Name: Una plataforma de alto rendimiento para el cultivo y la obtención de imágenes 3D de organoides (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Aprende a cultivar cientos de organoides en platos microtexturizados compatibles con microscopía de alta resolución. Este protocolo facilita el cribado de fármacos y la investigación oncológica con imágenes 3D.

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La investigación cuenta con el apoyo del proyecto CALIPSO apoyado por la Fundación Nacional de Investigación, Oficina del Primer Ministro, Singapur, bajo su programa Campus for Research Excellence and Technological Enterprise (CREATE). V.V. reconoce el apoyo del investigador de NRF NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, MBI seed funding y ANR ADGastrulo. A.B. y G.G. reconocen el apoyo de la financiación básica de MBI. A.B. agradece a Andor Technologies por el préstamo del microscopio BC43.

NOTA: La primera parte de este protocolo detalla la microfabricación del dispositivo de cultivo celular. Un molde primario original con cavidades piramidales puede producirse internamente, si hay instalaciones de microfabricación disponibles, o subcontratado a empresas externas. El molde primario utilizado en este trabajo se produce internamente, con pasos del proceso de fabricación descritos en otra parte11,13. Un protocolo básico para la microfabricación del molde está disponible en el Archivo Suplementario 1. CRÍTICO: Las operaciones en los pasos 1 a 6 deben llevarse a cabo en un ambiente libre de polvo. Se prefiere una campana de flujo laminar o una sala limpia, si está disponible. A lo largo de estos pasos, se debe usar equipo de protección personal (EPP), como guantes, una bata de laboratorio y gafas de seguridad.
1. Dados de molde PDMS
<ol><li>Corte pequeñas porciones del molde PDMS a la dimensión requerida para el dispositivo final (por ejemplo, 1 cm x 1 cm [Figura 1B]). Córtelos paralelos a las direcciones XY de la matriz. CRÍTICO: Al cortar el molde PDMS en dados de 1 cm x 1 cm, ejecute los cortes en pasos individuales; usando una cuchilla de afeitar de un solo lado, aplique presión y corte a través del PDMS en un solo paso. Esto es para evitar la formación de pequeñas partículas de PDMS, que pueden depositarse en la superficie del molde y afectar la calidad de los pasos de réplica (paso 3).</li>
</ol>2. Preparación de sustratos planos de PDMS
<ol><li>Pesar ~ 15-20 g de resina base PDMS y 1.5-2 g de su agente de reticulación (es decir, una proporción de 10: 1), mezclarlos cuidadosamente y desgasificar en un frasco de vacío durante ~ 20 min.</li>
	<li>Vierta lentamente el PDMS desgasificado sobre una placa de Petri de plástico de 15 cm de ancho (diámetro).</li>
	<li>Curar el PDMS manteniendo la placa de Petri en un horno a 65 ° C durante 2 h. Después de esperar a que se complete el curado, una película PDMS plana de ~ 1.5 mm de espesor (contenida en la placa de Petri) está lista para su uso (Figura 2A).</li>
	<li>Con una cuchilla afilada, corte piezas de 2 cm x 2 cm del PDMS (Figura 2B-D). NOTA: El grosor exacto de esta hoja PDMS no es crítico; ~1-2 mm es un rango adecuado. La dimensión para el corte debe ser más grande que el molde texturizado pero no mucho más grande, lo que resultaría en desperdicio de material.</li>
</ol>3. Producción de la capa texturizada hecha de adhesivo curable UV
<ol><li>Coloque un dado de molde PDMS (como se preparó en el paso 1) boca abajo sobre el corte plano de PDMS (como se preparó en el paso 2) (Figura 3A, B). NOTA: Asegúrese de que las protuberancias piramidales en el molde estén orientadas hacia el sustrato PDMS plano y que solo la superficie superior de las pirámides truncadas esté en contacto. Evalúe la colocación correcta con un microscopio óptico (Figura 3C, D).</li>
	<li>A un lado del molde, usando una pipeta, deje caer una pequeña cantidad (dos gotas, aproximadamente 0.1-0.2 ml) de adhesivo curable por UV (Figura 4A). NOTA: A medida que el líquido entra en contacto con el borde del molde, la capilaridad impulsará el líquido a llenar la cavidad entre el molde y el corte plano de PDMS utilizado como sustrato.<ol><li>Siga la progresión del líquido dentro de la cavidad, por ejemplo, utilizando un microscopio óptico invertido con un objetivo de aumento de 10x (Figura 4B, C).</li>
	</ol></li>
	<li>Exponga el adhesivo curable UV a la luz UV para curarlo. Ajuste el tiempo de exposición dependiendo de la densidad de potencia de la fuente UV utilizada (por ejemplo, una caja UV-LED con una densidad de potencia de 35 mW / cm 2;2 min al 50% de potencia en este protocolo para curar el adhesivo por completo).</li>
	<li>Usando la cantidad excesiva de adhesivo en un borde, sostenga el adhesivo curado sobre el sustrato plano de PDMS presionando suavemente con un dedo (Figura 5A, B). Mientras tanto, use pinzas para pellizcar una esquina del molde junto al mismo borde que se mantiene presionado y despéguelo lentamente mientras se asegura de que la película texturizada no se levante también. NOTA: La Figura 5C muestra el resultado de un procedimiento adecuado de eliminación de moho; La figura 5E-G muestra el procedimiento incorrecto.</li>
	<li>Recorte el exceso de adhesivo y el exceso de sustrato de PDMS con una cuchilla de afeitar para dejar la capa adhesiva curada y texturizada plana sobre el PDMS con exceso de PDMS en un solo borde (Figura 5D), que será necesario en el paso 5.</li>
</ol>4. Preparación del sustrato de cubreobjetos
NOTA: Como sustrato para el dispositivo final, se utilizan cubreobjetos redondeados estándar de 1,5 H con 25 mm de diámetro. Antes de que puedan ser utilizados, necesitan ser limpiados para eliminar el polvo y/o residuos orgánicos de su superficie.
<ol><li>Limpieza de cubreobjetos<ol><li>Sumerja los cubreobjetos en agua jabonosa durante 5 minutos mientras se aplica el ultrasonido (40 kHz, potencia sónica de 110 W).</li>
		<li>Lave los cubreobjetos en agua limpia desionizada (DI), primero por inmersión y finalmente con agua DI corriente de un grifo. Seque los cubreobjetos con una cerbatana de gas N2 .</li>
		<li>Sumerja los cubreobjetos en un baño de acetona durante 5 minutos; Cambie inmediatamente a un baño de 2-propanol (IPA) durante 5 minutos adicionales.</li>
		<li>Enjuague los cubreobjetos con IPA limpia usando una botella apretada. Seque los cubreobjetos con la cerbatana de gas N2 . NOTA: Los cubreobjetos limpiados con este procedimiento se pueden almacenar en un recipiente cerrado hasta que sea necesario. Manténgalos en un gabinete seco para evitar que la humedad se deposite en su superficie.</li>
	</ol></li>
	<li>Cuando esté listo para ser utilizado, trate un cubreobjetos limpios con un proceso corto de plasma deO2 para mejorar su hidrofilicidad: O2 20 sccm, presión de 3 mbar, 60 W en el generador de potencia de RF y 60 s de duración.</li>
	<li>Inmediatamente después de la activación por plasma, proceda con el recubrimiento por centrifugado de la capa delgada de adhesivo curable UV colocando el cubreobjetos en el mandril de vacío de un recubridor de centrifugado estándar y vertiendo una pequeña gota de adhesivo en el centro del cubreobjetos (Figura 6). Ejecute el proceso de centrifugado: extendiendo durante 5 s a 500 rpm, recubrimiento a 3.000 rpm durante 45 s (con la aceleración y desaceleración ajustadas a 100 rpm/s).<ol><li>Si el recubrimiento por centrifugado no está disponible, use la siguiente forma alternativa para producir una película delgada de adhesivo UV en los cubreobjetos:<ol><li>En un cubreobjetos limpio, deje caer ~0,1 ml de adhesivo curable UV con una pipeta (Figura 7A).</li>
			<li>Tome un segundo cubreobjetos y colóquelo encima del primero para que el adhesivo líquido se extienda uniformemente entre los dos cubreobjetos (Figura 7B-D).</li>
			<li>Una vez que el adhesivo extendido haya alcanzado los bordes de los cubreobjetos, sepárelos suavemente deslizando uno sobre el otro. Una vez separados, ambos cubreobjetos están completamente recubiertos con una fina capa de adhesivo líquido (Figura 7E). NOTA: El recubrimiento puede no ser uniforme y liso solo si la separación no se realiza con un movimiento suave y continuo.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Precurado de adhesivo curable UV<ol><li>Después del recubrimiento por centrifugado, precure el adhesivo por exposición a los rayos UV. Ajuste el tiempo de exposición en función de la densidad de potencia de la fuente UV utilizada (aquí, se utilizó una caja UV-LED con una densidad de potencia de 35 mW / cm2 durante 1 min al 50% de potencia). CRÍTICO: El adhesivo utilizado aquí es un pegamento óptico. Vea la discusión para puntos clave relacionados con las dosis de energía para su curado.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Transferencia de la película texturizada al sustrato final
<ol><li>Tome una de las películas texturizadas (preparada en el paso 3) y colóquela en contacto con el cubreobjetos recubierto de adhesivo (preparado en el paso 4). Asegúrese de que el contacto entre el adhesivo parcialmente curado en el cubreobjetos y la película texturizada sea lo más uniforme posible (Figura 8A-C). CRÍTICO: En esta etapa, el adhesivo en el cubreobjetos debe ser lo suficientemente sólido como para evitar el reflujo, lo que llenaría las cavidades piramidales de la película texturizada cuando se coloca en contacto, pero también sería lo suficientemente plástico y adhesivo como para que el contacto se pueda optimizar presionando suavemente la película texturizada.</li>
	<li>Exponga los cubreobjetos a la luz UV hasta que la capa adhesiva recubierta en el cubreobjetos esté completamente curada. Esto sellará la película texturizada en el cubreobjetos y proporcionará un aislamiento a prueba de fugas entre las cavidades piramidales.</li>
	<li>Finalmente, retire el sustrato plano PDMS (Figura 8D-F). Con unas pinzas, pellizque el PDMS en una esquina del borde donde quedó el exceso de material después del recorte (paso 3.5). De esta manera, la capa de película texturizada se deja adhesiva al cubreobjetos con acceso abierto en la parte superior para la siembra celular. CRÍTICO: Al despegar el PDMS plano, la película texturizada debe permanecer bien adherida al cubreobjetos. Los fallos de adhesión se confirman fácilmente si la película texturizada se puede despegar del cubreobjetos después de la exposición final a los rayos UV sin ningún esfuerzo.</li>
</ol>6. Pasivación a largo plazo del cubreobjetos de cultivo celular para cultivo celular
NOTA: La pasivación se logra generando un recubrimiento conforme y continuo de un copolímero biomimético con una estructura similar al grupo polar de fosfolípidos en la membrana celular. Este recubrimiento conformado evita la adhesión de las células al dispositivo de cultivo celular
<ol><li>Preparar una solución con 0,5% (p/v) del copolímero biomimético disuelto en etanol puro. Conservar la solución a 4 °C para utilizarla en el futuro.</li>
	<li>Coloque el cubreobjetos de cultivo celular en una placa de Petri de 35 mm y cúbralo completamente con la solución de copolímero biomimético.</li>
	<li>Después de 5 min, retire el cubreobjetos de cultivo celular del recipiente con la solución de copolímero biomimético y déjelo secar a temperatura ambiente dentro del plato final en una campana de bioseguridad (>1 h). NOTA: Se puede producir un recubrimiento más grueso aumentando la concentración del copolímero biomimético en la solución de recubrimiento; los resultados de un recubrimiento más grueso son visibles bajo un microscopio de campo claro (Figura 9A).</li>
</ol>7. Siembra celular
<ol><li>Desgasificación y esterilización<ol><li>Justo antes de la siembra celular, dispense solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) en las placas de cultivo celular (típicamente 1 ml para una placa de Petri de 35 mm). Desgasifique el plato con el PBS estéril usando un dispositivo ultrasónico durante ~ 10 minutos, seguido de varias rondas de pipeteo para eliminar todas las burbujas. CRÍTICO: Si el aire queda atrapado dentro de las cavidades piramidales, evitará que las células entren en ellas. Para asegurarse de que no haya aire atrapado en la pirámide antes de la siembra celular, se recomienda asegurar visualmente (bajo un microscopio de campo claro de sobremesa con un aumento de 10x o 20x) la ausencia de aire en estas cavidades (Figura 10).</li>
		<li>Reemplace el PBS con medio de cultivo estéril y esterilice la placa con luz UV durante 30 minutos bajo una campana de cultivo celular. NOTA: A partir de este paso, el plato debe considerarse estéril y manipularse utilizando técnicas estériles. Una forma alternativa de eliminar el aire atrapado del dispositivo de cultivo celular es usar un frasco de vacío con una bomba de vacío.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de la suspensión celular NOTA: Las celdas se pueden sembrar como agregados de células simples o pequeñas e ingresar a los pocillos de muestra a través de la abertura superior. Con el tiempo, las células insertadas se agregan y crecen dentro de los pozos de muestra en esferoides de un tamaño mayor que el tamaño de la abertura. Como modelos de línea celular validados, utilice células cancerosas HCT116 (CCL-247 ATCC) o MCF7 (HTB-22 ATCC) mantenidas en el medio de cultivo recomendado (directrices ATCC).<ol><li>Preparar una suspensión celular (p. ej., utilizando un proceso de tripsinización siguiendo las pautas de ATCC). Siga las recomendaciones de preparación de tripsinización/suspensión celular para las células de interés.</li>
		<li>Contar y ajustar la concentración celular a 0,5 × 106 células/ml en el medio de cultivo recomendado.</li>
	</ol></li>
	<li>Dispensación celular<ol><li>Retire el tampón PBS de la placa de cultivo celular de 35 mm y luego dispense 1 ml de la suspensión celular ajustada. Consulte la Figura 11A para obtener una imagen de microscopio óptico de un procedimiento de siembra celular con densidad celular y homogeneidad adecuadas.</li>
		<li>Vuelva a colocar la placa de cultivo celular en la incubadora celular (37 °C, 5% deCO2 y 100% de humedad) durante 10 min. Aproximadamente 80-100 células entrarán en cada cavidad piramidal. NOTA: Es posible aumentar el número de células por placa de cultivo celular aumentando la concentración celular o el tiempo empleado antes de la eliminación de la suspensión celular. Típicamente, la formación de esferoides toma varias horas (dependiendo del tipo de célula) después de la siembra celular y se puede seguir con un microscopio de campo claro (objetivos de 4x a 40x; Figura 11). A partir de aquí, el medio de cultivo, las matrices extracelulares y los factores de crecimiento de diferenciación se pueden cambiar o agregar a la placa de cultivo celular que contiene los esferoides de acuerdo con los protocolos de diferenciación típicos que podrían durar unos pocos días, semanas o meses.</li>
		<li>Después de la incubación de 10 minutos, recupere la placa de cultivo celular de la incubadora y aspire suavemente la suspensión celular para eliminar las células no atrapadas. Agregue 1 ml de medio de cultivo a un plato de 35 mm y colóquelo nuevamente en la incubadora celular. CRÍTICO: En esta etapa, debido a que los esferoides aún no se han formado, es muy importante evitar la aspiración fuerte o la dispensación que resultará en la pérdida de las células. El control visual con un microscopio de campo claro de sobremesa es muy recomendable en este paso.</li>
	</ol></li>
</ol>8. Inmunotinción e imagen
<ol><li>Fijación y tinción NOTA: Los diferentes procedimientos clásicos de fijación e inmunotinción son completamente compatibles con la placa de cultivo celular. Aquí se describe un protocolo típico.<ol><li>Fijar los organoides/esferoides en la placa de cultivo celular durante 20 minutos en paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente.</li>
		<li>Permeabilizar los organoides durante 24 h en una solución de tensioactivo al 1% en PBS estéril a 4 °C en un agitador orbital e incubar durante 24 h en tampón de bloqueo (albúmina sérica bovina [BSA] al 2% y surfactante al 1% en PBS estéril) a 4 °C en un agitador orbital.</li>
		<li>Incubar las muestras con anticuerpos primarios de interés en una dilución entre 1/50 y 1/200 (o según las recomendaciones del fabricante) en tampón de dilución de anticuerpos (2% BSA y 0,2% surfactante en PBS estéril) a 4 °C durante 48 h.</li>
		<li>Enjuagar las muestras 3 veces con tampón de lavado en un agitador orbital (3% de NaCl y 0,2% de surfactante en PBS estéril) e incubar con los anticuerpos secundarios correspondientes en el tampón de dilución de anticuerpos (dilución entre 1/100 y 1/300 o según las recomendaciones del fabricante), 0,5 μg/ml de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y 0,2 μg/ml de Alexa Fluor 647 o 488 Faloidina a 4 °C durante 24 h en un agitador orbital, seguido de cinco pasos de enjuague con PBS. Opcionalmente, montar las muestras utilizando un agente de limpieza soluble en agua precalentado a 37 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Imagenológico NOTA: En esta etapa, los organoides en la placa de micropocillos pueden considerarse como una placa de cultivo normal que contiene muestras fijas y teñidas para imágenes: cualquier procedimiento de imagen estándar se puede utilizar sin necesidad de adaptación o modificación. La figura 12 ilustra un resultado representativo de imágenes y reconstrucción 3D obtenidas utilizando un microscopio confocal de disco giratorio, con un objetivo de aire de 40x (apertura numérica 0,75).<ol><li>Utilice software constructor para el proceso automático de adquisición de imágenes con los siguientes ajustes: tiempo de exposición = 50 ms, con una platina motorizada z para adquirir una pila z (paso z de 1 μm, para una altura total de 70 μm).</li>
		<li>Realice la reconstrucción 3D utilizando software de análisis de imágenes.</li>
	</ol></li>
</ol>9. Liberación y recolección de los organoides
NOTA: La capa adhesiva texturizada de la placa de cultivo celular se puede separar del cubreobjetos para liberar los esferoides / organoides vivos (antes de la fijación) contenidos dentro de las cavidades piramidales para el análisis de las células con otros procedimientos como secuenciación de ARN, enfoques ómicos, experimentos in vitro y trasplante in vivo .
<ol><li>Con la muestra todavía en la placa de Petri y en una campana de bioseguridad, use una cuchilla como un bisturí para cortar una esquina de la capa adhesiva texturizada.</li>
	<li>Con pinzas, pellizque la capa adhesiva texturizada en el borde cortado y despéguela suavemente del cubreobjetos de vidrio, pero manténgala sumergida en el medio (algunos organoides podrían permanecer con la capa adhesiva, Figura 13).</li>
	<li>Enjuagar 3x con medio de cultivo y recoger los organoides por pipeteo.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, J., Koo, B. -K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+organoids%3A+model+systems+for+human+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).</li>
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<li>Kratochvil, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+materials+for+organoid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Engineered materials for organoid systems.</a> Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).</li>
<li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+potential+in+organoid+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li>
<li>O'Connell, L., Winter, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%3A+past+learning+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Organoids: past learning and future directions.</a> Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).</li>
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<li>Busslinger, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+and+challenges+of+patient-derived+organoids+in+guiding+the+multimodality+treatment+of+upper+gastrointestinal+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">The potential and challenges of patient-derived organoids in guiding the multimodality treatment of upper gastrointestinal malignancies.</a> Open Biology. 10 (4), 190274(2020).</li>
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<li>Galland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+high-+and+super-resolution+imaging+using+single-objective+SPIM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM.</a> Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).</li>
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<li>Beghin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+high-speed+3D+imaging+of+organoid+cultures+with+multi-scale+phenotypic+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification.</a> Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).</li>
</ol>

Se ha publicado una solicitud internacional de patente con el número de publicación WO 2021/167535 A1.

El procedimiento para la fabricación de la placa de cultivo de micropocillos, que permite el cultivo y diferenciación de organoides de alta densidad, se ha descrito en este documento. Debido a la geometría y disposición de las microcavidades, miles de esferoides pueden ser cultivados y teñidos en una sola placa durante largos períodos de tiempo (varias semanas o más) casi sin pérdida de material. A modo de comparación, un área de 4 mm x 2 mm en la placa de cultivo celular puede contener tantos esferoides como una sola pl...

En los cultivos celulares 3D organotípicos, en lo sucesivo denominados organoides, las células madre se diferencian y se autoorganizan en estructuras espaciales que comparten fuertes similitudes morfológicas y funcionales con órganos reales. Los organoides ofrecen modelos valiosos para estudiar la biología humana y el desarrollo fuera del cuerpo 1,2,3. Se está desarrollando un número creciente de modelos que imitan el hígado, el cerebro, el riñón, el pulmón y muchos otros órganos 2,4,5. La diferenciación en organoides está dirigida por la adición de factores de crecimiento solubles y una matriz extracelular en una secuencia de tiempo precisa. Sin embargo, en marcado contraste con los órganos, el desarrollo de los organoides es bastante heterogéneo.
Más allá de numerosos desafíos biológicos6,7, los cultivos de organoides también plantean desafíos tecnológicos en términos de métodos de cultivo celular, caracterización de la transcriptómica e imágenes. El desarrollo de órganos in vivo ocurre en un entorno biológico que resulta en una autoorganización altamente estereotipada de los arreglos celulares. Cualquier alteración fenotípica puede ser utilizada como un proxy para diagnosticar un estado enfermo. En contraste, los organoides se desarrollan in vitro en microambientes mínimamente controlados compatibles con las condiciones de cultivo celular, lo que resulta en una gran variabilidad en la ruta de desarrollo y la formación de formas para cada organoide individual.
Un estudio reciente8 demostró que la imagen cuantitativa de la forma de organoides (descriptores fenotípicos) junto con la evaluación de unos pocos marcadores genéticos permite la definición de paisajes de desarrollo fenotípico. Podría decirse que la capacidad de relacionar la diversidad de la expresión genómica en organoides con su comportamiento fenotípico es un paso importante hacia la liberación de todo el potencial de los cultivos organotípicos. Por lo tanto, pide el desarrollo de enfoques de imagen dedicados y de alto contenido que permitan la caracterización de características organoides a escalas subcelulares, multicelulares y organoides completas en 3D 9,10.
Desarrollamos una plataforma versátil de detección de alto contenido (HCS) que permite el cultivo de organoides optimizados (desde células madre embrionarias humanas aisladas [hESCs], células madre pluripotentes inducidas humanas [hIPSC] o células primarias hasta organoides diferenciados, multicelulares y 3D) e imágenes 3D rápidas y no invasivas. Integra un dispositivo de cultivo celular 3D miniaturizado de próxima generación, llamado chip JeWells (el chip en adelante), que contiene miles de micropozos bien dispuestos flanqueados por espejos de 45 ° que permiten obtener imágenes rápidas, 3D y de alta resolución mediante microscopía de hoja de luz de un solo objetivo11. Compatible con cualquier microscopio estándar, comercial e invertido, este sistema permite obtener imágenes de 300 organoides en 3D con resolución subcelular en <1 h.
La microfabricación del dispositivo de cultivo celular parte de un molde microestructurado existente, que contiene cientos de micropirámides (Figura 1A) con una base cuadrada y paredes laterales a 45 ° con respecto a la base. La Figura 1C muestra imágenes de microscopio electrónico (EM) de tales estructuras. El molde en sí está hecho de poli (dimetilsiloxano) (PDMS) y se puede hacer como una réplica de un molde primario (no se muestra aquí) con las características correspondientes (como cavidades) utilizando procedimientos litográficos blandos estándar. El molde primario puede ser producido por diferentes procedimientos. El utilizado para este protocolo se realizó utilizando grabado húmedo de silicio como se informó en Galland et al. 11; El procedimiento para la fabricación del molde primario no es crítico para este protocolo. Las pirámides están dispuestas en una matriz cuadrada, con el mismo paso para las direcciones X e Y (en este caso el paso es de 350 μm).
Como ilustración, se publicaron experimentos de prueba de concepto12 para demostrar que el chip permite protocolos de cultivo y diferenciación a largo plazo (meses) al tiempo que define con precisión el número de células iniciales en los pozos. El desarrollo individual de un gran número de organoides se puede monitorear automáticamente en vivo utilizando microscopios de fluorescencia estándar de campo claro y de hoja de luz 3D. Además, los organoides se pueden recuperar para realizar más investigaciones biológicas (por ejemplo, análisis transcriptómico). Este documento describe protocolos detallados para la fabricación de los cubreobjetos de cultivo celular, el procedimiento de siembra y tinción para microscopía de fluorescencia, así como la recuperación de los organoides.

<table><tbody><tr><td>2-Propanol</td><td>Thermofisher scientific</td><td>AA19397K7</td><td></td></tr><tr><td>Acetona Thermofisher</td><td>scientific</td><td>AA19392K7</td><td></td></tr><tr><td>BC43 Microscopio confocal de sobremesa</td><td>Andor Technology</td><td></td><td>Microscopio confocal de disco giratorio</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina&nbsp;</td><td>Thermofisher scientific</td><td>37525</td><td></td></tr><tr><td>Solución de grabado de óxido tamponado</td><td>Merck</td><td>901621-1L</td><td></td></tr><tr><td>CEE Spin Coater</td><td>Brewer Science</td><td>200X</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Revelador AZ400K</td><td>Merck</td><td>18441223164</td><td></td></tr><tr><td>DI Milliq agua</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio</td><td>Marienfled</td><td>117650</td><td>1.5H, redondo 25 mm de diámetro</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Imaris software Imaris</td> Software <td>BitPlane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio óptico de transmisión invertida</td><td>Nikon</td><td>TSF100-F</td><td></td></tr><tr><td>Labsonic M</td><td>Sartorius Stedium Biotech</td><td></td><td>Homogeneizador ultrasónico</td></tr><tr><td>Lipidure</td><td>NOF America</td><td>CM5206</td><td>copolímero biomimético</td></tr><tr><td>NOA73</td><td>Norland Products</td><td>17-345</td><td>adhesivo curable UV</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>Thermofisher scientific&nbsp;</td><td>A12379</td><td>Alexa</td></tr><tr><td>Solución tampón de fosfato</td> fluorado <td>Thermofisher scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Photo Resist AZ5214E</td><td>Merck</td><td>14744719710</td><td></td></tr><tr><td>herramienta Pico Plasma</td><td>Diener Electronic GmbH + Co. KG</td><td>Pico Plasma</td><td>Para O2 tratamiento de plasma</td></tr><tr><td>RapiClear 1.52</td><td>Sunjin lab</td><td>RC 152001</td><td>agente de limpieza soluble en agua</td></tr><tr><td>Placa caliente/agitador RCT</td><td>IKA (MY)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Herramienta de grabado iónico reactivo</td><td>Samco Inc. (JPN)</td><td>RIE-10NR</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875093</td><td>medio de cultivo para células HCT116</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Kit de elastómero de silicona</td><td>Dow Corning</td><td>4019862</td><td>Polidimetilsiloxano o, en resumen, PDMS</td></tr><tr><td>Tricloro(1H,1H,2H-perfluorooctyl)silano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448931-10G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td>surfactante</td></tr><tr><td>Tripsina EDTA</td><td>Thermofisher científico</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Limpiador ultrasónico</td><td>Bransonic</td><td>CPX2800</td><td></td></tr><tr><td>UV-KUB 2</td><td>KLOE</td><td></td><td>Fuente de luz UV-LED, longitud de onda de 365 nm, 35 mW/cm2 densidad de potencia</td></tr><tr><td>mascarilla UV alineador</td><td>SUSS Microtec Semiconductor (DE)</td><td>MJB4</td><td></td></tr></tbody></table>

una plataforma de alto rendimiento para el cultivo y la obtención de imágenes 3d de organoides

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

La caracterización de un gran número de cultivos organotípicos tridimensionales (3D) (organoides) a diferentes escalas de resolución está actualmente limitada por los enfoques de imagen estándar. Este protocolo describe una forma de preparar chips de cultivo de organoides microfabricados, que permiten imágenes en vivo 3D multiescala en un instrumento fácil de usar que requiere manipulaciones mínimas y es capaz de un rendimiento de imágenes de hasta 300 organoides / h. Estos chips de cultivo son compatibles con objetivos de aire e inmersión (aire, agua, aceite y silicona) y una amplia gama de microscopios comunes (por ejemplo, disco giratorio, escáner de punto confocal, campo amplio y campo claro). Además, se pueden utilizar con modalidades de hoja de luz como la tecnología de microscopía de iluminación de un solo objetivo y plano único (SPIM) (soSPIM). 
El protocolo descrito aquí da pasos detallados para la preparación de los chips de cultivo microfabricados y el cultivo y tinción de organoides. Solo se requiere un corto período de tiempo para familiarizarse, y los consumibles y equipos se pueden encontrar fácilmente en biolaboratorios normales. Aquí, las capacidades de imágenes 3D se demostrarán solo con microscopios estándar comerciales (por ejemplo, disco giratorio para reconstrucción 3D y microscopía de campo amplio para monitoreo de rutina).

La Figura 8F muestra el aspecto típico de un cubreobjetos de cultivo celular después de una fabricación exitosa. La capa adhesiva curable UV aparece plana y se adhiere bien al cubreobjetos. La transferencia de la capa adhesiva en el cubreobjetos puede fallar si la capa del cubreobjetos se cura en exceso, o si la eliminación del sustrato PDMS plano se realiza incorrectamente (como se muestra en la Figura 8G, H). En ambos casos, la falla es eviden...

Este artículo presenta un protocolo de fabricación para un nuevo tipo de sustrato de cultivo con cientos de microcontenedores por mm2, en el que los organoides pueden ser cultivados y observados utilizando microscopía de alta resolución. También se detallan los protocolos de siembra celular e inmunotinción.

Una plataforma de alto rendimiento para el cultivo y la obtención de imágenes 3D de organoides

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Este protocolo demuestra una placa de cultivo celular de microtextura diseñada para el crecimiento de cientos de organoides con conocimiento del material y totalmente compatible con la microscopía. Nuestra técnica permite generar eficientemente miles de organoides, totalmente compatibles con imágenes a largo plazo y cultivos celulares a largo plazo. Este protocolo es de gran interés para aplicaciones biomédicas, como la tubería de detección de medicamentos y los dominios de investigación del cáncer.La técnica presentada en este protocolo es fácil de dominar después de algunos intentos por parte de cualquiera que tenga experiencia con procedimientos de laboratorio y microscopía óptica. Para comenzar, corte pequeñas porciones del molde PDMS a la dimensión requerida para el dispositivo final. Córtelos paralelos a las direcciones XY de la matriz.Coloque uno de los dados de molde PDMS preparados boca abajo en la sección plana de PDMS. Luego, usando una pipeta, agregue aproximadamente 0.1 a 0.2 mililitros de adhesivo curable UV a un lado del molde. Siga la progresión del líquido dentro de la cavidad utilizando un microscopio óptico invertido con un aumento de 10X.Exponga el adhesivo a la

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Toda la estructura 3D y el contenido celular de los organoides, así como su parecido fenotípico con el tejido original se pueden capturar utilizando el protocolo de imágenes 3D de resolución de una sola célula descrito aquí. Este protocolo se puede aplicar a una amplia gama de organoides que varían en origen, tamaño y forma.

Imagen tridimensional de resolución de una sola célula de organoides intactos

Aquí, proporcionamos protocolos detallados, robustos y complementarios para realizar imágenes de tinción y resolución subcelular de modelos de cultivo celular tridimensionales fijos que van desde 100 μm hasta varios milímetros, lo que permite la visualización de su morfología, composición de tipo celular e interacciones.

Tinción e imágenes de alta resolución de modelos organoides y esferoides tridimensionales

Se desarrolló un sistema de ensayo de alto rendimiento in vitro de alta precisión para evaluar medicamentos contra el cáncer utilizando organoides tumorales (PDO) derivados del paciente, similares a los tejidos cancerosos, pero que no son adecuados para sistemas de ensayo de alto rendimiento in vitro con placas de 96 pocillos y 384 pocillos.

Ensayo in vitro de alto rendimiento utilizando organoides tumorales derivados del paciente

Este protocolo describe un método semiautomatizado para exámenes de detección de fármacos con organoides de rendimiento medio a alto y software de análisis de imágenes automatizado e independiente del microscopio para cuantificar y visualizar las respuestas multiparamétricas a fármacos de un solo organoide para capturar la heterogeneidad intratumoral.

Detección multiparamétrica de fármacos organoides tumorales mediante imágenes de células vivas de campo amplio para análisis a granel y de un solo organoide

El presente estudio describe metodologías para cultivar, congelar, descongelar, procesar, teñir, etiquetar y examinar esferoides y organoides completos bajo varios microscopios, mientras permanecen intactos en un hidrogel dentro de un dispositivo multipropósito.

Cultivo, congelación, procesamiento e imágenes de organoides y esferoides completos mientras aún están en un hidrogel

Este protocolo documenta la fabricación y el montaje de SPOT, una plataforma de cultivo basada en andamios de alto rendimiento, en formatos de 96 y 384 pocillos. También detalla el proceso de siembra para SPOT, tanto manual como utilizando un manipulador de líquidos disponible comercialmente.

Fabricación reproducible de SPOT como plataforma de cultivo basada en andamios de alto rendimiento

Presentamos un protocolo paso a paso para imágenes tridimensionales, sin etiquetas y de alta resolución de organoides mediante holotomografía de baja coherencia. Este protocolo detalla la preparación del cultivo de organoides, la adquisición de imágenes y el análisis computacional de imágenes, lo que permite la visualización en tiempo real de la dinámica estructural y las respuestas a los fármacos en organoides vivos.

Imágenes 3D de alta resolución y análisis de aprendizaje automático sin etiquetas de organoides intestinales mediante holotomografía de baja coherencia

Hemos desarrollado una novela de varios compartimientos de neuronas co-cultivo plataforma de microsistemas para la investigación in vitro de interacción axón-glia del SNC. La plataforma es capaz de conducir hasta seis experimentos independientes en paralelo y se fabrica utilizando un nuevo desarrollo de macro / micro método de fabricación de híbridos.

Un compartimiento de Multi-CNS neuronas-glia Co-cultivo de microfluidos Plataforma

Lensfree en el chip de imagen y caracterización de las células se ilustra. Este enfoque de células en el chip de imagen proporciona una herramienta compacta y rentable para el diagnóstico médico y de alto rendimiento de aplicaciones de la biología celular, por lo que es especialmente adecuado para entornos de escasos recursos.

Sin cristalino en el chip de imagen de las células proporciona una nueva herramienta de alto rendimiento Biología celular y el diagnóstico médico

Se presentan sólidos métodos bioquímicos y microscópicos para el estudio...

Bioquímica y de Evaluación de Rendimiento microscópica de masa grasa en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Aprende a cultivar cientos de organoides en platos microtexturizados compatibles con microscopía de alta resolución. Este protocolo facilita el cribado de fármacos y la investigación oncológica con imágenes 3D.

Una plataforma de alto rendimiento para el cultivo y la obtención de imágenes 3D de organoides

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