Name: Etiquetado de proximidad basado en AirID para la interacción proteína-proteína en plantas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Aprende el etiquetado de proximidad basado en AirID para estudiar interacciones proteína-proteína en plantas usando Cucumis sativus. Este método mejora la precisión y reduce la toxicidad en análisis bioquímicos.

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Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención Nº 32000197 a X.H.), la Subvención Financiera Especial de la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (Subvención Nº 2019T120467 a X.H.)

1. Preparación del material vegetal
<ol><li>Cucumis sativus (Pepino) se emplea para el análisis experimental. Poner las semillas en agua, incubar a 50 °C durante 20 min, y luego colocar las semillas en papel de filtro en una placa de Petri durante 12-16 h.</li>
	<li>Después, transfiera las semillas a macetas que contengan tierra (compradas comercialmente) y cultive en una cámara climática a 23 °C de temperatura y 16 h de fotoperiodo de luz y 8 h de oscuridad.</li>
	<li>Mantenga las plantas en la cámara climática durante 3-4 semanas hasta que las plantas alcancen las etapas de 3 o 4 hojas para una agroinfiltración exitosa.</li>
</ol>2. Hacer que AirID construya
<ol><li>Utilice APRR2 como proteína diana y construya APRR2-AirID bajo el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (p35S: APRR2-AirID). Introdúzcalo en el vector binario compatible con Gateway pEarleyGate1006 (proporcionado por la Dra. Kathrin Schrick, Universidad Estatal de Kansas) y sintetice la enzima PL directamente de acuerdo con la secuencia proporcionada en el Archivo Suplementario 1.</li>
</ol>3. Preparación de células competentes
<ol><li>Preparación de células competentes para DH5α<ol><li>Inocular los 2 mL de LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura y 10 g/L de NaCl; pH = 7,0.) con células de E.Coli DH5α (directamente del caldo congelado sin descongelar) y cultivar durante la noche (O/N) a 37 °C.</li>
		<li>Inocular recién el inóculo al 0,1%-0,5% del cultivo O/N en 100 mL de medio LB y cultivar las células hasta que OD600 alcance entre 0,4-0,6, y luego incubar el cultivo a 4 °C durante 30 min.</li>
		<li>Llevar el cultivo a dos tubos de centrífuga de 50 ml y centrifugar a 2500 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender las células en 10 mL de CaCl2 helado 0,1 M y colóquelo en hielo durante 15 min. Granular las células con un centrifugado de 2500 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Resuspender las células en 1 mL de CaCl2 + 20% de glicerol 0,1 M frío como hielo, alícuota 100 μL en cada tubo de 1,5 mL, y almacenarlas inmediatamente a -80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de células competentes GV3101<ol><li>Inocular 2 mL de LB (que contiene 50 μg/mL de gentamicina y 25 μg/mL de rifampicina) con una sola colonia GV3101. Incubar el cultivo O/N a 28 °C agitando a 250 rpm.</li>
		<li>Inocular 200 mL de LB con 1 mL de un cultivo saturado durante la noche. Agitar el cultivo a 250 rpm mientras se incuba a 28 °C hasta que el diámetro exterior600 sea igual a 0,5.</li>
		<li>Transfiera el cultivo a cuatro tubos de centrífuga estériles de 50 ml preenfriados y colóquelos en hielo durante 30 minutos.</li>
		<li>Granular las células a 2500 x g durante 10 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y coloque los gránulos en hielo.</li>
		<li>Resuspender las células en 10 mL de solución helada de CaCl2 0,1 M. Agrupe las celdas en un tubo Oakridge de 50 ml preenfriado.</li>
		<li>Gellet las células a 1.000 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 10 ml de solución helada de CaCl2 . Poner en hielo durante 30 min.</li>
		<li>Gellet las células a 1.000 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 2 ml de solución helada de CaCl2 0,1 M.</li>
		<li>Dispensar las células en una alícuota de 50 μL en tubos de polipropileno estériles preenfriados. Almacenar las celdas a -80 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Agroinfiltración
<ol><li>Primero, transfiera el plásmido a agrobacterium<ol><li>Transferir 2,5 μL del plásmido generado en el paso 2.1 a las células competentes de la cepa agrobacterium tumefaciens GV3101 e incubar en hielo durante 30 min.</li>
		<li>Transfiera el tubo que contiene el plásmido y las células competentes a nitrógeno líquido durante 3 min.</li>
		<li>Realice un choque térmico a 37 °C durante 5 minutos en una incubadora y, a continuación, coloque el tubo en hielo durante 2 minutos.</li>
		<li>Añadir 1.000 μL de medio LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura y 10 g/L de NaCl; pH = 7,0) a la agrobacteria e incubar a 30 °C y 118 rpm durante 1 h.</li>
		<li>Centrifugar a 3.000 x g durante 2 min a 4 °C.</li>
		<li>Deseche los 800 μL superiores de la solución y mezcle la solución restante. A continuación, aplíquelo en LB (como se menciona en el paso 4.1.4 añadido con agar y 50 μg/ml de kanamicina para el plásmido y 50 μg/ml de gentamicina y 25 μg/ml de rifampicina para las células competentes GV3010). Incubar las placas a 30 °C durante 48 h. NOTA: Es mejor elegir algunas colonias y realizar PCR para confirmar el gen de interés7.</li>
	</ol></li>
	<li>Recoja algunas colonias bacterianas de las placas y colóquelas en medios LB más los antibióticos apropiados (ver paso 4.1.6). Incubar a 30 °C y 218 rpm durante 36-48 h.</li>
	<li>Centrifugar las células a 3.000 x g durante 2 minat 4 °C. Resuspender las células a DO600 = 1,0 en tampón de agroinfiltración (10 mM MgCl2, 10 mM MES, pH = 5,6, 250 μM de acetosiringa).</li>
	<li>Infiltrar el inóculo (generado a partir del paso 4.3) en la epidermis (abaxial) con una jeringa sin aguja de 1 mL. NOTA: Es mejor infiltrarse en toda la hoja y optar por replicar. Para 4-5 plantas, use una construcción. Por cada hoja, 1,5 mL de agrobacterias resuspendidas es suficiente.</li>
	<li>Mantener las plantas durante 36 h en la cámara climática con una luz de 16 h (aproximadamente 75 μmol·m-2·s-1) y un fotoperiodo oscuro de 8 h a 23 °C.</li>
	<li>Después de 36 h de infiltración del constructo, infiltrar 1 mL de 5 μM de biotina (en solución de 10 mM de MgCl2 ) en las hojas ya filtradas del constructo.</li>
	<li>Mantenga las plantas tratadas durante 4-12 h adicionales antes de cosechar el tejido de las hojas. NOTA: De acuerdo con el estudio anterior, la proteína diana alcanza su punto máximo a las 36 h, por lo que se deben elegir infiltraciones de biotina de 36 hpi 4,6. La duración de la incubación de la biotina depende del estudio objetivo, pero según el experimento actual, un período de incubación de 8 h es más adecuado para marcar proteínas.</li>
</ol>5. Recogida de muestras
NOTA: Todos los materiales para la recolección de muestras deben ser estériles para evitar la contaminación por queratina, y todos los pasos del protocolo deben realizarse en un ambiente libre de contaminación.
<ol><li>Corta las hojas infiltradas y transfiérelas rápidamente a nitrógeno líquido para evitar la degradación de las proteínas.</li>
	<li>Realizar la predetección de proteínas a través de análisis de inmunotransferencia6; esto es muy recomendable antes de la coinmunoprecipitación (Co-IP).</li>
</ol>6. Extracción total de proteínas de la hoja
<ol><li>Muele las hojas con un mortero, agrega rápidamente 2 ml de 1x PBS-BSA PH 7.4 y muele lentamente.</li>
	<li>Tome un tubo cónico de 15 ml, coloque un filtro de material de filtración rápida en la parte superior del tubo cónico, transfiera la mezcla de muestra al tubo a través del filtro de material de filtración rápida y manténgalo en hielo.</li>
	<li>Transfiera las muestras a un tubo de 2 ml y agregue un cóctel inhibidor de proteínas al 1%.</li>
	<li>Mezclar el contenido girando hacia arriba y hacia abajo 7-8 veces y centrifugar a 1.000 x g durante 2 min a 4 °C.</li>
	<li>Transfiera el disolvente superior de las muestras a tubos nuevos de 2 ml, agregue 10% de β-D-maltósido (β-D.M) y colóquelo en hielo durante 5 min. Centrifugar a 20.000 x g durante 10 min a 4 °C.</li>
</ol>7. Equilibrar la columna de desalinización
<ol><li>Centrifugar la columna a 1.000 x g durante 1 min a 4 °C. NOTA: Marque un lado de la columna y asegúrese de que el lado marcado mire hacia afuera durante todos los procesos de centrifugación.</li>
	<li>Retire la cubierta superior e inferior de la columna y centrifugue a 1.000 x g durante 2 min a 4 °C.</li>
	<li>Deseche la solución líquida del tubo de recolección de la columna y agregue 5 ml de 1x tampón PBS para lavar.</li>
	<li>Centrifugar la columna a 1.000 x g durante 2 min a 4 °C.</li>
	<li>Repita los pasos 7.3 y 7.4 al menos cinco veces.</li>
</ol>8. Lavado de perlas magnéticas
<ol><li>Tome un tubo de 1,5 ml y agregue 50 μl de perlas magnéticas conjugadas con estreptavidina-C1.</li>
	<li>Agregue 1 ml de 1x PBS-BSA para lavar, mezcle bien y colóquelo en el soporte magnético durante 3 minutos. Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Repita el paso 8.2 al menos tres veces.</li>
	<li>Después de cada lavado, coloque el tubo en la rejilla magnética para adsorber las perlas hacia un lado del tubo para eliminar el tampón de lavado.</li>
</ol>9. Enriquecimiento de proteínas biotiniladas
<ol><li>Añadir 2 mL de las muestras a la columna y centrifugar a 1.000 x g durante 8 min a 4 °C.</li>
	<li>Añadir 1 ml del extracto proteico desalado a 50 μl de perlas magnéticas conjugadas con estreptavidina-C1 para equilibrarlas.</li>
	<li>Coloque el tubo en el rotador a velocidad normal para que la solución se mezcle completamente e incube a temperatura ambiente (RT) durante 30 minutos.</li>
	<li>Coloque las cuentas en la rejilla magnética durante 3 minutos en RT, o hasta que se junten en un lado del tubo, para eliminar suavemente el sobrenadante.</li>
	<li>Añadir 1 ml de tampón de lavado I (2% de SDS en agua), girar a RT durante 2 min en un rotador y repetir el paso 9.4.</li>
	<li>Coloque el tubo en el rotador a RT durante 2 min después de agregar 1 mL de tampón de lavado II (50 mM HEPES: pH = 7.5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% de ácido desoxicólico [p/v] y 1% de Triton X-100). Repita el paso 9.4.</li>
	<li>Añadir 1 mL de tampón de lavado III (10 mM de Tris-HCl: pH = 7,4, 250 mM de LiCl, 1 mM de EDTA, 0,1% de ácido desoxicólico [p/v], 1% de NP40 [v/v]), y girar con un agitador durante 2 min a RT. A continuación, repita el paso 9.4.</li>
	<li>Para eliminar el detergente, añadir 1,7 ml de 50 mM de Tris-HCl (pH = 7,5) y repetir el paso 9,4. Repita este paso una vez más.</li>
	<li>Lave las perlas seis veces durante 2 minutos cada una en 1 ml de tampón de bicarbonato de amonio de 50 mM a RT y repita el paso 9.4.</li>
	<li>Añadir 50 μL del extracto proteico que contiene 50 mM de Tris-HCl (pH 8,0), 12% (p/v) de sacarosa (Suc), 2% (p/v) de lauril sulfato de litio y 1,5% (p/v) de ditiotreitol a las perlas, choque térmico en la incubadora a 100 °C durante 5 min y seguir el paso 9.4. Almacenar el sobrenadante a -80 °C para el análisis LC-MS/MS.</li>
</ol>

<ol><li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+novel+protein-protein+interactions+in+liver+that+affect+glucagon+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">The identification of novel protein-protein interactions in liver that affect glucagon receptor activity.</a> PloS One. 10 (6), 0129226(2015).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+identification+of+host+proteins+interacting+with+Theileria+annulata+cysteine+proteinase+%28TaCP%29+by+yeast-two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Screening and identification of host proteins interacting with Theileria annulata cysteine proteinase (TaCP) by yeast-two-hybrid system.</a> Parasites & Vectors. 10 (1), 536(2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+agrobacterium-mediated+method+for+transient+gene+expression+and+functional+studies+in+multiple+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Communications%22%5BJournal%5D)">A highly efficient agrobacterium-mediated method for transient gene expression and functional studies in multiple plant species.</a> Plant Communications. 1 (5), 100028(2020).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TurboID-based+proximity+labeling+for+in+planta+identification+of+protein-protein+interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">TurboID-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks.</a> Journal of Visualized Experiments. (159), e60728(2020).</li>
<li>Kido, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AirID%2C+a+novel+proximity+biotinylation+enzyme%2C+for+analysis+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">AirID, a novel proximity biotinylation enzyme, for analysis of protein-protein interactions.</a> eLife. 9, 54983(2020).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpressing+7-hydroxymethyl+chlorophyll+a+reductase+alleviates+non-programmed+cell+death+during+dark-induced+senescence+in+intact+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Overexpressing 7-hydroxymethyl chlorophyll a reductase alleviates non-programmed cell death during dark-induced senescence in intact Arabidopsis plants.</a> Biomolecules. 11 (8), 1143(2021).</li>
<li>Ammiraju, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Oryza+bacterial+artificial+chromosome+library+resource%3A+construction+and+analysis+of+12+deep-coverage+large-insert+BAC+libraries+that+represent+the+10+genome+types+of+the+genus+Oryza%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The Oryza bacterial artificial chromosome library resource: construction and analysis of 12 deep-coverage large-insert BAC libraries that represent the 10 genome types of the genus Oryza.</a> Genome Research. 16 (1), 140-147 (2006).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Albino+Leaf+2+is+involved+in+the+splicing+of+chloroplast+group+I+and+II+introns+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Albino Leaf 2 is involved in the splicing of chloroplast group I and II introns in rice.</a> Journal of Experimental Botany. 67 (18), 5339-5347 (2016).</li>
<li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms+with+TurboID%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID.</a> Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).</li>
<li>Nakano, S., Niwa, M., Asano, Y., Ito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+the+evolutionary+track+of+a+highly+specific+l-Arginine+oxidase+by+reconstruction+and+biochemical+analysis+of+ancestral+and+native+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Following the evolutionary track of a highly specific l-Arginine oxidase by reconstruction and biochemical analysis of ancestral and native enzymes.</a> Applied and Environmental Microbiology. 85 (12), 00459(2019).</li>
<li>Gingras, A. -C., Abe, K. T., Raught, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+know+the+neighborhood%3A+using+proximity-dependent+biotinylation+to+characterize+protein+complexes+and+map+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).</li>
<li>Odeh, H. M., Coyaud, E., Raught, B., Matunis, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SUMO-specific+isopeptidase+SENP2+is+targeted+to+intracellular+membranes+via+a+predicted+N-terminal+amphipathic+%CE%B1-helix%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">The SUMO-specific isopeptidase SENP2 is targeted to intracellular membranes via a predicted N-terminal amphipathic α-helix.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (15), 1878-1890 (2018).</li>
<li>Motani, K., Kosako, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+stimulator+of+interferon+genes+%28STING%29+induces+ADAM17-mediated+shedding+of+the+immune+semaphorin+SEMA4D%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Activation of stimulator of interferon genes (STING) induces ADAM17-mediated shedding of the immune semaphorin SEMA4D.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7717-7726 (2018).</li>
</ol>

Los autores declararon no tener conflictos de intereses.

En el experimento actual, se utilizó AirID para el etiquetado de proximidad, que Kido et al. desarrollaron a través de un algoritmo de reconstrucción de enzimas ancestrales utilizando un gran conjunto de datos del genoma y cinco enzimas BirA convencionales5. Las mutaciones aleatorias se utilizaron en la ingeniería evolutiva tradicional de proteínas para mejorar la actividad 9,10, ya que las mutaciones aleatorias no pueden producir cambios ...

Varias proteínas celulares trabajan bajo el sistema biológicamente regulador, y las interacciones proteína-proteína (IBP) son parte de este sistema y la base de muchos procesos celulares. Además de los IBP, la función de las proteínas naturales se promueve postraduccionalmente a través de diversas modificaciones, como la formación de complejos, la ubiquitinación y la fosforilación. Por lo tanto, el estudio de los IBP es importante para comprender la posible función de las proteínas diana. Los IBP se han llevado a cabo utilizando diversas tecnologías, como el análisis por espectrometría de masas después de la inmunoprecipitación (análisis IP-MS)1, el sistema de dos híbridos de levadura (Y2H)2, también matrices basadas en célulaslibres 3. Estos métodos exploraron varios hallazgos vitales en el campo de la investigación. Sin embargo, estos métodos tienen algunos inconvenientes; por ejemplo, Y2H es una estrategia costosa y que requiere mucho tiempo y requiere la creación de la biblioteca Y2H de la especie objetivo.
Además, la técnica Y2H utiliza levadura, un organismo eucariota unicelular heterólogo, que no podía reflejar con precisión el estado celular de las células eucariotas superiores. El IP-MS no es adecuado para proteínas de alta hidrofobicidad y muestra una baja eficiencia en la captura de IBP débiles. Varias proteínas esenciales en las plantas, como el dominio de unión a nucleótidos y las proteínas que contienen repeticiones ricas en leucina (NLR) y las quinasas similares a receptores (RLK) se expresan a un nivel bajo y en su mayoría interactúan con otras proteínas de forma transitoria; Por lo tanto, el uso de estos métodos es insuficiente para comprender los mecanismos que subyacen a la regulación de estas proteínas3.
Una nueva técnica llamada biotinilación de proximidad (PB, por sus siglas en inglés) ayuda a los investigadores a identificar los IBP. El PB depende de las enzimas PL, que se unen a la proteína de interés (POI), y cuando la proteína asociada se acerca al POI, el PL adhiere una etiqueta química de biotina a la proteína asociada. Además, la proteína marcada se puede identificar y se puede saber rápidamente qué proteína asociada se une a la proteína objetivo5. Estudios previos demostraron que BioID y TurboID son herramientas exitosas para los IBP, especialmente en plantas, pero tienen ciertas limitaciones4. BioID necesita un alto nivel de biotina para etiquetar las proteínas asociadas, lo que lleva más de 16 h. En comparación con BioID, el TurboID es más beneficioso, ya que etiqueta la proteína en 10 minutos y puede etiquetar la proteína asociada a temperatura ambiente (RT). También es tóxico para las células en ciertas condiciones y marca aquellas proteínas que no muestran interacción con la proteína de interés.
Para superar estos problemas, AirID, desarrollado por Kido et al., es más eficiente que el resto de las enzimas de marcado, aunque la similitud de secuencia es del 82% entre BioID y AirID5. Para comprobar la eficiencia de AirID, realizamos un experimento utilizando un punto de interés con asociados conocidos. Este experimento confirmó que, sin duda, AirID podía etiquetar proteínas asociadas en células vegetales. AirID es una enzima valiosa para analizar los IBP in vitro y en células. Crea menos toxicidad y es menos erróneo en los procesos de tiempo que TurboID para etiquetar a los no socios, lo que lleva a la muerte de la célula. Demuestra que AirID es más competitivo que otras enzimas de marcaje para la biotinilación de proximidad. Es más preciso, tiene más potencial en procesos que requieren tiempo y es menos tóxico in vitro y en células vivas. El protocolo actual describe la identificación de proteínas interactuantes de APRR2 utilizando AirID como enzima PL; además, el método se puede aplicar a otras proteínas para investigar los IBP en especies vegetales.

<table><tbody><tr><td>Acetossiringa</td><td>Beijing solaribo ciencia y tecnología Co.Ltd</td><td>S1519</td><td></td></tr><tr><td>Solución acrílica/Bis al 30%</td><td>Sangon Biotech (Shanghái) Co.Ltd</td><td>1510KA4528</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BioFroxx GmbH</td><td>D64683</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>tsingke (Shanghái) Co.Ltd</td><td>TSJ001</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amonio</td><td>Sangon Biotech (Shanghái) Co.Ltd</td><td></td><td></td>G313BA0018</tr><tr><td>Biotina</td><td>BBI Ciencias de la vida</td><td>G908BA0012</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>BBI Ciencias de la vida</td><td></td> E209BA0008 <td></td></tr><tr><td>Células competentes GV3101</td><td>Hecho en el experimento</td><td></td><td></td>actual</tr><tr><td>Columna de desalinización</td><td>Thermo scientific WC321753</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido desoxicólico</td><td>Sangon Biotech (Shanghái) Co.Ltd</td><td></td><td></td>G818BA0029</tr><tr><td>DH5 y alfa; células competentes</td><td>Hecho en el experimento</td><td></td> actual <td>E.coli DH5 y alfa;</td></tr><tr><td>&beta;-D-maltoside</td><td>Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd</td><td>S818</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd</td><td>E104BA0029</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd</td><td>161BA0031</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Beijing solaribo ciencia y tecnología</td><td>Co.Ltd H8090</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd</td><td>H209BA0003</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Beijing solaribo ciencia y tecnología Co.Ltd</td><td>M8019</td><td></td></tr><tr><td>MiraCloth</td><td>EMD Milipore Corp/MERCK kgAa Darmstadt, Germenay</td><td>3429963</td><td>Filtro de material de filtración rápida</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Beijing solaribo ciencia y tecnología Co.Ltd</td><td>20200819</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd</td><td>H324BA0003</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>Sangon Biotech (Shanghái) Co.Ltd</td><td>N8030</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel inhibidor de proteínas</td><td>Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd</td><td>S3450</td><td></td></tr><tr><td>PVDF</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr> 5820172 <tr><td>SDS Beijing</td><td>Scolario Science and Tech Co.Ltd</td><td>S1015</td><td></td></tr><tr><td>Silwet</td><td>Sangon Biotech (Shanghái) Co.Ltd</td><td>S9430</td><td></td></tr><tr><td>Perlas magnéticas conjugadas con estreptavidina-C1</td><td>Biotecnología enriquecedora</td><td>7E511E1</td><td>Perlas magnéticas</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Servicebio</td><td>G2056</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon Biotech (Shanghái)</td><td>Co.Ltd GB03BA007</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sangon Biotech (Shanghái) Co.Ltd</td><td>F828BA0020</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Termo científico</td><td>LP0042</td><td></td></tr></tbody></table>

etiquetado de proximidad basado en airid para la interacción proteína-proteína en plantas

AirID-Based Proximity Labeling for Protein-Protein Interaction in Plants

En células y plantas de mamíferos, los enfoques de marcaje de proximidad (PL) que utilizan ascorbato peroxidasa modificada (APEX) o la biotina ligasa BirA de Escherichia coli (conocida como BioID) han demostrado ser exitosos en la identificación de interacciones proteína-proteína (IBP). APEX, BioID y TurboID, una versión revisada de BioID, tienen algunas restricciones además de ser tecnologías valiosas. El recientemente desarrollado AirID, una versión novedosa de BioID para la identificación de proximidad en interacciones proteína-proteína, superó estas restricciones. Anteriormente, AirID se ha utilizado en modelos animales, mientras que el estudio actual demuestra el uso de AirID en plantas, y los resultados confirmaron que AirID funciona mejor en sistemas vegetales en comparación con otras enzimas PL como BioID y TurboID para el etiquetado de proteínas que son proximales a las proteínas objetivo. A continuación, se muestra un protocolo paso a paso para identificar a los socios de interacción de proteínas utilizando la proteína AT4G18020 (APRR2) como modelo. Los métodos describen la construcción del vector, la transformación del constructo a través de la agroinfiltración, la transformación de la biotina, la extracción de proteínas y el enriquecimiento de proteínas marcadas con biotina a través de la técnica de purificación por afinidad. Los resultados concluyen que AirID es una enzima novedosa e ideal para analizar los IBP en plantas. El método se puede aplicar para estudiar otras proteínas en plantas.

Según investigaciones previas, el gen del pepino APRR2 es el gen candidato que controla el color blanco de la fruta inmadura8. Aquí, se desarrolló un protocolo utilizando AirID como enzima de marcaje de proximidad para encontrar la proteína asociada que interactúa con APRR2 en el pepino. El constructo se transfirió a las hojas de pepino y, después de 36 h después de la infiltración, se transfirió biotina. Después de 48 h se tomaron las muestras para el análisis de Western blot pa...

Aquí, presentamos un protocolo paso a paso para realizar el experimento de marcaje de proximidad (PL) en pepino (Cucumis sativus L.) utilizando la proteína AT4G18020 (APRR2)-AirID como modelo. El método describe la construcción de un vector, la transformación de un constructo a través de la agroinfiltración, la infiltración de biotina, la extracción de proteínas y la purificación de proteínas marcadas con biotina a través de la técnica de purificación por afinidad.

Etiquetado de proximidad basado en AirID para la interacción proteína-proteína en plantas

In mammalian cells and plants, proximity labeling (PL) approaches using modified ascorbate peroxidase (APEX) or the Escherichia coli biotin ligase BirA ...

AirID es una enzima valiosa para la interacción proteína-proteína, y crea menos toxicidad y menos errores en los procesos de tiempo que tardan en llegar que otras enzimas de marcaje de proximidad. Se presenta un protocolo paso a paso para realizar el experimento de marcaje de proximidad en pepino o Cucumis sativus utilizando AT4G18020 proteína APRR2-AirID como modelo. Ahmad Zada, Imran Khan, Yuting Cheng y Min Zhang, de mi laboratorio, harán una demostración del procedimiento.Comience transfiriendo las semillas de Cucumis sativus o pepino en agua, incubándolas a 50 grados centígrados durante 20 minutos y luego colocando las semillas en el papel de filtro en una placa de Petri durante 12 a 16 horas. Posteriormente, transfiera las semillas a macetas que contengan tierra y cultívelas en una cámara climática a 23 grados centígrados en un período de fotos de 16 horas de luz y 18 horas de oscuridad durante tres o cuatro semanas. Transferir 2,5 microlitros del plásmido EarleyGate 100 a las células competentes de la cepa agrobacterium tumefaciens GV3101.Incube el tubo en hielo durante 30 minutos antes de transferirlo a nitrógeno líquido durante tres minutos. Para dar el choque de calor, transfiera el tubo a la incubadora a 37 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, coloque el tubo en hielo durante dos minutos.Añadir 1.000 microlitros de Luria Bertani o medio LB a las células de agrobacterias sometidas al choque térmico. Después de incubar las células a 30 grados centígrados y 118 RPM durante una hora, centrifugarlas a 3000 G durante dos minutos a cuatro grados centígrados. Luego deseche el sobrenadante de 800 microlitros y mezcle la solución restante.Aplíquelo en el medio LB suplementado con 50 microgramos por mililitro de kanamicina y gentamicina cada uno y 25 microgramos por mililitro de rifampicina. Incubar las placas a 30 grados centígrados durante 48 horas. Recoge algunas colonias bacterianas de los platos.Colóquelos en medios líquidos LB, suplementados con antibióticos apropiados e incube LB líquido a 30 grados Celsius y 218 RPM durante 36 a 48 horas. Después de dos minutos de centrifugación a 3.000 G a cuatro grados centígrados, vuelva a suspender el gránulo en un tampón de agroinfiltración para ajustar la densidad óptica a uno en la longitud de onda de 600 nanómetros. Utilizando una jeringa sin aguja de un mililitro, infiltrar toda la epidermis de la superficie abaxial con 1,5 mililitros del inóculo agrobacteriano resuspendido.Mantenga las plantas en la cámara climática a 23 grados centígrados con 75 micromoles por metro cuadrado por segundo de luz durante 16 horas en condiciones de oscuridad durante ocho horas Después de 36 horas, infiltre un mililitro de cinco microgramos de biotina en las hojas ya filtradas. Después de cuatro a 12 horas de infiltración de biotina, corte las hojas y transfiéralas rápidamente a nitrógeno líquido para evitar la degradación de las proteínas. Muele las hojas con un mortero y agrega rápidamente dos mililitros de PBS BSA de pH 7.4, seguido de una molienda lenta.Transfiera la mezcla de muestra a un tubo cónico de 15 mililitros a través de un filtro de material de filtración rápida colocado encima y mantenga el tubo en hielo. Transfiera las muestras a un tubo de dos mililitros. Agregue un cóctel de inhibidor de proteínas al 1% y mezcle el contenido girando el tubo hacia arriba y hacia abajo de siete a ocho veces antes de centrifugarlo.Una vez hecho esto, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de dos mililitros y agregue un 10% de beta-D-maltósido. Coloque el tubo en hielo durante cinco minutos antes de centrifugar a 20.000 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Para equilibrar la columna de desalinización, marque un lado de la columna y centrifugue con el lado marcado hacia afuera.Retire la cubierta superior e inferior de la columna y vuelva a centrifugar a 1.000 G durante dos minutos a cuatro grados centígrados. Deseche la solución líquida del tubo de recolección de la columna y lave el tubo con cinco mililitros de tampón PBS con centrifugación como se demostró anteriormente, al menos cinco veces. Agregue un mililitro de PBS BSA a 50 microlitros de perlas magnéticas conjugadas con estreptavidina-C1 en un tubo de 1,5 mililitros y mézclelo bien.Coloque el tubo en un soporte magnético durante tres minutos para absorber las perlas hacia un lado del tubo. Deseche el sobrenadante del otro lado y repita este lavado PBS BSA tres veces. Para enriquecer la proteína biotinilada, añadir dos mililitros de las muestras a la columna.Después de la centrifugación de la columna a 1000 G durante ocho minutos a cuatro grados centígrados, agregue un mililitro de extracto de proteína desalinizada a 50 microlitros de perlas magnéticas conjugadas con estreptavidina-C1. Mezcle bien la solución colocando el tubo que contiene las perlas magnéticas en el rotador a velocidad normal y a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, coloque las cuentas en la rejilla magnética durante tres minutos a temperatura ambiente o hasta que se junten en un lado del tubo.Retire suavemente el sobrenadante y agregue un mililitro de tampón de lavado. Gire el tubo durante dos minutos sobre un rotador y repita el paso realizado en la rejilla magnética para eliminar el sobrenadante. Del mismo modo, realice los lavados con un mililitro de tampones de lavado dos y tres como se demostró anteriormente.A continuación, retire el detergente de los tampones de lavado añadiendo 1,7 mililitros de clorhidrato tris de 50 milimolares y repitiendo el paso realizado en la rejilla magnética. Dar seis lavados de dos minutos cada uno con un mililitro de tampón de bicarbonato amónico de 50 milimolares. Una vez hecho esto, agregue 50 microlitros del extracto de proteína que contiene 50 milimolares de clorhidrato de tris, 12% de sacarosa, 2% de lauril sulfato de litio y 1,5% de ditiotreitol a las perlas, y coloque el tubo en la incubadora a 100 grados centígrados durante cinco minutos para dar un choque térmico.Después de repetir el paso en una rejilla magnética, almacene el sobrenadante a menos 80 grados Celsius para el análisis LCMS/MS. El análisis de Western blot de las proteínas extraídas mostró una expresión proteica y biotinilación exitosas en las hojas de pepino infiltradas. El mayor nivel de expresión de las proteínas marcadas y las bandas adicionales en comparación con el control confirmaron el marcado exitoso de las proteínas diana del gen de interés por AirID.Los resultados se confirmaron mediante anticuerpos Anti-Flag y Anti-Mass mostrando la banda diana con un anticuerpo Anti-Flag en todas las muestras transformadas. Después de enriquecer proteínas biotiniladas con perlas magnéticas conjugadas con estreptavidina-C1, se observaron múltiples proteínas de diferentes tamaños. De todos los resultados, se concluyó que AirID es una enzima novedosa e ideal para analizar las interacciones proteína-proteína en plantas.Durante el experimento de marcaje de proximidad, es importante recordar que la biotina de cinco micromolares y la duración de la FC son ideales. El protocolo describe la configuración paso a paso del etiquetado de proximidad basado en AirID en la planta, incluida la preparación de la muestra de hojas, la eliminación de la prebiotina, la cuantificación de la proteína del extracto y el enriquecimiento de las proteínas biotiniladas. Se proyecta que AirID mejore la precisión de la biotinilación independiente de PPI en combinación.Se concluye que AirID es ideal para el análisis de PPI en plantas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Hemos desarrollado una técnica para probar interacciones proteína-proteína en las plantas. Una proteína amarilla fluorescente (YFP) se divide en dos fragmentos que no se superponen. Cada fragmento se clona en el marco de un gen de interés a través del sistema de puerta de enlace, lo que permite la expresión de proteínas de fusión. La reconstitución de la señal de YFP sólo ocurre cuando las proteínas interactúan investigación.

Detección de interacciones de proteínas en la planta mediante un Gateway Compatible Complementación fluorescencia bimoleculares (BiFC) del sistema

Se presenta una variación de la RÁPIDA (inmunoprecipitación cuantitativa Combinado con Knockdown) enfoque que se introdujo anteriormente para distinguir entre verdadera y falsa interacciones proteína-proteína. Nuestro enfoque se basa...

El Protocolo para la identificación de las interacciones proteína-proteína base de<sup&gt; 15</sup&gt; N metabólico Etiquetado, inmunoprecipitación, cuantitativa Espectrometría de Masas y Modulación Affinity

Este video describe el ensayo de ligadura de proximidad para estudiar in situ las interacciones proteína-proteína en células de nematodos. La proximidad de las proteínas de interés genera la plantilla circular de ADN con la ayuda de una sonda de PLA unida a un anticuerpo secundario. La sonda se amplifica aún más utilizando la solución de amplificación, que produce un ADN monocatenario largo seguido de la hibridación de la sonda detectora, lo que permite la localización de las interacciones...

Ensayo de ligadura de proximidad para estudiar in situ las interacciones proteína-proteína

Formación de complejos de proteínas in vivo puede ser visualizado por complementación de fluorescencia bimolecular. Parejas de interacción se fusionan a partes complementarias de etiquetas fluorescentes y expresados ​​transitoriamente en hojas de tabaco, lo que resulta en una señal fluorescente reconstituido en una estrecha proximidad de las dos proteínas.

Interacciones proteína-proteína se visualizó por fluorescencia Bimolecular Complementación en protoplastos de tabaco y hojas

Inmunoprecipitación de la cromatina es una técnica poderosa para la identificación de ADN sitios de las proteínas de Arabidopsis unión in vivo. Este procedimiento incluye la cromatina entrecruzamiento y la fragmentación, inmunoprecipitación con anticuerpos selectivos contra la proteína de interés, y el análisis qPCR de ADN unido. Se describe un chip de ensayo sencilla optimizada para plantas de Arabidopsis.

Ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina para la Identificación de Arabidopsis proteína-DNA<em&gt; En Vivo</em

Aquí, presentamos un protocolo de captura interactome aplicado a Arabidopsis thaliana protoplastos hoja mesófilo. Este método depende crıticamente de la reticulación UV in vivo y permite el aislamiento e identificación de proteınas de unión a mRNA de plantas desde un entorno fisiológico.

ARNm Interactome Captura de Planta Protoplastos

Este manuscrito describe un procedimiento experimental fácil y rápido para la determinación de las interacciones proteína-proteína basadas en la medición de la actividad de luciferasa.

Complementación de luciferase imagen ensayo en hojas de Nicotiana benthamiana para determinar transitoriamente proteínas interacción dinámica

Proporcionamos un protocolo paso a paso para split-BioID, un ensayo de complementación de fragmentos de proteína basado en la técnica de etiquetado de proximidad BioID. Activa en la interacción de dos proteínas determinadas, permite el análisis de Proteómica de los complejos de la proteína dependiente de contexto en su entorno celular nativo. El método es simple, rentable y sólo requiere equipo normal de laboratorio.

Split-BioID: Análisis proteómico de complejos de proteínas específicos de contexto en su entorno celular nativo

Las interacciones proteína-proteína y proteína-metabolito son cruciales para todas las funciones celulares. Adjunto, describimos un protocolo que permite el análisis paralelo de estas interacciones con una proteína de elección. Nuestro protocolo fue optimizado para cultivos de células vegetales y combina la purificación de la afinidad con la proteína basada en espectrometría de masa y detección de metabolitos.

2 en 1: purificación de la afinidad para el análisis paralelo de proteínas y complejos de proteína-metabolito de un solo paso

Aquí se describe un método de etiquetado de proximidad para la identificación de socios de interacción del dominio TIR del receptor inmune NLR en el tejido de hoja de Nicotiana benthamiana. También se proporciona un protocolo detallado para la identificación de interacciones entre otras proteínas de interés utilizando esta técnica en Nicotiana y otras especies vegetales.

Etiquetado de proximidad basado en TurboID para la identificación en planta de redes de interacción proteína-proteína

En este estudio, establecemos un protocolo detallado para el marcaje de proximidad (PL) basado en TurboID en el ovario de D. melanogaster , que abarca desde la suplementación con biotina y la disección ovárica hasta la validación de la expresión transgénica y el enriquecimiento de péptidos biotinilados para la espectrometría de masas.

In vivo Aplicación del etiquetado de proximidad basado en TurboID en Drosophila melanogaster

Aprende el etiquetado de proximidad basado en AirID para estudiar interacciones proteína-proteína en plantas usando Cucumis sativus. Este método mejora la precisión y reduce la toxicidad en análisis bioquímicos.

Etiquetado de proximidad basado en AirID para la interacción proteína-proteína en plantas

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