Obtención de imágenes de la cóclea envejecida con microscopía de fluorescencia de lámina de luz

Hemos desarrollado un microscopio de lámina de luz que puede digitalizar toda la cóclea. Este microscopio tiene objetivos montados en el aire con una larga distancia de trabajo que pueden obtener imágenes de pequeñas cócleas de ratón hasta un gran hueso temporal humano. Secciona en serie la cóclea con un rayo láser sin causar ninguna destrucción mecánica.

Nuestro método de imagen se puede utilizar para evaluar los cambios patológicos en la cóclea, como la pérdida de células ciliadas y neuronas ganglionares espirales debido al envejecimiento. Después de sacrificar y decapitar a un ratón, haga una incisión dorsal-ventral a través del cerebro para hemisectar el cráneo. Extirpar el cerebro e identificar la bulla redonda en la parte basoventral del cráneo.

Abre la bulla con rongeurs. Luego, visualice y retire la cóclea. Bajo un microscopio de disección con un aumento de cinco veces, perfore la ventana oval y retire el estribo con un pico afilado.

Luego, inserte un pico en la ventana redonda para perforar la membrana. Para realizar la fijación, cubra la ventana redonda abierta con la punta cortada de un equipo de infusión que se conecta a una jeringa de un mililitro llena con dos mililitros de formalina. Infundir lentamente formalina a través de los espacios perilinfáticos de una cóclea durante un período de dos minutos, asegurándose de que la formalina salga de la cóclea a través de la ventana oval abierta.

Recorte el exceso de tejido de la cóclea. Sumérjalo en una botella que contenga 10% de formalina y colóquelo en un rotador durante la noche. Para la descalcificación, enjuague la cóclea en PBS tres veces durante cinco minutos cada una.

Sumergir en una botella que contenga una solución al 10% de EDTA. Incubarlo durante cuatro días con rotación, cambiando la solución diariamente. Luego, perfunda la cóclea con PBS tres veces y sumérgela durante 15 minutos entre cambios para eliminar todo el EDTA.

Después del lavado, deshidratar la cóclea con concentraciones ascendentes de etanol durante 30 minutos en cada concentración. Manchar toda la cóclea por inmersión en solución de rodamina B durante la noche con rotación. Eliminar el exceso de colorante de la cóclea con dos cambios de etanol al 100% con incubación durante cinco minutos por cada cambio.

Transfiera la cóclea teñida a dos cambios de solución de Spalteholz durante 30 minutos en cada cambio. Dejar toda la noche en la solución de limpieza con rotación. Fije la cóclea a una varilla de muestra en el extremo ovalado y redondo de la membrana de la ventana.

Asegúrese de que la solución de limpieza permanezca dentro de la cóclea y que no se formen burbujas. Fije los extremos ovalados y redondos de la cóclea húmeda a la varilla de la muestra seca utilizando pegamento activador UV. Cure el pegamento UV durante 10 segundos moviéndose alrededor de la cóclea con una luz UV.

Suspenda la cóclea en la cámara de imágenes en una celda fluorómetro de cuarzo ópticamente transparente llena con solución de Spalteholz con la varilla de la muestra unida a un soporte giratorio que también está conectado a la etapa de traslación X/Z. Luego, use un programa diseñado a medida para mover la muestra a través de la hoja de luz en los pasos del eje X y Z y haga una pila de imágenes 2D en toda la cóclea. Para procesar la imagen, transfiera la pila de imágenes a otro equipo y cárguela en un programa de representación 3D para la reconstrucción y cuantificación 3D.

La representación del volumen directo de una cóclea de ratón mostró las ventanas ovaladas y redondas, órgano de Corti con células ciliadas, el canal de Rosenthal estaba segmentado y el volumen renderizado, y mostró neuronas ganglionares espirales, o SGN, a lo largo de su longitud. Usando TSLIM, se tomaron imágenes de la cóclea de un ratón joven de tres meses y un ratón de 23 meses de edad y se contaron para SGN. Los recuentos de células SGN en función de la distancia del canal de Rosenthal representada en una gráfica lineal mostraron mayores SGN en el animal más joven en los extremos medio y apical de la cóclea en comparación con el animal más viejo.

Esta aparente pérdida de SGNs se visualizó mediante el análisis de clústeres y software de renderizado 3D. Las diferencias de densidad de SGN se representaron en una escala de color donde los grupos de alta densidad son amarillos y el azul representa regiones de menor densidad. El análisis de conglomerados describió claramente las regiones de menor densidad celular a lo largo del canal de Rosenthal.

La microscopía de hoja de luz está diseñada para producir una pila de imágenes bien alineadas a partir de las cuales se pueden producir representaciones de volumen 3D de estructuras. Los programas de renderizado 3D permiten la evaluación cuantitativa de estructuras y relaciones anatómicas entre diferentes estructuras. Sin embargo, dado que los programas de renderizado 3D ofrecen muchos parámetros de usuario diferentes, existe una curva de aprendizaje significativa para usar estos programas de manera efectiva.