-BsAb en tumores sólidos es superar un microambiente tumoral inmunosupresor (TME) para conducir el tráfico de células T a los tumores14. Los factores que afectan la eficacia de T-BsAb descritos anteriormente tienen un impacto significativo en la capacidad de T-BsAbs para inducir eficazmente la orientación de células T a los tumores, pero este efecto es difícil de evaluar en un sistema in vivo en tiempo real. Este manuscrito proporciona una descripción detallada del uso de células T transducidas por luciferasa en estudios preclínicos de T-BsAbs para evaluar el tráfico de células T a diversos tejidos en modelos experimentales de ratones inmunocomprometidos durante el tratamiento. El objetivo general de este método es proporcionar un medio para evaluar la infiltración de células T en tumores y otros tejidos, así como información en tiempo real sobre la cinética y persistencia de las células T, sin la necesidad de sacrificar animales durante el tratamiento. Para el creciente número de investigadores que se centran en las inmunoterapias celulares, la capacidad de rastrear las células T in vivo en modelos animales preclínicos es crucial. Nuestro objetivo es proporcionar una descripción exhaustiva y detallada del método que hemos empleado para rastrear las células T transducidas por luciferasa para permitir que otros investigadores puedan replicar fácilmente esta técnica.

<table><tbody><tr><td>293T celdas</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030-10G</td><td></td></tr><tr><td>CD3/CD28 perlas</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>11161D</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferina, Sal de potasio</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de transfección in vitro de ADN (polyjet)</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Plásmido Gag/pol</td><td>Addgene</td><td>14887</td><td></td></tr><tr><td>Plásmido GFP</td><td>Addgene</td><td>11150-DNA.cg</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 humana recombinante</td><td>R& D Systems</td><td>202-IL-010/CF</td><td></td></tr><tr><td>Retronectin</td><td>Takara</td><td>T100B</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco (ThermoFisher)</td><td>25-300-120</td><td></td></tr><tr><td>VSV-G plásmido</td><td>Addgene</td><td>8454</td><td></td></tr></tbody></table>

seguimiento del tráfico de células t inducido por anticuerpos biespecíficos utilizando células t humanas transducidas por luciferasa

Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells

Los anticuerpos biespecíficos que se involucran con células T (T-BSABS) se encuentran en varias etapas de desarrollo preclínico y pruebas clínicas para tumores sólidos. Factores como la valencia, la disposición espacial, la distancia entre dominios y las mutaciones Fc afectan la eficacia antitumoral de estas terapias, comúnmente al influir en la orientación de las células T a los tumores, lo que sigue siendo un desafío importante. Aquí, describimos un método para transducir células T humanas activadas con luciferasa, lo que permite el seguimiento in vivo de las células T durante los estudios de terapia T-BsAb. La capacidad de los T-BsAbs para redirigir las células T a los tumores se puede evaluar cuantitativamente en múltiples puntos temporales durante el tratamiento, lo que permite a los investigadores correlacionar la eficacia antitumoral de los T-BsAbs y otras intervenciones con la persistencia de las células T en los tumores. Este método alivia la necesidad de sacrificar animales durante el tratamiento para evaluar histológicamente la infiltración de células T y puede repetirse en múltiples puntos de tiempo para determinar la cinética del tráfico de células T durante y después del tratamiento.

Como se describe en el paso 4.3, los ratones pueden orientarse en diferentes posiciones durante la obtención de imágenes para evaluar la presencia de células T en diferentes tejidos. La posición supina permite la evaluación de las células T en los pulmones, que es común en los primeros momentos después de la inyección. El posicionamiento lateral con el xenoinjerto subcutáneo hacia arriba se utiliza para evaluar mejor el tráfico de células T al tumor. Se utilizaron ratones hembra C.Cg-Rag2tm1Fwa Il2rgt...

Aquí, describimos un método para transducir células T humanas con luciferasa para facilitar el seguimiento in vivo del tráfico de células T inducido por anticuerpos biespecíficos a tumores en estudios para evaluar la eficacia antitumoral y el mecanismo de anticuerpos biespecíficos que involucran a las células T.

Seguimiento del tráfico de células T inducido por anticuerpos biespecíficos utilizando células T humanas transducidas por luciferasa

T cell-engaging bispecific antibodies (T-BsAbs) are in various stages of preclinical development and clinical testing for solid tumors. Factors such as ...

Este método permite a los usuarios rastrear fácilmente las células T in vivo para evaluar la cinética del homing y monitorear la persistencia de las células T. La principal ventaja de esta técnica es que puede repetirse en múltiples puntos de tiempo en el mismo animal sin requerir sacrificio en citometría de flujo o inmunohistoquímica. Esta técnica podría modificarse para rastrear otros tipos de células inmunes también.Para cultivar células 293T, prepare un litro de DMEM agregando 110 mililitros de suero bovino fetal inactivado por calor y 11 mililitros de estreptomicina de penicilina. Descongele cinco veces 10 a la sexta célula 293T y transfiéralas a un matraz T175 que contenga DMEM. Divida las células de una a 10 cada tres días durante seis días antes de que las células se vuelvan más del 90% confluentes.Para la transfección, transfiera 1,5 mililitros de medios a dos tubos de 50 mililitros con una pipeta. A un tubo, agregue 10 microgramos de plásmido VSVG, 20 microgramos de gag pol y 20 microgramos de plásmido de luciferasa rojo de escarabajo clic o plásmido CBRTDR y mezcle. Agregue 100 microlitros de reactivo de transfección in vitro de ADN a otro tubo y mezcle.Incubar ambos tubos a temperatura ambiente durante cinco minutos. Transfiera el medio que contiene el reactivo de transfección in vitro de ADN gota a gota al tubo que contiene los plásmidos de ADN y mezcle suavemente con una pipeta. Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos.Durante la incubación, separe las células 293T agregando de cinco a 10 mililitros de tripsina al 0,05%. Una vez que las células se hayan desprendido, agregue 10 mililitros de medio y centrifugar a 800 G durante cinco minutos. Resuspender las células en 1,5 mililitros de medio.Agregue los medios que contienen el reactivo de transfección in vitro de ADN y los plásmidos de ADN a las células 293T e incube a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Después de la incubación, transferir la suspensión a un matraz T175. Agregue 18 mililitros de medios e incube a 37 grados centígrados durante la noche.Al día siguiente, aspire cuidadosamente el medio con una pipeta de vidrio sin separar las células y reemplácelo con 18 mililitros de medios frescos. Nuevamente, incubar durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, retire el sobrenadante viral con una pipeta sobre hielo y centrifugar a 800 G durante cinco minutos para granular las células y los desechos.Filtre el sobrenadante viral con un filtro de 0,22 micras y colóquelo inmediatamente en hielo. Para la activación in vitro de células T humanas, agregue 10 mililitros de PBS que contengan 0,1% de albúmina sérica bovina o BSA y dos EDTA milimolares a un tubo estéril de 15 mililitros. Luego, para lavar las cuentas, agregue las perlas en un tubo y coloque el tubo en una rejilla magnética.Después de dos minutos, retire el PBS del tubo. Después de preparar DMEM, agregue perlas lavadas e interleucina-2 o IL-2 a una concentración final de 30 unidades internacionales por mililitro. Cuente las células T usando un hemocitómetro y tinción azul de tripano.Después de contar, agregue el número deseado de células T al medio e invierta suavemente el tubo para mezclar. Placa de 2,5 mililitros de medios que contienen dos millones de células T, perlas e IL-2 en cada pocillo de una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos. Cultivo a 37 grados centígrados en dióxido de carbono humidificado al 5%.Examine las células T bajo un objetivo de 20X todos los días durante tres días para determinar cuándo transducir con luciferasa. Luego, para preparar una placa de RetroNectin, agregue dos mililitros de 20 microgramos por mililitro de RetroNectin en PBS a un pocillo de una placa de seis pocillos sin tratar e incube durante dos horas a temperatura ambiente. Aspire el RetroNectin sin rayar el fondo de la placa y agregue tres mililitros de BSA al 2% en PBS por pocillo en la placa de seis pocillos.Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, para la espinoculación, aspire el BSA y lave los pocillos una vez con tres mililitros de PBS. Continúe o reemplace con PBS fresco y deje el plato cubierto a cuatro grados centígrados durante la noche.Al día siguiente, agregue dos mililitros de sobrenadante viral de luciferasa CBRTDR por pocillo y centrifugar a 1, 240 G durante 90 minutos a 32 grados centígrados. Para la transducción, después de contar las células T, aspirar el sobrenadante viral y colocar en placa dos millones de células T por pocillo en seis mililitros de DMEM que contienen 30 unidades internacionales por mililitro de IL-2 humana. Examine las células T durante dos días.Cuando las células estén casi confluentes, lávelas suavemente del fondo de la placa con una pipeta y transfiera cada pocillo a un matraz T75 separado. Añadir nueve mililitros de medios para un total de 15 mililitros de volumen por matraz. Al día siguiente, agregue 15 mililitros de medios y confirme la transducción exitosa realizando una citometría de flujo.Después de anestesiar al ratón, usando una aguja de calibre 26, inyecte 20 millones de células T en 100 microlitros de medios retroorbitalmente. Administrar 1, 000 unidades de IL-2 recombinante por vía subcutánea para apoyar la supervivencia de las células T in vivo. Luego administre el anticuerpo biespecífico retroorbital o intraperitonealmente.Para imágenes in vivo, administrar 100 microlitros de tres miligramos de D-luciferina por inyección retroorbitaria con una aguja de calibre 26 en un ratón anestesiado. Para capturar imágenes, coloque el ratón en la cámara hermética a la luz del generador de imágenes de modo que el flanco que lleva el xenoinjerto esté orientado hacia la cámara. Con el panel de control de adquisición, seleccione luminiscente, fotografía y superposición.Establezca el tiempo de exposición en automático, el binning en medio y f-stop en uno y adquiera imágenes. Después de la primera imagen, establezca el tiempo de exposición para que coincida con el calculado automáticamente para la primera imagen para que las imágenes posteriores se puedan comparar directamente. Tome otro conjunto de imágenes con el ratón en decúbito supino para evaluar la presencia de células T en los pulmones.Las células T armadas traficaron al tumor más rápido que las células T desarmadas, dejando los pulmones dos días antes. La cuantificación de la infiltración de células T en los tumores a lo largo del tiempo se midió mediante bioluminiscencia y se expresó como bandadas totales o resplandor por píxel integrado sobre el contorno tumoral. El tráfico de células T podría monitorizarse durante 28 días después de la inyección de las células T transducidas por luciferasa, lo que permite rastrear la localización y la persistencia de las células T durante todo el tratamiento.Se muestra el tráfico de células T en xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer de mama humano HER2 positivo en ratones DKO. El tratamiento con el anticuerpo biespecífico HER2 con una CF sin silenciamiento no tuvo efecto sobre el crecimiento tumoral en comparación con un anticuerpo biespecífico controlado. Por el contrario, el tratamiento con anticuerpos biespecíficos HER2 que contienen la mutación N297A sola o en combinación con una mutación K322A fue capaz de detener completamente el crecimiento tumoral.Para los grupos con las mutaciones de silenciamiento, la señal de luminiscencia de las células T alcanzó un pico más alto en el tercer día después de la inyección y persistió en un nivel más alto en comparación con el anticuerpo biespecífico controlado y el anticuerpo biespecífico HER2 sin silenciar. Los ratones portadores de xenoinjertos derivados de pacientes con neuroblastoma demostraron que el agotamiento de los macrófagos positivos para Ly6C aumentó significativamente la orientación de las células T a los tumores, lo que resultó en una disminución del crecimiento tumoral y una supervivencia prolongada. El efecto fue más pronunciado en los xenoinjertos derivados de pacientes con osteosarcoma.Entre los anticuerpos biespecíficos dirigidos al antígeno tumoral STEAP1, el formato IGGL SCFV dio lugar a una infiltración de células T significativamente mayor en el sexto día después de la primera dosis de células T que persistió durante la duración del tratamiento. Tales observaciones no fueron predichas por ensayos de citotoxicidad in vitro. Después de rastrear las células T in vivo, los usuarios aún pueden realizar inmunohistoquímica para determinar más específicamente dónde se encuentran las células T dentro del tumor u otros tejidos normales.

tracking-bispecific-antibody-induced-t-cell-trafficking-using

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Trasplante de médula ósea murina es una técnica ampliamente utilizada para estudiar los mecanismos inmunológicos que regulan injerto contra huésped enfermedad en los seres humanos. La capacidad para monitorear los patrones de tráfico de células...

La inducción de la enfermedad de injerto contra huésped y<em&gt; En Vivo</em&gt; T Monitoreo Celular Utilizando un modelo murino MHC de concordancia

La compartimentación de las proteínas, ya sea dentro de la membrana plasmática o en lugares intracelulares es un mecanismo de regulación que pueden influir mucho en los resultados de señalización, por lo que, para comprender la señalización es importante estudiar el comportamiento espacial y temporal de las proteínas implicadas. Se describe aquí un sistema de microscopía TIRF base para estudiar la transducción de señal en las células T, pero es ampliamente aplicable.

Una técnica de microscopía TIRF en tiempo real, imágenes simultáneas de la TCR y sus proteínas asociadas de señalización

Este video muestra un método para rastrear el tráfico de células T inducidas por anticuerpos biespecíficos a tumores en un modelo de ratón. Las células T efectoras transducidas con luciferasa se inyectan en un ratón con un xenoinjerto de células tumorales subcutáneas. A continuación, se introducen anticuerpos biespecíficos que se unen a las células T y a las células tumorales. La localización de las células T se rastrea mediante imágenes bioluminiscentes, y la magnitud de la señal indica el...

Una técnica in vivo para rastrear el tráfico de células T inducido por anticuerpos biespecíficos a los tumores

Se describe un método de imágenes de células vivas que da una idea de la dinámica de proteínas durante el proceso de activación de células T. Se demuestra el uso combinado de la T-célula ensayo de difusión, microscopía confocal y análisis de imágenes para producir resultados cuantitativos para seguir la formación de complejos de señalización a través de la activación de células T.

En tiempo real de imágenes en vivo de las células T de señalización Formación de complejos

Describimos un protocolo para monitorizar la movilidad radial de las células inmunitarias no adherentes in vitro utilizando un aparato de sedimentación celular. La migración celular se rastrea en monocapas de células tumorales o en proteínas de la matriz extracelular. El examen por microscopía óptica y fluorescencia permite observar la movilidad celular y la funcionalidad citotóxica.

Radial Movilidad y citotóxicos Función de Retroviral Replicar Vector transducidas, no adherente Alloresponsive linfocitos T

Después de la preparación de un anticuerpo monoclonal modificado-Cu 64 la unión a un receptor de células T murino transgénico, las células T son radiomarcado in vivo, se analizaron para viabilidad, la funcionalidad, la estabilidad etiquetado y apoptosis, y adoptivamente transferidas en ratones con una vía aérea hipersensibilidad de tipo retardado reacción para formación de imágenes no invasiva mediante tomografía de emisión de positrones / tomografía computarizada (PET / CT).

Murina de linfocitos Etiquetado por<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Anticuerpo objetivo de receptores de<em&gt; En Vivo</em&gt; Tráfico de células mediante PET / CT

Protocolos para la evaluación cuantitativa de la migración y Quimiotaxis de linfocitos son herramientas importantes para la investigación de la inmunología. Aquí, se describe un protocolo en vitro que permite en tiempo real, multiplexado evaluación de migración celular, así como un complementario en vivo técnica que permite seguimiento de células nativas del bazo.

Cuantificación de la Quimiotaxis de monocitos humanos In Vitro y linfocitos murinos, tráfico en Vivo

Aquí, presentamos un protocolo para la producción y los ensayos preclínicos murinas CD19 coche de células de T por transducción retroviral y utilización como terapia contra establecido syngeneic A20 linfoma en ratones BALB/c con o sin lymphodepleting acondicionamiento previo.

Un modelo con ratones Syngeneic células B linfoma de evaluación preclínica de las células de T automóvil CD19

Este protocolo describe la metodología para el seguimiento no invasivo de células T genéticamente modificadas para expresar receptores de antígenos quiméricos in vivo con una plataforma clínicamente disponible.

Imágenes dinámicas de células T receptoras de antígeno quimérico con [18F]Tomografía por emisión de positrones tetrafluoroborato/Tomografía computarizada

Este protocolo proporciona un método de aislamiento primario de células T murinas y microscopía de lapso de tiempo de la migración de células T en condiciones ambientales específicas con análisis cuantitativo.

Ensayo de migración in vitro en tiempo real para linfocitos T murinos CD8+ primarios

Presentamos protocolos mejorados para la transducción retroviral de receptores de tráfico y el homing competitivo para estudiar el posicionamiento de linfocitos específicos de órganos y microambientes mediados por receptores. Este método ofrece información valiosa sobre los mecanismos de tráfico de células inmunitarias y tiene aplicaciones potenciales en futuras investigaciones básicas y terapéuticas.

Transducción retroviral eficiente y localización competitiva para investigar la localización de células T mediada por GPCR en diversos microentornos tisulares

Aprende a rastrear células T humanas transducidas con luciferasa en modelos tumorales in vivo. Este método permite evaluar la eficacia de anticuerpos biespecíficos sin sacrificar animales, facilitando estudios longitudinales.

Seguimiento del tráfico de células T inducido por anticuerpos biespecíficos utilizando células T humanas transducidas por luciferasa (Video) | JoVE Journal

Seguimiento del tráfico de células T inducido por anticuerpos biespecíficos utilizando células T humanas transducidas por luciferasa

Explorar más videos