Name: Obtención de imágenes de la cóclea envejecida con microscopía de fluorescencia de lámina de luz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Aprende a obtener imágenes 3D de la cóclea envejecida mediante microscopía de fluorescencia de lámina de luz sin destrucción mecánica. Este método permite evaluar cambios patológicos en neuronas ganglionares espirales y células ciliadas.

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Esta investigación ha sido apoyada por subvenciones del Instituto Nacional de la Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación de los Institutos Nacionales de Salud, la Fundación Kellogg y donaciones privadas de Bridget Sperl y John McCormick. TSLIM ha sido desarrollado con la excelente asistencia de Matthias Hillenbrand, Kerstin John, Meike Lawin, Michel Layher, Tobias Schroeter, Peter Schacht, Oliver Dannberg y Julian Wuester de la Universidad Técnica de Illmenau, Alemania, bajo la supervisión de sus mentores (Stefan Sinzinger y Rene Theska) y James Leger.

Todos los procedimientos y el uso de animales vivos han sido revisados y aprobados (Protocolo ID # 2010-38573A) por el Comité de Cuidado y Uso Institucional de la Universidad de Minnesota (IACUC) y los investigadores que usan estos animales han sido completamente entrenados y probados por los veterinarios de Recursos de Animales de Investigación (RAR) antes de que tengan acceso a las instalaciones para animales. Tanto ratones machos como hembras fueron utilizados en este estudio.
1. Extracción de cóclea para fijación y procesamiento de tejidos para imágenes
<ol><li>Eutanasia a un ratón mediante inhalación deCO2 . Decapitar al ratón con tijeras y hacer una incisión dorsal-ventral a través del cerebro para hemisectar el cráneo. Retire el cerebro, identifique la bulla redonda en la parte baso-ventral del cráneo, abra la bulla con rongeurs y visualice y elimine la cóclea.</li>
	<li>Fijación: Realice este procedimiento bajo una campana extractora y usando un microscopio de disección a un aumento de 5x. Use guantes y ropa protectora. Perfore la ventana oval y retire el estribo con un pico afilado. Inserte un pico en la ventana redonda para perforar la membrana.</li>
	<li>Cubra la ventana redonda abierta con la punta cortada de un equipo de perfusión conectado a una jeringa de 1 ml llena con 2 ml de formalina. Infundir lentamente formalina a través de los espacios perilinfáticos de la cóclea durante un período de 2 minutos, observando que la formalina está saliendo de la cóclea a través de la ventana oval abierta. Recorte el exceso de tejido de la cóclea y sumérjalo en una botella que contenga 10% de formalina, y colóquelo en un rotador durante la noche.</li>
	<li>Descalcificación: Enjuague la cóclea en PBS 3 veces durante 5 minutos cada una y sumérjala en una botella que contenga una solución al 10% de ácido etilendiaminotetraacético disódico (EDTA) con rotación durante 4 días, cambiando la solución diariamente.</li>
	<li>Deshidratación: Perfundir la cóclea con PBS 3x y sumergir durante 15 minutos entre cambios. Deshidratar la cóclea con concentraciones ascendentes de etanol 10%, 50%, 70%, 95%, 95%, 100%, 100%; durante 30 min en cada concentración. NOTA: Es importante eliminar todo el EDTA antes de la deshidratación, ya que el EDTA precipita en etanol. Además, las cócleas se pueden dejar en cualquier concentración de etanol superior al 70% durante la noche.</li>
	<li>Tinción: Teñir toda la cóclea por inmersión en una solución de isotiocinato de rodamina B (5 μg/mL en etanol al 100%) durante la noche con rotación. Eliminar el exceso de colorante de la cóclea con dos cambios de etanol al 100%, 5 min cada cambio.</li>
	<li>Aclaramiento: Transfiera la cóclea teñida a dos cambios de solución de Spalteholz12 (salicilato de metilo 5:3:benzoato de bencilo), 30 min cada cambio y déjelo durante la noche en la solución de aclaramiento con rotación. Las cócleas se pueden dejar en la solución de Spalteholz indefinidamente.</li>
</ol>2. Imágenes de las cócleas
<ol><li>Fije las cócleas a una varilla de muestra en el extremo de la membrana de la ventana ovalada y redonda para que la solución de limpieza permanezca dentro de la cóclea y no se formen burbujas (Figura 2). Se debe tener cuidado de no dejar que se formen burbujas dentro de la cóclea, ya que son difíciles de eliminar y, si se dejan en el tejido, causarán artefactos de imagen.</li>
	<li>Use un pegamento activador UV para unir la cóclea húmeda a la varilla de la muestra seca (Figura 2). Coloque la cóclea en los extremos ovalados y redondos de las ventanas. Cure el pegamento UV durante 10 s moviéndose alrededor de la cóclea con la luz UV. NOTA: Una fijación suelta de la cóclea a la varilla de la muestra dará lugar a defectos de imagen. Esta varilla está fabricada específicamente para este protocolo (ver Santi et al.8 para más detalles) y es específica para nuestro microscopio de lámina de luz.</li>
	<li>Suspenda la cóclea en la cámara de imágenes llena con solución de Spalteholz para la obtención de imágenes. La cámara de la muestra es una celda fluorómetro de cuarzo ópticamente transparente (Video 1).</li>
	<li>Fije la varilla de la muestra a un soporte giratorio que también esté conectado a la etapa de traslación XZ. La mayoría de las pilas se obtienen traduciendo la muestra en los planos XZ, pero también se pueden obtener pilas rotacionales.</li>
	<li>Sección óptica TSLIM: Utilice un láser azul o verde para la excitación dependiendo del tipo de tinción de fluorocromo. Coloque la lámina de luz en el centro del tejido para enfocar y determine el aumento que se utilizará para iluminar todo el ancho de la cóclea. Luego, use un programa diseñado a medida para mover la muestra a través de la hoja de luz a través de la muestra en el eje X (cosiendo la imagen) y en pasos Z para hacer una pila de imágenes 2D en toda la cóclea.</li>
	<li>Para la primera imagen, la cintura del haz de la hoja de luz se coloca en el borde de la muestra y el programa escanea todo el ancho de la muestra recolectando columnas de datos (ver costura de imagen; Santi et al.8) que son el ancho del parámetro confocal (Figura 3) para producir una imagen 2D compuesta de máxima resolución a lo ancho de la muestra. El programa automatiza la costura de imágenes para cada paso Z hasta que la muestra esté completamente fotografiada.</li>
	<li>Procesamiento de imágenes: Transfiera la pila de imágenes a otra computadora y cárguela en un programa de renderizado 3D para la reconstrucción y cuantificación 3D.</li>
</ol>

<ol><li>Deafness and hearing loss. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/deafness-and-hearing-loss">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/deafness-and-hearing-loss</a> (2021).</li>
<li>Vater, M., Kössl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+cochlear+functional+organization+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of cochlear functional organization in mammals.</a> Hearing Research. 273 (1-2), 89-99 (2011).</li>
<li>Santi, P. A., Blair, A., Bohne, B. A., Lukkes, J., Nietfeld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+digital+cytocochleogram%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">The digital cytocochleogram.</a> Hearing Research. 192 (1-2), 75-82 (2004).</li>
<li>Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal-plane+fluorescence+optical+sectioning%3A+three-dimensional+imaging+of+macroscopic+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens.</a> Journal of Microscopy. 170, 229-236 (1993).</li>
<li>Voie, A. H., Spelman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+the+cochlea+from+two-dimensional+images+of+optical+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Computerized+Medical+Imaging+and+Graphics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of the cochlea from two-dimensional images of optical sections.</a> Computerized Medical Imaging and Graphics. 19 (5), 377-384 (1995).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).</li>
<li>Santi, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-sheet+laser+imaging+microscopy+for+optical+sectioning+of+thick+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Thin-sheet laser imaging microscopy for optical sectioning of thick tissues.</a> BioTechniques. 46 (4), 287-294 (2009).</li>
<li>Schröter, T. J., Johnson, S. B., John, K., Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+thin-sheet+laser+imaging+microscopy+%28sTSLIM%29+with+structured+illumination+and+HiLo+background+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Scanning thin-sheet laser imaging microscopy (sTSLIM) with structured illumination and HiLo background rejection.</a> Biomedical Optics Express. 3 (1), 170-177 (2012).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).</li>
<li>Buytaert, J. A. N., Dirckx, J. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+quantitative+resolution+measurements+of+an+optical+virtual+sectioning+three-dimensional+imaging+technique+for+biomedical+specimens%2C+featuring+two-micrometer+slicing+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Design and quantitative resolution measurements of an optical virtual sectioning three-dimensional imaging technique for biomedical specimens, featuring two-micrometer slicing resolution.</a> Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 014039(2007).</li>
<li>Spalteholz, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpalteholz%2C+W+%22On+making+human+and+animal+preparations+transparent%22">On making human and animal preparations transparent</a>. , S. Hierzel. Leipzig, Germany. (1914).</li>
<li>Johnson, S., Schmitz, H., Santi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TSLIM+imaging+and+a+morphometric+analysis+of+the+mouse+spiral+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">TSLIM imaging and a morphometric analysis of the mouse spiral ganglion.</a> Hearing Research. 278 (1-2), 34-42 (2011).</li>
<li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+of+Corti+surface+preparations+for+computer-assisted+morphometry%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Organ of Corti surface preparations for computer-assisted morphometry.</a> Hearing Research. 24 (3), 179-187 (1986).</li>
<li>Brown, D., Pastras, C., Curthoys, I., Southwell, C., Van Roon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endolymph+movement+visualized+with+light+sheet+fluorescence+microscopy+in+an+acute+hydrops+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Endolymph movement visualized with light sheet fluorescence microscopy in an acute hydrops model.</a> Hearing Research. 339, 112-124 (2016).</li>
<li>White, J. A., Burgess, B. J., Hall, R. D., Nadol, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+degeneration+of+the+spiral+ganglion+cell+and+its+processes+in+the+C57BL%2F6J+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Pattern of degeneration of the spiral ganglion cell and its processes in the C57BL/6J mouse.</a> Hearing Research. 141 (1-2), 12-18 (2000).</li>
<li>Grierson, K. E., Hickman, T. T., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+and+cholinergic+innervation+in+the+mouse+cochlea+after+noise-induced+or+age-related+synaptopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic and cholinergic innervation in the mouse cochlea after noise-induced or age-related synaptopathy.</a> Hearing Research. 422, 108533(2022).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La sección óptica por microscopía de lámina de luz para el examen de estructuras cocleares no es mecánicamente destructiva como otros métodos histológicos más tradicionales, y proporciona una visión digital completa de las estructuras cocleares entre sí. Los métodos anteriores, como las preparaciones superficiales del órgano de Corti14 , proporcionaron un mapa de la pérdida de células ciliadas a lo largo de la membrana basilar, pero la pérdida de SGN no pudo evaluarse ya que el tejido había sido d...

La cóclea es el órgano sensorial periférico para la audición en los mamíferos. Tiene una compleja anatomía en espiral de células sensoriales y de soporte repetitivas que están anatómicamente especializadas para detectar vibraciones sonoras y transmitirlas al cerebro para la percepción de la audición. Los principales elementos sensoriales son las células ciliadas internas y externas y sus fibras nerviosas inervantes cuyos cuerpos celulares componen el ganglio espiral, que reside dentro del canal de Rosenthal (Figura 1). Estas estructuras sensoriales y neuronales están dispuestas tonotópicamente de tal manera que los sonidos de alta frecuencia se transducen en la base coclear y los sonidos de baja frecuencia se transducen en el ápice de la cóclea2. Un mapa anatómico de esta distribución celular sensorial a lo largo de la longitud en espiral de la membrana basilar de soporte se denomina citococleografía3 y se puede comparar con la pérdida auditiva en función de la frecuencia como se muestra en un audiograma.
El laberinto membranoso de la cóclea, que está rodeado de hueso denso, hace que sea técnicamente difícil examinar más de una estructura coclear a la vez. Por lo tanto, la razón para desarrollar un microscopio de lámina de luz es producir secciones seriadas bien alineadas de la cóclea completa para que todas las estructuras cocleares puedan examinarse entre sí en reconstrucciones 3D. Voie et al.4 y Voie y Spelman5 diseñaron el primer microscopio de lámina de luz, llamado microscopio de sección óptica de fluorescencia plana ortogonal (OPFOS), para seccionar ópticamente toda la cóclea. Sin embargo, este microscopio nunca fue desarrollado comercialmente; por lo tanto, nuestro objetivo era construir un microscopio de lámina de luz llamado microscopio de imagen láser de hoja delgada (TSLIM; Figura 2). Los detalles de diseño y construcción de TSLIM se han publicado anteriormente8. TSLIM realizó varias mejoras sobre el OPFOS, incluido el uso de una cámara digital con poca luz frente a una cámara CCD para la recolección de imágenes, microposicionadores codificados ópticamente para un movimiento preciso y reproducible de la muestra a través de la hoja de luz, el uso de una cámara de muestra ópticamente clara disponible comercialmente y la tinción de rodamina en etanol en lugar de en la solución de limpieza para evitar la precipitación de manchas dentro del tejido. El desarrollo comercial de microscopios de lámina de luz como SPIM6 se ha centrado en imágenes de alta resolución de pequeñas muestras transparentes vivas, pero no son adecuadas para imágenes cocleares completas ya que carecen de una distancia de trabajo adecuada. Una revisión del desarrollo de otros microscopios de lámina de luz fue publicada por Santi7. La principal ventaja de TSLIM sobre otros métodos histológicos para examinar la cóclea es seccionar ópticamente los tejidos para la reconstrucción 3D mientras se preserva la integridad de la muestra para que pueda ser utilizada por otros métodos histológicos. Otra ventaja de las imágenes TSLIM es que solo una lámina de luz delgada producida por un láser se expone al tejido, en comparación con la exposición del espesor del tejido completo al láser como en la microscopía confocal. La limpieza del tejido para minimizar la dispersión de la luz y el hecho de que solo una pequeña porción del tejido está expuesta al láser da como resultado un desvanecimiento mínimo del fluorocromo (fotoblanqueo) con imágenes láser de lámina de luz. Sin embargo, el proceso de fijación, deshidratación y limpieza altera la morfología de las estructuras cocleares y da como resultado la contracción del tejido en comparación con el tejido vivo. No se determinó la cantidad real de contracción del tejido que se produce.
TSLIM fue desarrollado por Shane Johnson y ocho estudiantes alemanes de ingeniería óptica (ver Agradecimientos). Los detalles de construcción de TSLIM fueron proporcionados por Santi et al.8 y una versión de escaneo (sTSLIM) por Schröter et al.9. TSLIM funciona como un microtomo no destructivo para seccionar ópticamente muestras y como un microscopio para recolectar secciones seriadas 2D a través de todo el ancho y grosor de la cóclea. TSLIM puede obtener imágenes de especímenes gruesos pequeños (mm) y grandes (cm). Las lentes están montadas en el aire para permitir largas distancias de trabajo con objetivos de recolección de 1x y 2x en un microscopio de disección. El microscopio de disección también tiene óptica de zoom que permite a TSLIM resolver estructuras subcelulares y sinápticas en las células. TSLIM está equipado con un láser azul (473 nm) y verde (532 nm) para la iluminación que permite utilizar una variedad de sondas fluorescentes para la obtención de imágenes. El objetivo de TSLIM es producir secciones ópticas 2D bien alineadas a través de una cóclea completa para una reconstrucción digital completa de los tejidos cocleares. Dado que es un método fluorescente, los ligandos y la inmunohistoquímica también se pueden utilizar para identificar estructuras cocleares específicas.
Inicialmente, se utilizó una lente cilíndrica para producir dos láminas de luz gaussianas opuestas, pero produjo artefactos de imágenes de absorción. Debido al trabajo de Keller et al.10, la lente cilíndrica fija fue reemplazada por un espejo galvanómetro de escaneo para producir la lámina de luz9. Además, dado que el centro de la hoja de luz es el más delgado en la cintura del haz, las imágenes 2D de sTSLIM se producen mediante la recopilación de un compuesto de columnas de datos del eje X a lo ancho de la muestra (Figura 3). Este método fue descrito por primera vez por Buytaert y Dircks11. El software personalizado TSLIM para conducir y recopilar imágenes se desarrolló utilizando un programa gráfico para el control del instrumento. La lámina de luz viaja a través de la muestra e ilumina un plano fluorescente dentro del tejido. Este plano fluorescente se proyecta ortogonalmente a través de la muestra transparente y se recoge mediante un microscopio de disección. Los microposicionadores codificados ópticamente permiten escanear a través de la cintura del haz en el eje X para recopilar una sola imagen 2D compuesta y, posteriormente, el microposicionador del eje Z mueve la muestra a un plano más profundo dentro del tejido para obtener una pila de imágenes 2D seccionadas en serie (Video 1, Figura 4). Se recopila una pila de imágenes traslacionales a través de todo el ancho, grosor y longitud de la cóclea, y no es necesario coser imágenes (Video 2). La pila de imágenes se transfiere a otra computadora y se carga en un programa de renderizado 3D para la reconstrucción y cuantificación 3D. Las pilas de imágenes contienen toda la información digital sobre la morfología de una cóclea a la resolución del microscopio. Sin embargo, si se requiere una resolución más alta, la cóclea intacta puede procesarse aún más mediante métodos histológicos destructivos como la sección de microtomos, el escaneo y la microscopía electrónica de transmisión.
El programa de renderizado 3D se utiliza para segmentar diferentes estructuras cocleares para renderizado 3D y análisis cuantitativo. Para la segmentación, cada estructura en cada imagen 2D de la pila se traza utilizando un color diferente mediante una tableta gráfica y un lápiz (Figura 5). Hasta la fecha, se han segmentado 20 estructuras cocleares diferentes (Figura 6). Después de la segmentación, se puede realizar una variedad de análisis 3D. Por ejemplo, el software de renderizado 3D puede resecar virtualmente la cóclea en cualquier plano a lo largo del centroide de la estructura. El video 3 muestra la sección tangencial al órgano de Corti, que revela las células ciliadas a lo largo de la membrana basilar. Este proceso requiere primero la segmentación manual de la estructura de interés. A continuación, el centroide de la estructura se calcula en función del ajuste de mínimos cuadrados de los puntos spline colocados a lo largo del centro de la estructura desde su base hasta su ápice, lo que permite una aproximación de la longitud de la estructura (Video 4). Un proceso similar llamado esqueletización se puede utilizar para visualizar el ancho radial de la estructura a lo largo de su longitud utilizando un mapa de color (Video 4). El volumen total de cada estructura es calculado por el programa después de la segmentación, pero las distancias relativas también se pueden cuantificar y visualizar con mapas de color en un software de renderizado 3D (Figura 7). Las estructuras segmentadas también se pueden exportar para producir representaciones de modelos de plástico sólido ampliadas (Figura 8). Además, el recuento semiautomático de células también se puede realizar utilizando software de renderizado 3D (Figura 9). La inmunohistoquímica y la unión al ligando se pueden utilizar para teñir estructuras cocleares específicas y estas estructuras pueden aislarse de otras estructuras cocleares para la evaluación morfométrica, como la producción de un citocleograma (Figura 10). La longitud, el ancho, la superficie, el volumen y el número de todas las estructuras cocleares se pueden determinar a partir de los modelos 3D, lo que hace que este enfoque sea ideal para mapear el daño coclear a las deficiencias funcionales. Específicamente, el daño coclear debido al envejecimiento, el trauma inducido por el ruido u otros insultos se pueden mostrar y cuantificar en reconstrucciones cocleares 3D a partir de secciones ópticas 2D. Una vez que una cóclea ha sido digitalizada, existen numerosos algoritmos de imagen que se pueden utilizar para evaluar el daño coclear de cualquier tejido dentro de la cóclea en el registro anatómico a otros tejidos cocleares.

<table><tbody><tr><td>Amira Software de renderizado 3D</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>Dirección: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433</td></tr><tr><td>benzoato de bencilo (W213810)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td></td><td>Dirección: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178</td></tr><tr><td>Bondic&nbsp;</td><td>Bondic&nbsp;</td><td></td><td>Dirección: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada</td></tr><tr><td>Ethanol 95% y 100%&nbsp;</td><td>Universidad de Minnesota</td><td></td><td>Dirección: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455</td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético sódico sódico sal dihidratado (EDTA)&nbsp; (E5134)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td></td><td>Dirección: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178</td></tr><tr><td>Programa gráfico LabVIEW y Vision</td><td>National Instruments</td><td></td><td>Dirección: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504</td></tr><tr><td>salicilato de metilo (M6742)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td></td><td>Dirección: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178</td></tr><tr><td>Microscopio de disección Olympus MVX10</td><td>Olympus Corp</td><td></td><td>Dirección: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034</td></tr><tr><td>Isotiocinato de rodamina B, (283924)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td></td><td>Dirección: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178</td></tr><tr><td>Starna Flurometer Cell (3-G-20)</td><td>Starna Cells</td><td></td><td>Dirección: PO Box 1919, Atascadero, CA 82423</td></tr></tbody></table>

obtención de imágenes de la cóclea envejecida con microscopía de fluorescencia de lámina de luz

Imaging the Aging Cochlea with Light-Sheet Fluorescence Microscopy

La sordera es el deterioro sensorial más común, que afecta aproximadamente al 5% o 430 millones de personas en todo el mundo según la Organización Mundial de la Salud1. El envejecimiento o presbiacusia es una causa primaria de pérdida auditiva neurosensorial y se caracteriza por daño a las células ciliadas, las neuronas ganglionares espirales (SGN) y la estría vascular. Estas estructuras residen dentro de la cóclea, que tiene una anatomía compleja en forma de espiral de tejidos membranosos suspendidos en líquido y rodeados de hueso. Estas propiedades hacen que sea técnicamente difícil investigar y cuantificar los cambios histopatológicos. Para abordar esta necesidad, desarrollamos un microscopio de lámina de luz (TSLIM) que puede obtener imágenes y digitalizar toda la cóclea para facilitar el estudio de las relaciones estructura-función en el oído interno. Las secciones seriales bien alineadas de toda la cóclea dan como resultado una pila de imágenes para la representación tridimensional (3D) del volumen y la segmentación de estructuras individuales para la visualización 3D y el análisis cuantitativo (es decir, longitud, anchura, superficie, volumen y número). Las cócleas requieren pasos de procesamiento mínimos (fijación, descalcificación, deshidratación, tinción y limpieza óptica), todos los cuales son compatibles con imágenes posteriores de alta resolución mediante microscopía electrónica de barrido y transmisión. Dado que todos los tejidos están presentes en las pilas, cada estructura se puede evaluar individualmente o en relación con otras estructuras. Además, dado que las imágenes utilizan sondas fluorescentes, la inmunohistoquímica y la unión de ligandos se pueden utilizar para identificar estructuras específicas y su volumen o distribución 3D dentro de la cóclea. Aquí utilizamos TSLIM para examinar las cócleas de ratones envejecidos para cuantificar la pérdida de células ciliadas y neuronas ganglionares en espiral. Además, se utilizaron análisis avanzados (por ejemplo, análisis de conglomerados) para visualizar reducciones locales de neuronas ganglionares espirales en el canal de Rosenthal a lo largo de su volumen 3D. Estos enfoques demuestran la capacidad de la microscopía TSLIM para cuantificar las relaciones estructura-función dentro y entre las cócleas.

Dado que el tema de este número especial es la imagen de los efectos del envejecimiento en la cóclea, se usarán como ejemplos una cóclea joven (ratón de cepa CBA de 3 meses de edad, HS2479, ratón de cepa CBA) y envejecida (23 meses de edad, HS2521, ratón cepa C57). Cabe señalar que TSLIM es capaz de obtener imágenes de una variedad de especímenes, incluidas cócleas de humanos, mamíferos, otros roedores y peces, así como otros órganos como el cerebro.
Johnson et al. 13 p...

Se desarrolló un microscopio de hoja de luz para obtener imágenes y digitalizar toda la cóclea.

Obtención de imágenes de la cóclea envejecida con microscopía de fluorescencia de lámina de luz

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or ...

Hemos desarrollado un microscopio de lámina de luz que puede digitalizar toda la cóclea. Este microscopio tiene objetivos montados en el aire con una larga distancia de trabajo que pueden obtener imágenes de pequeñas cócleas de ratón hasta un gran hueso temporal humano. Secciona en serie la cóclea con un rayo láser sin causar ninguna destrucción mecánica.Nuestro método de imagen se puede utilizar para evaluar los cambios patológicos en la cóclea, como la pérdida de células ciliadas y neuronas ganglionares espirales debido al envejecimiento. Después de sacrificar y decapitar a un ratón, haga una incisión dorsal-ventral a través del cerebro para hemisectar el cráneo. Extirpar el cerebro e identificar la bulla redonda en la parte basoventral del cráneo.Abre la bulla con rongeurs. Luego, visualice y retire la cóclea. Bajo un microscopio de disección con un aumento de cinco veces, perfore la ventana oval y retire el estribo con un pico afilado.Luego, inserte un pico en la ventana redonda para perforar la membrana. Para realizar la fijación, cubra la ventana redonda abierta con la punta cortada de un equipo de infusión que se conecta a una jeringa de un mililitro llena con dos mililitros de formalina. Infundir lentamente formalina a través de los espacios perilinfáticos de una cóclea durante un período de dos minutos, asegurándose de que la formalina salga de la cóclea a través de la ventana oval abierta.Recorte el exceso de tejido de la cóclea. Sumérjalo en una botella que contenga 10% de formalina y colóquelo en un rotador durante la noche. Para la descalcificación, enjuague la cóclea en PBS tres veces durante cinco minutos cada una.Sumergir en una botella que contenga una solución al 10% de EDTA. Incubarlo durante cuatro días con rotación, cambiando la solución diariamente. Luego, perfunda la cóclea con PBS tres veces y sumérgela durante 15 minutos entre cambios para eliminar todo el EDTA.Después del lavado, deshidratar la cóclea con concentraciones ascendentes de etanol durante 30 minutos en cada concentración. Manchar toda la cóclea por inmersión en solución de rodamina B durante la noche con rotación. Eliminar el exceso de colorante de la cóclea con dos cambios de etanol al 100% con incubación durante cinco minutos por cada cambio.Transfiera la cóclea teñida a dos cambios de solución de Spalteholz durante 30 minutos en cada cambio. Dejar toda la noche en la solución de limpieza con rotación. Fije la cóclea a una varilla de muestra en el extremo ovalado y redondo de la membrana de la ventana.Asegúrese de que la solución de limpieza permanezca dentro de la cóclea y que no se formen burbujas. Fije los extremos ovalados y redondos de la cóclea húmeda a la varilla de la muestra seca utilizando pegamento activador UV. Cure el pegamento UV durante 10 segundos moviéndose alrededor de la cóclea con una luz UV.Suspenda la cóclea en la cámara de imágenes en una celda fluorómetro de cuarzo ópticamente transparente llena con solución de Spalteholz con la varilla de la muestra unida a un soporte giratorio que también está conectado a la etapa de traslación X/Z. Luego, use un programa diseñado a medida para mover la muestra a través de la hoja de luz en los pasos del eje X y Z y haga una pila de imágenes 2D en toda la cóclea. Para procesar la imagen, transfiera la pila de imágenes a otro equipo y cárguela en un programa de representación 3D para la reconstrucción y cuantificación 3D.La representación del volumen directo de una cóclea de ratón mostró las ventanas ovaladas y redondas, órgano de Corti con células ciliadas, el canal de Rosenthal estaba segmentado y el volumen renderizado, y mostró neuronas ganglionares espirales, o SGN, a lo largo de su longitud. Usando TSLIM, se tomaron imágenes de la cóclea de un ratón joven de tres meses y un ratón de 23 meses de edad y se contaron para SGN. Los recuentos de células SGN en función de la distancia del canal de Rosenthal representada en una gráfica lineal mostraron mayores SGN en el animal más joven en los extremos medio y apical de la cóclea en comparación con el animal más viejo.Esta aparente pérdida de SGNs se visualizó mediante el análisis de clústeres y software de renderizado 3D. Las diferencias de densidad de SGN se representaron en una escala de color donde los grupos de alta densidad son amarillos y el azul representa regiones de menor densidad. El análisis de conglomerados describió claramente las regiones de menor densidad celular a lo largo del canal de Rosenthal.La microscopía de hoja de luz está diseñada para producir una pila de imágenes bien alineadas a partir de las cuales se pueden producir representaciones de volumen 3D de estructuras. Los programas de renderizado 3D permiten la evaluación cuantitativa de estructuras y relaciones anatómicas entre diferentes estructuras. Sin embargo, dado que los programas de renderizado 3D ofrecen muchos parámetros de usuario diferentes, existe una curva de aprendizaje significativa para usar estos programas de manera efectiva.

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Investigación

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Neurociencia

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