Name: Manipulación genética mediada por fagos de la enfermedad de Lyme Espiroqueta Borrelia burgdorferi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T14:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Aprende a realizar transducción mediada por fagos φBB-1 en Borrelia burgdorferi como alternativa a la electroporación. Este método permite introducir ADN foráneo en cepas de difícil transformación para estudiar la biología molecular de la enfermedad de Lyme.

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El autor desea agradecer a Shawna Reed, D. Scott Samuels y Patrick Secor por su útil discusión y a Vareeon (Pam) Chonweerawong por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Ciencias Biomédicas y becas de investigación de la facultad a Christian H. Eggers de la Escuela de Ciencias de la Salud de la Universidad de Quinnipiac.

El autor no tiene nada que revelar.

El uso de la transducción podría representar un método para superar al menos algunas de las barreras biológicas y técnicas asociadas con la electrotransformación de B. burgdorferi 1,4,13,37. En muchos sistemas, el bacteriófago puede mover el ADN del huésped (no profago) entre las células bacterianas mediante transducción generalizada o especializada 22,23,24,49,50.</s...

El desarrollo de herramientas para la manipulación genética de la bacteria espiroqueta Borrelia burgdorferi ha añadido un valor inconmensurable a la comprensión de la naturaleza de la enfermedad de Lyme 1,2,3,4. B. burgdorferi tiene un genoma inusualmente complejo compuesto por un pequeño cromosoma lineal y plásmidos lineales y circulares 5,6. La pérdida espontánea de plásmidos, el reordenamiento intragénico (movimiento de genes de un plásmido a otro dentro del mismo organismo) y la transferencia horizontal de genes (HGT, el movimiento de ADN entre dos organismos) han dado lugar a una cantidad vertiginosa de heterogeneidad genética entre B. burgdorferi (para un ejemplo, ver Schutzer et al.7). Los genotipos resultantes (o "cepas") son todos miembros de la misma especie, pero tienen diferencias genéticas que influyen en su capacidad para transmitir e infectar a diferentes huéspedes mamíferos 8,9,10,11. En este informe, el término "cepa" se utilizará para referirse a B. burgdorferi con un fondo genético particular de origen natural; El término "clon" se utilizará para referirse a una cepa que ha sido modificada genéticamente para un propósito particular o como resultado de una manipulación experimental.
La caja de herramientas moleculares disponible para su uso en B. burgdorferi incluye marcadores seleccionables, reporteros de genes, vectores lanzadera, mutagénesis de transposones, promotores inducibles y marcadores contraseleccionables (para una revisión, ver Drektrah y Samuels12). El uso efectivo de estas metodologías requiere la introducción artificial de ADN heterólogo (extraño) en una cepa de B. burgdorferi de interés. En B. burgdorferi, la introducción de ADN heterólogo se logra casi exclusivamente a través de la electroporación, un método que utiliza un pulso de electricidad para hacer una membrana bacteriana transitoriamente permeable a pequeños trozos de ADN introducidos en el medio1. La mayoría de las células (estimadas en ≥99,5%) son destruidas por el pulso, pero las células restantes tienen una alta frecuencia de retención del ADN heterólogo13. Aunque se considera uno de los métodos más eficientes para introducir ADN en bacterias, la frecuencia de electroporación en B. burgdorferi es muy baja (oscilando entre 1 transformador en 5 × 104 a 5 × 106 células)13. Las barreras para lograr frecuencias más altas de transformación parecen ser tanto técnicas como biológicas. Las barreras técnicas para el éxito de la electroporación de B. burgdorferi incluyen tanto la cantidad de ADN (>10 μg) que es necesaria como el requisito de que las espiroquetas estén exactamente en la fase de crecimiento correcta (mid-log, entre 2 × 107 células·mL−1 y 7 × 107 células·mL−1) al preparar células electrocompetentes12,13. Estas barreras técnicas, sin embargo, pueden ser más fáciles de superar que las barreras biológicas.
Los investigadores de la enfermedad de Lyme reconocen que los clones de B. burgdorferi se pueden dividir en dos grandes categorías con respecto a su capacidad para ser manipulados genéticamente13,14. Los aislados de alto paso, adaptados al laboratorio, a menudo se transforman fácilmente, pero generalmente han perdido los plásmidos esenciales para la infectividad, se comportan de manera fisiológicamente aberrante y no pueden infectar a un huésped mamífero o persistir dentro de un vector de garrapatas12,13. Si bien estos clones han sido útiles para diseccionar la biología molecular de la espiroqueta dentro del laboratorio, son de poco valor para estudiar la espiroqueta dentro del contexto biológico del ciclo enzoótico. Los aislados infecciosos de paso bajo, por otro lado, se comportan de manera fisiológica que refleja un estado infeccioso y pueden completar el ciclo infeccioso, pero generalmente son recalcitrantes a la introducción de ADN heterólogo y, por lo tanto, son difíciles de manipular para el estudio12,13. La dificultad para transformar aislados de paso bajo está relacionada con al menos dos factores diferentes: (i) los aislados de paso bajo a menudo se agrupan estrechamente, particularmente en las condiciones de alta densidad requeridas para la electroporación, bloqueando así muchas células de la aplicación completa de la carga eléctrica o el acceso al ADN en el medio13,15; y (ii) B. burgdorferi codifica al menos dos sistemas diferentes de modificación de restricción transmitida por plásmidos (R-M) que pueden perderse en aislados de paso alto14,16. Los sistemas R-M han evolucionado para permitir que las bacterias reconozcan y eliminen el ADN extraño17. De hecho, varios estudios en B. burgdorferi han demostrado que las eficiencias de transformación aumentan cuando la fuente del ADN es B. burgdorferi en lugar de Escherichia coli13,16. Desafortunadamente, adquirir la alta concentración requerida de ADN para la electroporación de B. burgdorferi es una perspectiva costosa y lenta. Otra preocupación potencial al electroporar y seleccionar aislados de paso bajo es que el proceso parece favorecer a los transformadores que han perdido el plásmido crítico asociado a virulencia, lp2514,18,19; por lo tanto, el acto mismo de manipular genéticamente aislados de B. burgdorferi de paso bajo mediante electroporación puede seleccionar clones que no son adecuados para el análisis biológicamente relevante dentro del ciclo enzoótico20. Dados estos problemas, un sistema en el que el ADN heterólogo podría electrotransformarse en clones de B. burgdorferi de alto paso y luego transferirse a aislados infecciosos de paso bajo por un método distinto de la electroporación podría ser una adición bienvenida a la creciente colección de herramientas moleculares disponibles para su uso en la espiroqueta de la enfermedad de Lyme.
Además de la transformación (la captación de ADN desnudo), hay otros dos mecanismos por los cuales las bacterias toman regularmente ADN heterólogo: la conjugación, que es el intercambio de ADN entre bacterias en contacto físico directo entre sí, y la transducción, que es el intercambio de ADN mediado por un bacteriófago21. De hecho, la capacidad del bacteriófago para mediar HGT ha sido utilizada como una herramienta experimental para diseccionar los procesos moleculares dentro de varios sistemas bacterianos22,23,24. B. burgdorferi no es naturalmente competente para la absorción de ADN desnudo, y hay poca evidencia de que B. burgdorferi codifique el aparato necesario para promover una conjugación exitosa. Informes anteriores han descrito, sin embargo, la identificación y caracterización preliminar de φBB-1, un bacteriófago templado de B. burgdorferi25,26,27,28. φBB-1 empaqueta una familia de plásmidos de 30 kb encontrados dentro de B. burgdorferi25; Los miembros de esta familia han sido designados CP32. Consistente con un papel para φBB-1 en la participación en HGT entre cepas de B. burgdorferi, Stevenson et al. informaron un cp32 idéntico encontrado en dos cepas con cp32s dispares, lo que sugiere un intercambio reciente de esta cp32 entre estas dos cepas, probablemente a través de la transducción29. También hay evidencia de una recombinación significativa a través de HGT entre los cp32 en un genoma relativamente estable30,31,32,33. Finalmente, la capacidad de φBB-1 para transducir tanto cp32s como ADN vector lanzadera heterólogo entre células de la misma cepa y entre células de dos cepas diferentes ha sido demostrada previamente27,28. Dados estos hallazgos, φBB-1 se ha propuesto como otra herramienta a desarrollar para la disección de la biología molecular de B. burgdorferi.
El objetivo de este informe es detallar un método para inducir y purificar el fago φBB-1 de B. burgdorferi, así como proporcionar un protocolo para realizar un ensayo de transducción entre clones de B. burgdorferi y seleccionar y seleccionar posibles transductores.

<table><tbody><tr><td>Unidades de filtro de 1 L (PES, 0,22 y micro; m tamaño de poro)</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2GPU10RE</td><td></td></tr><tr><td>tubo de 12 mm x 75 mm (tapa de doble posición) (polipropileno)</td><td>USA Scientific</td><td>1450-0810</td><td>tiene capacidad para 4 mL con bajo volumen de vacíos (para inducción)</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cónicos de 15 mL (polipropileno)</td><td>USA Scientific</td><td>5618-8271</td><td></td></tr><tr><td>1-metil-3-nitroso-nitroguanidina (MNNG)</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td>ATENCIÓN: potencialmente cancerígeno; ya no están disponibles, no han probado ofrecen pipetas</td></tr><tr><td>Pasteur de repuesto de 5,75" (taponadas de algodón/vidrio de borosilicato/no estériles)</td><td>Autoclave Thermo Fisher Scientific</td><td>13-678-8A</td><td>antes de usar</td></tr> tubos de <tr><td>centrífuga cónicos de 50 mL (polipropileno)</td><td>USA Scientific</td><td>1500-1211</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td></td>absoluto</tr><tr><td>Agarosa LE</td><td>Dot Scientific inc.</td><td>AGLE-500</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Neopeptona</td><td>Gibco</td><td>DF0119-17-9</td><td></td></tr><tr><td>Bacto TC Yeastolate</td><td>Gibco</td><td>255772</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (grado de reemplazo sérico)</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>700-104P</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo (para biología molecular)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td>ATENCIÓN: volátil orgánico; úselo solo en una campana de extracción química</td></tr><tr><td>CMRL-1066 sin L-glutamina (polvo)</td><td>US Biological</td><td>C5900-01</td><td>grado de cultivo celular</td></tr><tr><td>Eritromicina</td><td>Research Products International Corp</td><td>E57000-25.0</td><td></td>Solución reactiva de gentamicina</tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa (dextrosa anhidra)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP350-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de kanamicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25389-94-0</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GS (0.22 &micro; Tamaño de poro M)</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLGSM33SS</td><td>para filtrar antibióticos esterilizados y otras soluciones de pequeño volumen</td></tr><tr><td>Mitomicina C</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP25312</td><td>PRECAUCIÓN: carcinógeno potencial; úselo solo en una campana de gases químicos</td></tr><tr><td>N-acetil-D-glucosamina</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>100068</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleótidos (cebadores para PCR)</td><td>IDT DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OmniPrep (kit de extracción genómica total)</td><td>G Biosciences</td><td>786-136</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri (100 mm y veces; 15 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de recuento de Petroff-Hausser</td><td>Hausser scientific</td><td>HS-3900</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de recuento de Petroff-Hausser cubreobjetos de vidrio</td><td>Hausser scientific</td><td>HS-5051</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicol 8000 (PEG)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>Suero de conejo no estéril trazas jóvenes hemolizadas (NRS)</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>31119-3</td><td>inactivo por calor según las instrucciones del fabricante</td></tr><tr><td>Cubetas semi-micro UV transparentes</td><td>USA Scientific</td><td>9750-9150</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de</td> <td>sodioThermo Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Millipore Sigma</td><td>P8674-25G</td><td></td></tr><tr><td>Spectronic Genesys 5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de sulfato de estreptomicina</td><td>Millipore Sigma</td><td>S6501-50G</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trisódico dihidratado</td><td>Millipore Sigma</td><td>S1804-500G</td><td>citrato de sodio para BSK</td></tr></tbody></table>

manipulación genética mediada por fagos de la enfermedad de lyme espiroqueta borrelia burgdorferi

Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi

La introducción de ADN extraño en la espiroqueta Borrelia burgdorferi se ha logrado casi exclusivamente mediante la transformación mediante electroporación. Este proceso tiene eficiencias notablemente más bajas en la espiroqueta de la enfermedad de Lyme en relación con otras bacterias Gram-negativas mejor caracterizadas. La tasa de éxito de la transformación depende en gran medida de tener cantidades concentradas de ADN de alta calidad de antecedentes específicos y está sujeta a una variabilidad significativa de cepa a cepa. Los medios alternativos para introducir ADN extraño (es decir, vectores lanzadera, reporteros fluorescentes y marcadores de resistencia a los antibióticos) en B. burgdorferi podrían ser una adición importante al arsenal de herramientas útiles para la manipulación genética de la espiroqueta de la enfermedad de Lyme. Los bacteriófagos han sido bien reconocidos como mecanismos naturales para el movimiento del ADN entre las bacterias en un proceso llamado transducción. En este estudio, se ha desarrollado un método para utilizar el ubicuo fago borrelial φBB-1 para transducir ADN entre células de B. burgdorferi de los mismos y diferentes antecedentes genéticos. El ADN transducido incluye tanto ADN borrelial como ADN heterólogo en forma de pequeños vectores lanzadera. Esta demostración sugiere un uso potencial de la transducción mediada por fagos como complemento de la electroporación para la manipulación genética de la espiroqueta de la enfermedad de Lyme. Este informe describe métodos para la inducción y purificación del fago φBB-1 de B. burgdorferi, el uso de este fago en ensayos de transducción y la selección y selección de transductores potenciales.

El uso de bacteriófagos para mover ADN entre cepas o clones de B. burgdorferi más fácilmente transformables que son recalcitrantes a la electrotransformación representa otra herramienta para la investigación molecular continua de los determinantes de la enfermedad de Lyme. El ensayo de transducción descrito en este documento puede modificarse según sea necesario para facilitar el movimiento de ADN entre cualquier clon de interés utilizando uno o dos antibióticos para la selección de posibles transductores. Se ha...

La capacidad de los bacteriófagos para mover el ADN entre las células bacterianas los convierte en herramientas efectivas para la manipulación genética de sus huéspedes bacterianos. Aquí se presenta una metodología para inducir, recuperar y usar φBB-1, un bacteriófago de Borrelia burgdorferi, para transducir ADN heterólogo entre diferentes cepas de la espiroqueta de la enfermedad de Lyme.

Manipulación genética mediada por fagos de la enfermedad de Lyme Espiroqueta Borrelia burgdorferi

Introducing foreign DNA into the spirochete Borrelia burgdorferi has been almost exclusively accomplished by transformation using electroporation. This ...

Este protocolo es significativo porque describe otra herramienta importante para diseccionar la biología molecular del agente de la enfermedad de Lyme Borrelia burgdorferi. La principal ventaja de esta técnica es que mediante el uso de la transducción de fagos, proporciona un método alternativo para introducir ADN en Borrelia burgdorferi sin requerir la aplicación de un pulso eléctrico, como en la electroporación. Este método podría usarse para proporcionar más información sobre los mecanismos moleculares utilizados por Borrelia burgdorferi para persistir en su ciclo enzoótico y, en última instancia, causar la enfermedad de Lyme en humanos.Para comenzar, inocule 150 microlitros del clon apropiado de Borrelia burgdorferi en 15 mililitros de BSK en tubos de centrífuga cónica estériles bien tapados para el protocolo de transducción. Luego, complemente el medio con la concentración adecuada de antibióticos o una combinación de antibióticos para la selección y mantenimiento del ADN heterólogo dentro del clon de Borrelia burgdorferi e incube la muestra a 33 grados centígrados. Después de que el cultivo haya crecido, centrifugar el volumen apropiado de cultivo a 6, 000 G durante 10 minutos.Después de decantar el sobrenadante, resuspender el pellet en cuatro mililitros en BSK fresco y transferir la muestra al tubo estéril más pequeño disponible para contener la muestra con un espacio mínimo en la cabeza. Luego, agregue la cantidad adecuada de agente inductor a la concentración recomendada basada en un volumen de cultivo de cuatro mililitros para inducir la producción de fagos, tape el tubo firmemente y mezcle bien. Incubar la muestra a 33 grados centígrados durante dos a cuatro horas.Luego, transfiera la muestra a un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Centrifugar la muestra a 6, 000 G durante 10 minutos. Después de decantar el sobrenadante, resuspender el pellet celular en 15 mililitros de BSK.Complementar el cultivo preparado con la concentración apropiada de antibióticos descrita en el manuscrito, mientras se incuba la muestra a 33 grados centígrados durante 72 a 96 horas. Para preparar soluciones para la precipitación de PEG, prepare 500 mililitros de cloruro de sodio de cinco molares, 500 mililitros de 40% PEG y 100 mililitros de medio de suspensión como se describe en el manuscrito. Para esterilizar, esterilice la solución en autoclave, enfríe antes de usarla y almacene la temperatura ambiente o cuatro grados centígrados.Para la precipitación PEG del fago del clon donante Borrelia burgdorferi, después de 72 a 96 horas de incubación, centrifugar las muestras a 8, 000 G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Decantar el sobrenadante en un tubo cónico limpio de 50 mililitros y desechar el pellet celular. Agregue cloruro de sodio de cinco molares a una concentración final de un molar.Después de mezclar bien, meca suavemente a temperatura ambiente durante una hora. Centrifugar las muestras a 8.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Después de decantar el sobrenadante en un tubo cónico limpio de 50 mililitros como se demostró anteriormente, agregue una solución de 40% PEG-8000 al sobrenadante a una concentración final de 10%Mezcle bien y colóquelo en hielo durante más de una hora, hasta toda la noche.Centrifugar a las muestras a 8.000 G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados como se demostró anteriormente. Deseche el sobrenadante y elimine la mayor cantidad de líquido en exceso posible sin perder ningún pellet, que contiene las partículas del fago. Vuelva a suspender el pellet en un volumen mínimo de medio de suspensión utilizando el medio de suspensión para lavar el costado de la botella y recoger cualquier partícula de fagos potenciales.Tratar la muestra de fagos recuperados con un volumen igual de cloroformo basado en el volumen de resuspensión. Mezclar bien la muestra y centrifugar a 8, 000 G durante 10 minutos. Luego, retire la capa acuosa a un tubo limpio, evitando cualquiera de las capas gruesas de la interfaz.Después de determinar el volumen recuperado, después del primer tratamiento con cloroformo, tratar nuevamente la muestra con una cantidad de cloroformo igual al 10% de ese volumen. Transfiera la capa acuosa a un tubo limpio teniendo cuidado de evitar cualquiera de las capas de interfaz u orgánicas. Use el fago inmediatamente o guárdelo a cuatro grados centígrados.Después de preparar los cultivos de Borrelia burgdorferi para ser utilizados como receptor en ensayos de transducción como se demostró anteriormente, centrifugar el volumen de cultivo a 6, 000 G durante 10 minutos. Decantar el sobrenadante y resuspender el pellet en 14,5 mililitros de BSK fresco. Agregue menos o igual a 500 microlitros de muestra de fagos precipitados con PEG al cultivo del clon receptor.Después de mezclar bien, incubar a 33 grados centígrados durante 72 a 96 horas. Realizar la selección de transductores por recubrimiento en fase sólida después de mezclarlos con fagos precipitados con PEG como se describe en el manuscrito. Dependiendo de los antecedentes del clon receptor, verifique que las colonias aparezcan dentro de la agarosa en las placas de selección después de 10 a 21 días de incubación.Elija al menos de 5 a 10 colonias que crezcan en la placa en presencia de ambos antibióticos usando pipeta de borosilicato esterilizada de algodón de 5.75 pulgadas e indíquelas en 1.5 mililitros de BSK con el antibiótico apropiado. La amplificación por PCR de los genes se realizó en 10 de los clones que codifican resistencia a kanamicina y gentamicina. El gen de resistencia a la kanamicina podría amplificarse a partir del donante c1673 y los transductores potenciales, pero no del receptor c1706.Del mismo modo, el gen de resistencia a la gentamicina podría amplificarse a partir del receptor c1706 y los transductores potenciales, pero no del donante, lo que representa eventos de transducción. Demostrar que el casete de resistencia a la kanamicina fue transducido por 5BB1 del donante al receptor. El fondo de los transductores se determinó utilizando marcadores específicos de la cepa.El clon c1673 y el fondo CA-112A codifican amplicones específicos cuatro, cinco y seis, mientras que c1706, que tiene un fondo B31 de paso alto, no lo hace. Del mismo modo, a los transductores uno y dos les faltaban los amplicones cuatro, cinco y seis, lo que demuestra que los clones tienen el fondo c1706 y han adquirido el gen de resistencia a la kanamicina de c1673. Para la precipitación de fagos por PEG, realice todos los pasos cuidadosamente para maximizar el rendimiento del fago y trate el fago resuspendido a fondo con cloroformo para eliminar la mayor cantidad posible de PEG y contaminantes de medios de cultivo antes del uso y almacenamiento de fagos.Una vez que el ensayo de transducción se ha realizado con éxito y el transductor verificado, estos clones están disponibles para responder a las preguntas que requieren Borrelia burgdorferi genéticamente modificada. Se espera que el desarrollo de esta técnica permita a los investigadores manipular genéticamente las cepas de Borrelia burgdorferi para las cuales la introducción de ADN a través de la electroporación es actualmente difícil.

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Investigación

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Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Lyme estudios de investigación de la enfermedad a menudo requieren la generación de garrapatas infectadas con el patógeno Borrelia burgdorferi, un proceso que suele tardar varias semanas. Aquí se demuestra un procedimiento tick microinyección basado en una infección que se puede lograr en cuestión de horas. También demostramos un método de inmunofluorescencia para la localización in situ de B. burgdorferi en garrapatas.

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Preparación e inducción de cultivos de Borrelia burgdorferi para la producción de partículas virales

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