Name: Afinidad celular de la emulsión estabilizada por partículas para aumentar la internalización del antígeno (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Aprende a preparar emulsiones Pickering estabilizadas con nanopartículas PLGA para mejorar la afinidad celular y la internalización eficiente de antígenos en células presentadoras, contribuyendo al desarrollo de vacunas más efectivas.

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Este trabajo fue apoyado por el Proyecto apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142), De 0 a 1 Proyecto de Innovación Original del Programa de Investigación Científica Básica de Frontera de la Academia China de Ciencias (ZDBS-LY-SLH040), la Fundación para Grupos de Investigación Innovadores de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención No. 21821005).

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<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphology+and+surface+charge-dependent+cellular+uptake+efficiency+of+upconversion+nanostructures+revealed+by+single-particle+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">The morphology and surface charge-dependent cellular uptake efficiency of upconversion nanostructures revealed by single-particle optical microscopy.</a> Chemical Science. 13 (12), 3610(2022).</li>
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<li>Zhang, Y., Wu, J., Zhang, H., Wei, J., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles-mimetic+encapsulation+improves+oncolytic+viro-immunotherapy+in+tumors+with+low+coxsackie+and+adenovirus+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles-mimetic encapsulation improves oncolytic viro-immunotherapy in tumors with low coxsackie and adenovirus receptor.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 574007(2020).</li>
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<li>McClelland, R. D., Culp, T. N., Marchant, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+flow+cytometry+and+confocal+immunofluorescence+microscopy+of+virus-host+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Imaging flow cytometry and confocal immunofluorescence microscopy of virus-host cell interactions.</a> Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 11, 749039(2021).</li>
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</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Desarrollamos una emulsión de aceite/agua estabilizada con nanopartículas de PLGA como un sistema de administración para mejorar la internalización de antígenos. El PNPE preparado poseía una superficie densamente empaquetada para soportar el lugar de aterrizaje y una suavidad y fluidez únicas para un potente contacto celular con la membrana celular inmune. Además, la interfaz aceite/agua ofrecía una carga de antígenos de alto contenido, y el PLGA anfifílico confería PNPE con alta estabilidad para el transporte de antígen...

Para combatir las enfermedades epidémicas, crónicas e infecciosas, es imperativo desarrollar adyuvantes efectivos para las vacunas profilácticas y terapéuticas 1,2. Idealmente, los adyuvantes deben poseer una excelente seguridad y activación inmune 3,4,5. Se cree que la captación y el proceso efectivos de antígenos por las células presentadoras de antígeno (APC) son una etapa esencial en las cascadas de señalización aguas abajo y el inicio de la respuesta inmune 6,7,8. Por lo tanto, obtener una comprensión clara del mecanismo de interacción de las células inmunes con antígenos y diseñar adyuvantes para mejorar la internalización son estrategias eficientes para mejorar la eficiencia de las vacunas.
Las micro/nanopartículas con propiedades únicas han sido previamente investigadas como sistemas de liberación de antígenos para mediar la captación celular de antígenos y la interacción celular con patrones moleculares asociados a patógenos 9,10. Al entrar en contacto con las células, los sistemas de entrega comienzan a interactuar con la matriz extracelular y la membrana celular, lo que condujo a la internalización y las respuestas celulares posteriores11,12. Estudios previos han sacado a la luz que la internalización de las partículas tiene lugar a través de la adhesión membrana-partícula celular13, seguida de la deformación flexible de la membrana celular y la difusión del receptor a la membrana superficial14,15. En estas circunstancias, las propiedades del sistema de entrega dependen de la afinidad con los APC, que posteriormente afectan la cantidad de absorción16,17.
Para obtener información sobre el diseño del sistema de administración para mejorar la respuesta inmune, se han centrado amplios esfuerzos en la investigación de la relación entre las propiedades de las partículas y la absorción celular. El presente estudio surgió de la observación de que las micro/nanopartículas sólidas con diversas cargas, tamaños y formas a menudo se estudian bajo esta luz, mientras que el papel de la fluidez en la internalización de antígenos rara vez se investiga18,19. De hecho, durante la adhesión, las partículas blandas demostraron cambios dinámicos de curvatura y difusiones laterales para aumentar el área de contacto para interacciones multivalentes, que difícilmente pueden ser replicadas por las partículas sólidas20,21. Además, las membranas celulares son bicapas de fosfolípidos (esfingolípidos o colesterol) en el sitio de absorción, y las sustancias hidrofóbicas pueden alterar la entropía conformacional de los lípidos, reduciendo la cantidad de energía requerida para la absorción celular22,23. Por lo tanto, amplificar la movilidad y promover la hidrofobicidad del sistema de administración puede ser una estrategia efectiva para fortalecer la internalización del antígeno para mejorar la respuesta inmune.
La emulsión Pickering, estabilizada por partículas sólidas ensambladas en la interfaz entre dos líquidos inmiscibles, ha sido ampliamente utilizada en el campo biológico24,25. De hecho, las partículas agregantes en la interfaz aceite/agua determinan la formulación de estructuras multinivel, que promueven interacciones multinivel entre el sistema de administración y la celular, e inducen aún más propiedades fisicoquímicas multifuncionales en la administración de fármacos. Debido a su deformabilidad y movilidad lateral, se esperaba que las emulsiones de Pickering entraran en interacción celular multivalente con los inmunocitos y fueran reconocidas por las proteínas de membrana26. Además, como los núcleos de micelas aceitosas en las emulsiones Pickering no están completamente cubiertos con partículas sólidas, las emulsiones Pickering poseen espacios de diferentes tamaños entre las partículas en la interfaz aceite/agua, lo que causa una mayor hidrofobicidad. Por lo tanto, es crucial explorar la afinidad de las emulsiones de Pickering con los APC y elaborar la posterior internalización para desarrollar adyuvantes eficientes.
Basándonos en estas consideraciones, diseñamos una emulsión de Pickering estabilizada con nanopartículas (PNPE) de PLGA como un sistema de administración de vacunas de fluidez que también ayudó a obtener información valiosa sobre la afinidad del PNPE con los BMDC y la internalización celular. La adhesión en tiempo real de vesículas extracelulares biomiméticas (bEV; un reemplazo de BMDC) a PNPE se monitoreó a través de un método sin etiquetado utilizando una microbalanza de cristal de cuarzo con monitoreo de disipación (QCM-D). Después de la caracterización de la afinidad de PNPE con BMDC, se utilizó microscopía de barrido láser confocal (CLSM) para determinar la captación de antígenos. El resultado indicó la mayor afinidad de PNPE con BMDC y la internalización eficiente del antígeno. Anticipamos que el PNPE exhibiría una mayor afinidad con las APC, lo que puede estimular mejor la internalización de antígenos para mejorar las respuestas inmunes.

<table><tbody><tr><td>AddVax</td><td>InvivoGen</td><td>Vac-adx-10</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células</td><td>Biosharp</td><td>BS-70-CS</td><td>70 &mu; m</td></tr><tr><td>Microscopio de barrido láser confocal (CLSM)</td><td>Nikon</td><td></td><td>A1</td></tr><tr><td>Cy3 NHS Ester</td><td>YEASEN</td><td>40777ES03</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Solución de tinción</td><td>Beyotime</td><td>C1005</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>FITC Phalloidin</td><td>Solarbio</td><td>CA1620</td><td></td></tr><tr><td>Mastersizer 2000 Analizador de tamaño de partícula</td>Kit de ensayo de proteínas <td>Malvern</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA</td><td>Thermo Science</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Equipo de emulsificación de membranas</td><td>Zhongke Senhui Microsphere Technology</td><td></td><td>FM0201/500M</td></tr><tr><td>Mini-Extrusora</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NANO ZS</td><td>Malvern</td><td></td><td>JSM-6700F</td></tr><tr><td>Membranas de policarbonato</td><td>Avanti Polar Lipids, </td><td></td><td></td>Inc</tr><tr><td>Poly (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>26780-50-7</td><td>Mw 7,000-17,000</td></tr><tr><td>Solución de Poly-L-lisina</td><td>Solarbio</td><td>P2100</td><td></td></tr><tr><td>Poly (alcohol vinílico) (PVA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-89-5</td><td></td></tr><tr><td>QSense Sensor de dióxido de silicio</td><td>Biolin Scientific</td><td>QSX 303</td><td>Rugosidad superficial < 1 nm RMS</td></tr><tr><td>Microbalanza de cristal de cuarzo</td><td>Biosharp</td><td></td><td>Q-SENSE E4</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 básico</td><td>Gibco</td><td>C22400500BT</td><td>L-Glutamina, 25 mM HEPES</td></tr><tr><td>Microscopía electrónica de barrido (SEM)</td><td>JEOL</td><td></td><td>JSM-6700F</td></tr><tr><td>Escualeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>111-02-4</td><td></td></tr></tbody></table>

afinidad celular de la emulsión estabilizada por partículas para aumentar la internalización del antígeno

Cellular Affinity of Particle-Stabilized Emulsion to Boost Antigen Internalization

La afinidad celular de las micro / nanopartículas es la condición previa para el reconocimiento celular, la absorción celular y la activación, que son esenciales para la administración de fármacos y la respuesta inmune. El presente estudio surgió de la observación de que generalmente se consideran los efectos de la carga, el tamaño y la forma de las partículas sólidas sobre la afinidad celular, pero rara vez nos damos cuenta del papel esencial de la suavidad, el fenómeno de reestructuración dinámica y la interacción compleja de la interfaz en la afinidad celular. Aquí, desarrollamos la emulsión de Pickering estabilizada con nanopartículas (PNPE) de ácido poliláctico-co-glicólico (PLGA) que superó las deficiencias de las formas rígidas y simuló la flexibilidad y fluidez de los patógenos. Se estableció un método para probar la afinidad de PNPE con las superficies celulares y elaborar sobre la posterior internalización por parte de las células inmunes. La afinidad de PNPE con vesículas extracelulares biomiméticas (bEV), el reemplazo de las células dendríticas de la médula ósea (BMDC), se determinó utilizando una microbalanza de cristal de cuarzo con monitoreo de disipación (QCM-D), que permitió el monitoreo en tiempo real de la adhesión de la emulsión celular. Posteriormente, se utilizó el PNPE para administrar el antígeno (ovoalbúmina, OVA) y se observó la captación de los antígenos por BMDC utilizando el microscopio de barrido láser confocal (CLSM). Los resultados representativos mostraron que el PNPE disminuyó inmediatamente la frecuencia (ΔF) cuando encontró los bEV, lo que indica una rápida adhesión y una alta afinidad del PNPE con los BMDC. PNPE mostró una unión significativamente más fuerte a la membrana celular que las micropartículas PLGA (PMP) y el adyuvante AddaVax (denotado como nanoemulsión estabilizada con surfactante [SSE]). Además, debido a la mayor afinidad celular con los inmunocitos a través de cambios dinámicos de curvatura y difusiones laterales, la captación de antígenos se incrementó posteriormente en comparación con PMP y SSE. Este protocolo proporciona información para diseñar formulaciones novedosas con alta afinidad celular e internalización eficiente de antígenos, proporcionando una plataforma para el desarrollo de vacunas eficientes.

Se utilizó una sonificación simple de un solo paso para obtener PNPE. Primero, preparamos PNP uniformes para su uso como estabilizador sólido (Figura 1A). La morfología de las PNP se observó a través de SEM, mostrando que son en su mayoría uniformes y esféricas (Figura 1B). El tamaño hidrodinámico y el potencial zeta de las formulaciones se detectaron a través de DLS. El diámetro de las PNPs fue de 187,7 ± 3,5 nm y el potencial zeta fue de -16,4 ± 0,4 m...

Para diseñar racionalmente adyuvantes eficientes, desarrollamos la emulsión de Pickering estabilizada con nanopartículas de ácido poliláctico-co-glicólico (PNPE). El PNPE poseía una suavidad única y una interfaz hidrófoba para un potente contacto celular y ofrecía una carga de antígenos de alto contenido, mejorando la afinidad celular del sistema de administración a las células presentadoras de antígenos e induciendo una internalización eficiente de los antígenos.

Afinidad celular de la emulsión estabilizada por partículas para aumentar la internalización del antígeno

The cellular affinity of micro-/nanoparticles is the precondition for cellular recognition, cellular uptake, and activation, which are essential for drug ...

Desarrollamos la emulsión Pickering estabilizada con nanopartículas PLGA. La emulsión de Pickering mejoró la afinidad celular con las células de proteínas de antígenos, induciendo una internalización eficiente de antígenos. Las emulsiones de Pickering estabilizadas con nanopartículas fueron fáciles de preparar y administraron antígenos de manera eficiente.Además, se utilizó un método para monitorear la afinidad de la emulsión a la célula y elaborar la internalización. Este protocolo proporciona información para diseñar formulaciones novedosas con alta eficiencia celular e internalización eficiente de antígenos, que proporcionan una plataforma para el desarrollo de vacunas eficientes. Para comenzar, agregue 100 miligramos de ácido poliláctico-co-glicólico a 10 mililitros de acetona y mezcla de etanol en una proporción de cuatro a uno para servir como la fase de aceite.Coloque 20 mililitros de solución acuosa de PVA debajo de la campana extractora y revuelva magnéticamente a 400 rotaciones por minuto. Agregue cinco mililitros de la fase de aceite en la solución de PVA gota a gota usando una bomba de jeringa. Luego revuelva la mezcla en la campana extractora hasta que los solventes orgánicos se evaporen por completo.Después de la volatilización de los disolventes orgánicos, centrifugar la mezcla a 15, 000 G.Lavar tres o más veces hasta que el agua de lavado final sea clara y transparente. Vuelva a suspender las nanopartículas de PLGA lavadas en dos mililitros de agua desionizada y congele la mezcla a 80 grados centígrados durante 24 horas. Para caracterizar el tamaño y el potencial zeta de las nanopartículas de PLGA, agregue 10 microlitros de nanopartículas de PLGA en un mililitro de agua desionizada para obtener una solución diluyente y transfiera la solución diluyente a una celda DTS1070.Encienda el ordenador y el analizador dinámico de dispersión de luz. A continuación, coloque la celda DTS1070 en el sistema DLS. Haga clic en el software Zetasizer y cree un nuevo archivo de medición para configurar el procedimiento de determinación.A continuación, inicie el procedimiento de determinación para obtener el tamaño de partícula y la distribución del potencial zeta. Para preparar nanopartículas de PLGA estabilizadas en emulsión Pickering, o PNPE, agregue nanopartículas de PLGA liofilizadas al agua desionizada a una concentración de cuatro miligramos por mililitro y luego agregue escualano como fase oleosa. Prepare PNPE a través de una sonicación de un solo paso durante cinco minutos a 100 vatios en un sonicador de baño de agua.Diluir 20 microlitros de PNPE y un mililitro de agua desionizada. Deje caer 20 microlitros de la emulsión en el portaobjetos. Observar la morfología y homogeneidad de la emulsión mediante microscopía óptica a 40 veces el aumento y obtener fotografías.Encienda el recubridor de centrifugado presionando el botón de encendido. Presione el botón de control y ajuste el tiempo y la velocidad de recubrimiento. Conecte la tubería de nitrógeno a la recubrida de centrifugado y ajuste el fraccionamiento del cilindro de gas a 0,4 kilopascales.Coloque el chip limpio en la ventosa del recubridor de centrifugado. Agregue 100 microlitros de poli-l-lisina gota a gota al centro del sensor de dióxido de silicio y cierre la cubierta superior del recubridor de centrifugado. Presione el botón de inicio para comenzar a recubrir la muestra y detenga la máquina cuando haya terminado.Apague la bomba de vacío, apague los botones de encendido y control, y retire el sensor de dióxido de silicio modificado con poli-l-lisina. Para determinar la adhesión de vesículas extracelulares biomiméticas a PNPE, encienda la computadora, la unidad electrónica y la bomba peristáltica, y active el control de temperatura en la parte inferior derecha del software para asegurarse de que la temperatura establecida sea aproximadamente un grado Celsius por debajo de la temperatura ambiente. Coloque los sensores de dióxido de silicio modificados con poli-l-lisina en la celda de flujo de acuerdo con las instrucciones de funcionamiento y conecte la línea de medición entre la celda de flujo y la bomba de flujo.Coloque la celda de flujo dentro del sistema de módulos de flujo. Haga clic en la barra de herramientas Adquisición y seleccione Medida de configuración para buscar 1, 3, 5, 7, 9 y 11 octavas del chip en el canal utilizado. Para corregir la línea de base, haga clic en Iniciar medición para permitir que el aire ingrese al módulo de flujo hasta que la línea de base del aire sea suave.Después de fluir agua desionizada durante 10 a 15 minutos para permitir nuevamente el equilibrio de referencia de la solución, bombee la solución PNPE preparada en el módulo de flujo a una velocidad de flujo de 50 microlitros por minuto para lograr la adsorción de equilibrio en el sensor de dióxido de silicio. Bombee la solución de vesícula extracelular biomimética preparada en el módulo de flujo a una velocidad de flujo de 50 microlitros por minuto para rastrear el proceso de adhesión de bEV a la superficie PNPE. Incubar las células dendríticas de la médula ósea con 1640 medios completos durante siete días y luego sembrarlas en pequeñas placas láser confocales a 1 veces 10 a 6 por pozo durante la noche a 37 grados centígrados y una incubadora de dióxido de carbono al 5%.Mezclar 0,5 mililitros de ovoalbúmina marcada con cianina 5, con 0,5 mililitros de PNPE durante una hora y eliminar el antígeno fluídico por centrifugación a 5.000 G durante 20 minutos para desarrollar la formulación de la vacuna. Después de la resuspensión con 200 microlitros de agua desionizada, agregue 10 microlitros de la formulación en los pequeños platos láser confocales bajo un banco súper limpio y cocultive con células dendríticas de médula ósea durante seis horas. Después de eliminar el líquido de cultivo de las células, lávelas dos veces con solución salina tamponada con fosfato precalentado.Fijar las células con solución de formaldehído al 4% y PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. Lave las celdas con PBS dos o tres veces a temperatura ambiente durante 10 minutos cada una. Permeabilizar las células con 100 microlitros de solución Triton X-100 al 0,5% durante cinco minutos a temperatura ambiente.Después de lavar las células nuevamente con PBS, cubra las celdas en el plato con fondo de vidrio de las pequeñas placas láser confocales con 200 microlitros de solución de trabajo de faloidina conjugada con isotiocianato de fluoresceína e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de lavar las células con PBS tres veces durante cinco minutos cada una, resienta los núcleos con 200 microlitros de solución DAPI durante unos 30 segundos. Para el análisis de imágenes, encienda el hardware del microscopio confocal en secuencia, incluido el láser, el confocal, el microscopio y la computadora.Haga clic en el software y seleccione Nikon Confocal para entrar en el sistema de pruebas. En el sistema de microscopio confocal, encienda las distintas unidades en el orden indicado. Primero, configure los canales FITC, DAPI y Cy5 y ajuste el HV y el offset correspondientes.Luego, después de seleccionar la lente 100 veces de aceite y poner una gota de aceite de cedro en la parte superior, coloque los pequeños platos láser confocales que contienen células dendríticas de médula ósea teñidas en la etapa del microscopio. Haga clic en el botón escanear. Bajo el microscopio de fluorescencia, localice las células de interés moviendo el eje x, el eje y y el eje z.Sintoniza la intensidad del láser, el tamaño de la imagen y otros parámetros para permitir el escaneo de imágenes confocales de alta calidad. Finalmente, haga clic en el botón Capturar y guarde las imágenes. La adhesión de vesículas extracelulares biomiméticas a PNPE se rastreó utilizando QCM-D.Una disminución inmediata en la frecuencia, indicó una rápida adhesión de vesículas extracelulares biomiméticas a PNPE después del encuentro. Además, delta F disminuyó con el aumento de la concentración de vesículas extracelulares biomiméticas, lo que refleja un efecto dependiente de la concentración. Las micropartículas de PLGA y la nanoemulsión estabilizada con surfactante se unieron débilmente a vesículas extracelulares biomiméticas, incluso a una alta concentración de 80 microgramos por mililitro, lo que probablemente resultó de la falta de sitios de contacto con las células inmunes.La señal fluorescente de cianina-5 ovoalbúmina indicó que la cantidad total de antígeno internalizado en las células es significativamente mayor en el grupo tratado con PNPE en comparación con el grupo tratado con micropartículas PLGA y nanoemulsión estabilizada con surfactante. El análisis cuantitativo de la captación celular mostró una intensidad relativa significativamente mayor de fluorescencia y células dendríticas de médula ósea tratadas con PNPE que en aquellas tratadas con micropartículas de PLGA y nanoemulsión estabilizada con surfactante. Los resultados obtenidos demostraron que el PNPE promovió la internalización del antígeno y administró eficazmente el antígeno intracelularmente.Para obtener una emulsión homogénea, la mezcla debe agitarse continuamente durante la sonicación.

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Afinidad celular de la emulsión estabilizada por partículas para aumentar la internalización del antígeno

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