Name: Aislamiento de pequeños folículos preantrales del ovario bovino mediante una combinación de fragmentación, homogeneización y filtración en serie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Aprenda a aislar folículos preantrales de ovario bovino mediante fragmentación, homogeneización y filtración en serie. Este protocolo mecánico eficiente mejora la viabilidad y permite estudios de foliculogénesis en diversas especies.

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Este proyecto fue parcialmente financiado por el proyecto multiestatal W4112 del USDA y el premio Jastro Shields de UC Davis a SM.
Los autores desean extender su agradecimiento a Central Valley Meat, Inc. por proporcionar los ovarios bovinos utilizados en todos los experimentos. Los autores también agradecen a Olivia Silvera por su ayuda con el procesamiento de los ovarios y el aislamiento del folículo.

Los autores no tienen nada que revelar.

El presente protocolo detalla un método reproducible para recuperar folículos preantrales en etapa temprana, específicamente en etapas primarias y secundarias tempranas, del ovario bovino. Este protocolo se basa en informes anteriores 20,25,30,34,35,36 y proporciona optimizaciones que resultan en el aislamiento de un número significativo de folículos de un ovario individual.<sup clas...

Los folículos ováricos son las unidades funcionales del ovario, responsables de la producción del gameto (ovocito), así como de las hormonas críticas para la función reproductiva y la salud en general. Los folículos primordiales se forman en el ovario durante el desarrollo fetal o en el período neonatal dependiendo de la especie1, y constituyen la reserva ovárica de una hembra. El crecimiento folicular comienza con la activación de los folículos primordiales que salen de la piscina de descanso y entran en la fase de crecimiento. La foliculogénesis preantral, que abarca todas las etapas del folículo antes del desarrollo del antro, es un proceso altamente dinámico que requiere cambios morfológicos y metabólicos sincrónicos en el ovocito y las células de la granulosa circundantes, impulsados por una estrecha comunicación entre estos dos tipos celulares 2,3. Los folículos preantrales constituyen la mayoría de las unidades foliculares que se encuentran en el ovario en un momento dado4. Se estima que el desarrollo a través de las etapas preantral de la foliculogénesis es varias semanas más largo que el desarrollo antral 5,6, y este tiempo es necesario para que el ovocito y las células somáticas adquieran la madurez suficiente para entrar en la etapa final de desarrollo (es decir, la etapa antral) y prepararse para la ovulación, la fertilización y el desarrollo embrionario 7,8,9.
Gran parte del conocimiento actual sobre la foliculogénesis preantral ovárica proviene de modelos de ratón10,11,12,13, debido en parte a la facilidad para recuperar un gran número de estos folículos de un ovario más pequeño y menos fibroso. Aunque los informes de aislamiento de un gran número de folículos preantrales de ovarios bovinos datan de aproximadamente 30 años14, una comprensión más completa sobre los procesos que regulan el desarrollo de estos folículos en etapa temprana ha permanecido sin realizar, en gran parte debido a la falta de métodos optimizados, eficientes y repetibles para recuperar un número suficiente de folículos preantrales viables, particularmente en las primeras etapas de desarrollo. Con el creciente interés en preservar la reserva ovárica para su uso futuro en reproducción asistida en humanos, las vacas se convierten en un modelo atractivo debido a su estructura ovárica más similar15. Sin embargo, el ovario bovino es marcadamente más rico en colágeno en comparación con el ovario del ratón16, lo que hace que el aislamiento mecánico utilizando métodos descritos para el ratón sea muy ineficiente. Los esfuerzos para ampliar las técnicas de preservación de la fertilidad incluyen el crecimiento completo in vitro de los folículos preantrales hasta la etapa antral, seguido de la maduración in vitro (MIV) de los ovocitos adjuntos, la fertilización in vitro (FIV) y la producción y transferencia de embriones17. Hasta ahora, todo este proceso solo se ha logrado en ratones18. En bovinos, el progreso hacia el crecimiento folicular in vitro se limita a unos pocos informes con etapas foliculares variables al inicio del cultivo, así como duración variable del cultivo entre los protocolos17,19.
Los métodos descritos en la literatura para la recolección de folículos preantrales del ovario bovino han utilizado principalmente técnicas mecánicas y enzimáticas, aisladas o en combinación 2,14,17,20. El primer informe de un protocolo para el aislamiento del folículo preantral bovino utilizó un homogeneizador tisular y filtración seriada para procesar ovarios enteros20. Este estudio fue seguido por informes que combinaron procedimientos mecánicos y enzimáticos que utilizaron colagenasa14. Un tema recurrente cuando se utiliza colagenasa para digerir el tejido ovárico es el riesgo potencial de daño de la membrana basal folicular, que puede comprometer la viabilidad del folículo 14,21,22,23. Por lo tanto, se han empleado diferentes combinaciones de métodos mecánicos, como el uso de un picador de tejidos y pipeteo repetido o un picador de tejidos combinado con homogeneización20,24,25,26. Otra técnica mecánica que se ha descrito utiliza agujas para diseccionar folículos preantrales directamente del tejido ovárico, lo que es especialmente útil para aislar folículos secundarios más grandes (>200 μm). Sin embargo, este proceso requiere mucho tiempo, es ineficiente para aislar folículos preantrales más pequeños y depende del conjunto de habilidades cuando se intenta en ovarios bovinos 19,27,28.
Aprovechando las diferentes técnicas descritas en la literatura, este protocolo tuvo como objetivo optimizar el aislamiento de folículos preantrales de ovarios bovinos individuales de una manera simple, consistente y eficiente que evite la incubación en soluciones enzimáticas. La mejora de los métodos para aislar los folículos preantrales brindará la oportunidad de mejorar la comprensión de esta etapa de la foliculogénesis y permitirá el desarrollo de sistemas de cultivo efectivos para desarrollar folículos preantrales hasta la etapa antral. Los procedimientos detallados descritos en este documento para el aislamiento de folículos preantrales de un mamífero grande como la especie bovina serán vitales para los investigadores que buscan estudiar la foliculogénesis temprana en una especie no murina que sea traducible a los humanos.

<table><tbody><tr><td>5-3/4" Soda Cal Vidrio Desechable Pipeta Pasteur</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>63A54</td><td>Pipeta Pasteur que se puede utilizar para desalojar folículos de los residuos mientras se busca dentro de la placa de Petri</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehído</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>diluido al 4%; fijación de folículos para inmunotinción</td></tr><tr><td>20 mL Jeringa Luer-lock</td><td>Fisher Scientific</td><td>Z116882-100EA</td><td>Jeringa utilizada con la aguja de 18 G para desalojar los folículos de la aguja 40 &mu; m colador de células</td></tr><tr><td>#21 Hoja de bisturí estéril</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-365-023</td><td>Se utiliza para cortar los ovarios y extraer la médula</td></tr><tr><td>40 &mu; m Filtro de células</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>22-363-547</td><td>Se utiliza para filtrar el filtrado del 300 &mu; m colador de células</td></tr><tr><td>104 mm Embudo de plástico</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-348C</td><td>El tamaño puede variar, pero asegúrese de que la gasa esté cortada correctamente y que el homogeneizado ovárico no se derrame más de</td></tr><tr><td>300 &mu; m Filtro de celdas</td><td>pluriSelect&nbsp;</td><td>43-50300-03</td><td>Se utiliza para filtrar el filtrado de la gasa&nbsp;</td></tr><tr><td>500 mL Erlenmeyer Flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB500500</td><td>Embudo y matraz utilizados para recoger el filtrado de la gasa&nbsp;</td></tr><tr><td>Agujas estériles Air-Tite 18 g</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-817-151</td><td>18 g ofrece suficiente presión para desalojar los folículos de los 40 &mu; colador de células m</td></tr><tr><td>Air-Tite Agujas estériles 27 g 13 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-171</td><td>Agujas que se pueden utilizar para manipular cualquier residuo en el que se peguen folículos</td></tr><tr><td>BD Hoechst 33342 Solución Fisher Scientific</td><td></td><td>BDB561908</td><td>Tinción de ADN fluorescente</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-100G&nbsp;</td><td>Componente de los medios de lavado de folículos</td></tr><tr><td>Estopilla de queso</td><td>Microscopía Electrónica Sciences</td><td>71748-00</td><td>Primer paso de filtrado del homogeneizado ovárico destinado a eliminar los restos de tejido grandes</td></tr><tr><td>Hojas de afeitar de seguridad clásicas de doble filo</td><td>Wilkinson Sword</td><td>N/A</td><td>Hojas de afeitar que se ajustan mejor en el McIlwain Tissue Chopper y no se desafilan rápidamente</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario Donkey-Anti-Rabbit, Alexa Fluor 488</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-21206</td><td>Anticuerpo secundario para inmunotinción</td></tr><tr><td>Eisco Látex Bulbos de pipeta</td><td>Fisher Scientific</td><td>S29388</td><td>Bombilla de goma para usar con pipetas</td></tr><tr><td>Pasteur Tampón HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Componente de los medios de lavado de folículos</td></tr><tr><td>Homogeneizador</td><td>VWR</td><td>10032-336</td><td>Homogeneizar el tejido ovárico para liberar folículos&nbsp;</td></tr><tr><td>ImageJ/Fiji</td><td>NIH</td><td>v2.3.1</td><td>Software utilizado para el análisis de fluorescencia-inmunolocalización</td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>Ted Pella</td><td>10184</td><td>Se utiliza para cortar tejido ovárico lo suficientemente pequeño como para homogeneizarlo</td></tr><tr><td>Microscopio - Estereoscopio</td><td>Olympus</td><td>SZX2-ILLT</td><td>Microscopio de disección utilizado para buscar y recolectar folículos del</td></tr><tr><td>filtrado Microscopio - Nikon invertido</td><td></td><td>Diaphot 300</td><td>Microscopio invertido utilizado para la visualización de campo claro de folículos aislados con gran aumento</td></tr><tr><td>Microscopio - ECHO Revolve</td><td></td><td>R4</td><td>invertido para la visualización de campo claro y epifluorescencia de folículos aislados con gran aumento</td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410-1L Aceite</td><td>para cubrir las gotas de folículo Medio de lavado para evitar la evaporación durante la búsqueda</td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>Componente del medio de lavado de folículos</td></tr><tr><td>Suero de burro normal</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-001</td><td>Reactivo para tampón bloqueante de inmunotinción</td></tr><tr><td>Nunc Placas de 4 pocillos para FIV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>144444</td><td>Placas de 4 pocillos para el aislamiento y lavado de folículos</td></tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina 100x</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td>Componente del medio de lavado de folículos Placa de</td></tr><tr><td>Petri 60 mm OD x 13,7 mm</td><td>Ted Pella</td><td>10184-04 Placa de</td><td>Petri que se adapta mejor en el McIlwain Tissue Chopper</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP665-1</td><td>Tampón de lavado para ovarios y folículos</td></tr><tr><td>Tabla de cortar de plástico</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-002-24A</td><td>Tabla de cortar de tamaño suficiente para cortar de forma segura ovarios</td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidona (PVP)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP431-100</td><td>La adición de PVP (0,1% p/v) al PBS evita que los folículos se peguen a la placa o entre sí...</td></tr><tr><td>ProLong Gold Mountant Antidecoloración</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td>Medio de montaje para células o tejidos marcados con fluorescencia</td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>Kit de limpieza de columna de ARN</td></tr><tr><td>R</td><td>The R Foundation</td><td>v4.1.2</td><td>Software de análisis estadístico</td></tr><tr><td>Anticuerpo policlonal Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 Anticuerpo primario</td><td>Abcam</td><td>ab181701</td><td>Cx37 para inmunotinción</td></tr><tr><td>RevertAid RT kit de transcripción inversa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1691</td><td>kit de síntesis de ADNc</td></tr><tr><td>Rstudio</td><td>RStudio, PBC</td><td>v2021.09.2</td><td>Software de análisis estadístico</td></tr><tr><td>Solución de hidróxido de sodio (1N/Certificado)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td>Se utiliza para aumentar el pH del medio a 7,6-7,8</td></tr><tr><td>Piruvato de sodio (NaPyr)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>Componente de lavado de folículos medio</td></tr><tr><td>Placa de Petri cuadrada 100 mm x 15 mm&nbsp;</td>Las placas de Petri cuadriculadas <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>60872-310</td><td>permiten una identificación más eficiente de los folículos&nbsp;</td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>1725271</td><td>Mastermix para la reacción de PCR</td></tr><tr><td>Filtro de tapa de botella roscada Steritop</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>S2GPT02RE Se utiliza para esterilizar el medio de lavado de folículos</td></tr><tr><td>Tinción de gel de ADN segura para SYBR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td>Tinción para productos de PCR visual en gel de agarosa</td></tr><tr><td>TCM199 con Hank' s Sales</td><td>Gibco</td><td>12-350-039</td><td>Componente del medio de lavado de folículos</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td>Detergente para inmunotinción tampón de permeabilización</td></tr><tr><td>Reactivo de Trizol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>reactivo de aislamiento de ARN</td></tr><tr><td>Solución de azul de tripano, 0,4%</td><td>Gibco</td><td>15-250-061</td><td>Se utiliza para probar la viabilidad de folículos aislados</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td></td><td></td><td>Detergente para tampón de lavado inmunotinción</td></tr><tr><td>Placa calentadora Universal</td><td>WTA</td><td>20931</td><td>Placa caliente para mantener los folículos a 38,5 °C; C mientras se busca bajo el microscopio</td></tr><tr><td>Micropipetas calibradas Wiretrol II Drummond</td><td></td><td>50002-005</td><td>Micropipetas de vidrio para manipular folículos</td></tr></tbody></table>

aislamiento de pequeños folículos preantrales del ovario bovino mediante una combinación de fragmentación, homogeneización y filtración en serie

Isolation of Small Preantral Follicles from the Bovine Ovary Using a Combination of Fragmentation, Homogenization, and Serial Filtration

Comprender el proceso completo de la foliculogénesis de mamíferos es crucial para mejorar las tecnologías de reproducción asistida en ganado, humanos y especies en peligro de extinción. La investigación se ha limitado principalmente a los folículos preantrales y preantrales grandes debido a la dificultad en el aislamiento de folículos preantrales más pequeños, especialmente en mamíferos grandes como las especies bovinas. Este trabajo presenta un enfoque eficiente para recuperar un gran número de pequeños folículos preantrales de un solo ovario bovino. La corteza de los ovarios bovinos individuales se cortó en cubos de 500 μm usando un picador de tejido y se homogeneizó durante 6 minutos a 9,000-11,000 rpm usando una sonda de 10 mm. Los residuos grandes se separaron del homogeneizado con un paño de queso, seguido de una filtración en serie a través de filtros celulares de 300 μm y 40 μm. El contenido retenido en el colador de 40 μm se enjuagó en una placa de búsqueda, donde se identificaron los folículos y se recogieron en una gota de medio. La viabilidad de los folículos recolectados se probó mediante tinción de azul de tripano. Este método permite el aislamiento de un gran número de pequeños folículos preantrales viables de un solo ovario bovino en aproximadamente 90 minutos. Es importante destacar que este método es completamente mecánico y evita el uso de enzimas para disociar el tejido, lo que puede dañar los folículos. Los folículos obtenidos utilizando este protocolo se pueden utilizar para aplicaciones posteriores, como el aislamiento de ARN para RT-qPCR, la inmunolocalización de proteínas específicas y el cultivo in vitro .

Descripción general y pasos críticos Usando este protocolo, los folículos preantrales bovinos pequeños pueden aislarse de manera confiable de ovarios individuales en números experimentalmente relevantes. De un total de 30 réplicas, se obtuvo un promedio de 41 folículos por réplica, con un rango de 11 a 135 folículos (Figura 4A). En 14 réplicas, los folículos se caracterizaron para la etapa de desarrollo como se describió anteriormente26 midiendo el...

Avanzar en el estudio de la foliculogénesis preantral requiere métodos eficientes de aislamiento de folículos de ovarios individuales. Aquí se presenta un protocolo mecánico simplificado para el aislamiento de folículos de ovarios bovinos utilizando un cortador de tejido y homogeneizador. Este método permite la recolección de un gran número de folículos preantrales viables de un solo ovario.

Aislamiento de pequeños folículos preantrales del ovario bovino mediante una combinación de fragmentación, homogeneización y filtración en serie

Understanding the full process of mammalian folliculogenesis is crucial for improving assisted reproductive technologies in livestock, humans, and ...

Este protocolo permite el aislamiento eficiente y repetible de folículos preantrales en etapa temprana de un solo ovario bovino y crea nuevas oportunidades para el estudio de la foliculogénesis ovárica en una especie no bovina. Al utilizar un mayor número de folículos de un solo ovario, esta técnica permite tratamientos in vivo antes de la recolección de ovarios, u obtención de múltiples muestras a lo largo del tiempo del mismo animal mediante biopsia ovárica. El aislamiento y la criopreservación de los folículos preantrales en etapa temprana pueden ser una opción valiosa para la preservación de la fertilidad en mujeres jóvenes sometidas a tratamiento gonadotóxico como la quimioterapia, así como la preservación de germoplasma de especies en peligro de extinción.Demostrando el procedimiento estarán Stephanie McDonnell, Amanda Morton y Juliana Candelaria, estudiantes de doctorado de mi laboratorio. Para comenzar, transfiera los ovarios en el laboratorio a PBS cálidos y estériles que contengan Pen-Strep y seleccione ovarios con muchos folículos antrales pequeños y sin cuerpo lutecio prominente. Retire cualquier exceso de tejido conectivo y grasa de los ovarios con tijeras.Transfiera un ovario a la tabla de cortar en el papel de banco. Usando un bisturí, corte el ovario por la mitad longitudinalmente desde un sitio de unión del ligamento al sitio de unión opuesto. Mantenga una mitad del ovario en la tabla de cortar para ser procesada y coloque la otra mitad del ovario nuevamente en PBS caliente que contenga Pen-Strep.Para eliminar la médula, corte a lo largo de la curvatura del ovario aproximadamente a 2 milímetros de distancia de la superficie sin cortar a través de la corteza con la médula expuesta hacia arriba. Corte hacia abajo a través del corte para eliminar la mayor parte de la médula. Voltee el ovario hasta la mitad para que el epitelio mire hacia arriba y use el bisturí para terminar de cortar la médula lejos de la corteza y recorte cualquier tejido conectivo blanco restante alrededor del borde de la pieza del ovario que estaba conectada a los ligamentos.Una vez que se extirpa la mayor parte de la médula, use el bisturí para cortar la corteza a aproximadamente 1 milímetro de grosor mientras manipula el bisturí con pequeños movimientos de ida y vuelta para afeitar el resto de la médula, luego corte cada corteza ovárica por la mitad en dos pedazos. Mantenga las piezas de la corteza en PBS caliente que contiene Pen-Strep hasta que estén listas para cortar. Transfiera una sola pieza de la corteza a la placa de Petri en el picador de tejido y humedezca el tejido con tres o cuatro gotas de PBS caliente que contiene Pen-Strep.Mientras mantiene el pedazo de tejido firme con un par de pinzas, presione el botón Reset una vez para iniciar el cortador de pañuelos. Después de que toda la pieza de la corteza se haya cortado en tiras, use la perilla del soporte de la cuchilla para levantar la cuchilla de la placa de Petri y las pinzas para eliminar cualquier tejido de la cuchilla. Después de girar el soporte de la placa 90 grados, nuevamente, presione el botón Reset y pase la cuchilla completamente a través de las tiras de pañuelo.Use la perilla del soporte de la cuchilla para levantar la cuchilla de la placa de Petri y las pinzas para eliminar cualquier tejido de la cuchilla como se demostró anteriormente. Usando una pipeta de transferencia y PBS caliente que contenga Pen-Strep, lave el tejido picado en un tubo cónico de 50 mililitros precalentado. Regrese el tubo cónico al baño de agua o cuentas para mantener caliente el tejido picado mientras repite el procedimiento de corte con las otras tres mitades del ovario.Para obtener los mejores resultados de corte, use el controlador de tuercas para quitar la tuerca del brazo de corte y retire la arandela y el cierre de la cuchilla. Con pinzas, retire la cuchilla del brazo cortante. Voltérelo para que el borde no utilizado quede hacia la placa de Petri y colóquelo de nuevo en el brazo de cortar.Después de asegurarse de que la unidad homogeneizadora esté enchufada y la velocidad esté ajustada a la segunda barra, inserte la sonda del generador de 10 milímetros en la unidad de acuerdo con las especificaciones del fabricante. A continuación, configure un temporizador durante 1 minuto e inserte la sonda en el tubo cónico de 50 mililitros que contiene el tejido cortado de la corteza de un ovario y suficiente PBS que contiene Pen-Strep para llenar el tubo hasta la línea de 25 mililitros. La profundidad a la que se inserta la sonda debe ser 1/3 de la altura del líquido medida desde el fondo de la cámara.Una vez que se inicie el temporizador, encienda el homogeneizador, asegurándose de que la parte inferior de la sonda no toque el tubo y mantenga el tubo quieto mientras el homogeneizador está encendido. Después de 1 minuto de homogeneización, retire la sonda del tubo, luego retire cualquier tejido conectivo que obstruya los orificios de ventilación en el espacio entre la cuchilla del rotor y el tubo del rotor o las piezas de la corteza atrapadas en la sonda con pinzas y colóquelas nuevamente en el tubo. Verter el tejido disperso en el embudo cubierto de gasa, insertarlo en el erlenmeyer y enjuagar el contenido del tubo en el embudo con PBS tibio.Finalmente, enjuague la gasa con PBS caliente. Forzar el líquido en pequeños fragmentos para que pase a través de los agujeros de la tela girando la gasa alrededor de los fragmentos de tejido hacia abajo y apretando hasta que todo el exceso de líquido y tejido se elimine de la gasa. Después de volver a abrir la gasa sobre el embudo, enjuague la gasa con PBS que contenga Pen-Strep con una pipeta de transferencia y, nuevamente, exprima cualquier fragmento de tejido residual a través del paño.Con un hemostático, sostenga el filtro celular de 300 micrómetros sobre un vaso de precipitados de 200 mililitros y vierta el filtrado en el matraz Erlenmeyer a través del filtro celular. Si el colador de células se obstruye con tejido, golpee suavemente contra el vaso de precipitados, luego gire el colador boca abajo y golpee los restos de tejido grandes en el papel de banco. Enjuague el contenido del matraz con PBS tibio que contenga Pen-Strep hasta que no queden fragmentos de tejido y viértalo en el colador celular.A continuación, mientras sostiene el filtro celular de 40 micrómetros con un hemostático sobre un segundo vaso de precipitados de 200 mililitros, vierta todo el filtrado inicial presente en el primer vaso de precipitados de 200 mililitros a través del filtro, luego enjuague el contenido del vaso de precipitados con PBS caliente que contiene Pen-Strep hasta que no queden fragmentos de tejido y viértalo en el filtro celular. Después de colocar la aguja de calibre 18 en la jeringa de 20 mililitros, llene la jeringa con medio de lavado de folículos. Con un hemostático, sostenga el filtro de células de 40 micrómetros boca abajo sobre una placa de Petri cuadrada y use la jeringa para lavar el contenido del filtro celular en el plato.Transfiera la placa de Petri cuadrada a un estereoscopio con una etapa cálida establecida a 38.5 grados centígrados con un aumento establecido entre 1.25 y 3.2x. Después de identificar los folículos de la placa de Petri cuadrada, transfiera el folículo para lavar las gotas medianas con la micropipeta. El número total de folículos preantrales aislados por réplica utilizando homogeneización tisular de 6 minutos muestra un promedio de 41 folículos por réplica, que van de 11 a 135 folículos.La evaluación de la etapa de desarrollo de 476 folículos aislados mostró que la mayoría estaban en la etapa primaria de desarrollo, midiendo de 40 a 79 micrómetros en contener una capa de células de granulosa cuboidal. La homogeneización de la corteza ovárica durante 6 minutos produjo un mayor número de folículos preantrales en comparación con 5 minutos de homogeneización a la misma velocidad. La expresión de la transcripción del receptor FSH del marcador celular de la granulosa y del marcador de células germinales DAZL en los folículos se evaluó mediante PCR cuantitativa con transcripción inversa que demuestra que tanto los folículos primarios como los secundarios tempranos expresaron transcripciones del receptor de FSH y DAZL.La localización inmunofluorescente de CX37 en folículos preantrales aislados tanto en la etapa primaria como en la secundaria temprana muestra que CX37 se localizó en el plasma O, estando ausente del núcleo del sitio O y de la membrana de las células de la granulosa. En nuestra experiencia, la disección adecuada de una capa delgada de tejido cortical, cortar el tejido al tamaño correcto y la homogeneización adecuada son pasos críticos para garantizar la liberación de folículos viables del tejido. Los folículos preantrales aislados se pueden utilizar para responder a preguntas como la regulación del crecimiento del folículo preantral y la naturaleza de las interacciones entre las células de la granulosa y el ovocito, facilitando así el desarrollo de condiciones de cultivo más eficientes.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Un nuevo método para la encapsulación de los folículos ováricos en 3D de fibrina-alginato red interpenetrante se describe. Este sistema combina un soporte estructural a la degradación proteolítica de apoyar el desarrollo de folículos inmaduros para producir ovocitos maduros. Este método puede ser aplicado a los agregados de cultivo celular para mantener contactos célula-célula, sin limitar la expansión.

Un método para la encapsulación de los folículos ováricos y la Cultura en un proteolíticamente degradables tres dimensiones del sistema

Este video describe el aislamiento de ovocitos antrales de ovarios de ratón recién recolectados. Estos ovocitos antrales se pueden utilizar para estudios posteriores de caracterización y desarrollo.

Aislamiento de ovocitos antrales de ratón: un método para aislar ovocitos antrales de ovarios de ratón recién recolectados

Este video describe la técnica para aislar el complejo cúmulo-ovocito o COC de ovarios porcinos. El AOC intacto aislado se puede utilizar para llevar a cabo la fertilización in vitro, la técnica de reproducción asistida para desarrollar tratamientos de fertilidad.

Aislamiento del complejo de ovocitos de cúmulos porcinos: una técnica para aislar el complejo de ovocitos de cúmulos del folículo ovárico porcino para la fertilización in vitro

Aquí se presentan dos protocolos para la encapsulación de ovocitos porcinos en condiciones de cultivo 3D. En el primero, los complejos cúmulos-oocitos (COC) se encapsulan en perlas de fibrina-alginato. En el segundo, se encierran con partículas fluoradas de etileno propileno propileno (microbiorreos). Ambos sistemas garantizan condiciones óptimas para mantener su organización 3D.

Hidrogeles de Alginato degradados proteolíticamente y microbiorreactores hidrófobos para encapsulación de oocitos porcinos

Describimos los procedimientos para el aislamiento de ovocitos en crecimiento de los folículos ováricos en las primeras etapas de desarrollo, así como la instalación de un sistema de cultivo in vitro que puede apoyar el crecimiento y la diferenciación hasta la etapa completamente adulta.

Estrategia de cultivo In Vitro para ovocitos del folículo antral temprano en el ganado bovino

Aquí, presentamos un método simple para separar células foliculares y ocitos en folículos ováricos de pez cebra, lo que facilitará las investigaciones del desarrollo ovárico en peces cebra.

Separación de células foliculares y ocitos en folículos ováricos de pez cebra

Aquí, presentamos protocolos para la identificación y purificación de células ováricas de folículos antrales. Elaboramos métodos para procesar ovarios enteros para la criopreservación de tiras corticales mientras también cosechamos folículos antrales intactos que se tratan enzimáticamente para liberar múltiples tipos de células residentes del folículo, incluidas las células granulosa, teca, endotelial, hematopoyética y estromales.

Extracción, etiquetado y purificación de células específicas del linaje de folículos antrales humanos

Aquí, describimos un protocolo que describe cómo aislar los folículos ováricos humanos del tejido cortical congelado-descongelado para realizar análisis de expresión génica.

Análisis de expresión génica en folículos humanos

Aquí, describimos un protocolo para separar la yema, las células de la granulosa y las células de teca en folículos preovulatorios aviares. Este manejo de precisión permite investigaciones críticas sobre el papel de estas capas en la función reproductiva, lo que ayuda a comprender el desarrollo folicular, la regulación hormonal y la investigación de enfermedades para mejorar el rendimiento agrícola y los conocimientos biomédicos.

Separación de las capas de folículo granuloso preovulatorio aviar y células de teca para aplicaciones posteriores

Este protocolo describe un nuevo modelo de cultivo tridimensional (3-D) que utiliza un hidrogel de hialuronano unido a tiramina para encapsular y cultivar folículos preantrales del ovario de ratón. También detallamos dos enfoques para la criopreservación de folículos ováricos por vitrificación.

Aplicación de un nuevo hidrogel de hialuronano para el cultivo tridimensional de folículos y metodología para la criopreservación de folículos ováricos de ratón

Este artículo presenta un modelo de cocultivo de células de teca y granulosa bovina. Este método tiene el potencial de servir como una base confiable para análisis centrados en el estudio de la comunicación paracrina y el transporte de sustrato entre las células somáticas dentro del folículo.

Un sistema de cocultivo modificado para comprender las interacciones de las células de la granulosa y la teca en el ovario bovino

Aprenda a aislar folículos preantrales de ovario bovino mediante fragmentación, homogeneización y filtración en serie. Este protocolo mecánico eficiente mejora la viabilidad y permite estudios de foliculogénesis en diversas especies.

Aislamiento de pequeños folículos preantrales del ovario bovino mediante una combinación de fragmentación, homogeneización y filtración en serie (Video) | JoVE Journal

Aislamiento de pequeños folículos preantrales del ovario bovino mediante una combinación de fragmentación, homogeneización y filtración en serie

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