Esterilización por radiación gamma de baja dosis para injertos traqueales descelularizados

Este protocolo proporciona un proceso completo de esterilización para cualquier órgano no estéril sin afectar sus características. El objetivo principal de esta técnica incluye la posibilidad de esterilizar un órgano sin afectar sus propiedades. Aunque esta técnica se ha centrado en las tráqueas, ha demostrado que las dosis más bajas de radiación gamma pueden esterilizar eficazmente los materiales biológicos.

Un individuo puede enfrentar el problema definiendo la dosis efectiva más baja para los diferentes tipos de órganos. Luego, se recomienda comenzar con una dosis más baja y aumentarlas hasta que se logre la esterilización. Comience seccionando la tráquea diseccionada de conejos blancos de Nueva Zelanda sacrificados, u Oryctolagus cuniculus, en pedazos de dos centímetros.

Con unas tijeras, retire el tejido conectivo circundante y la capa mucosa interna. Sumerja las muestras en 12 mililitros de solución de PBS que contenga SDS, estreptomicina al 5% de penicilina y 5% de anfotericina. Someter las tráqueas a agitación constante con un agitador magnético a 400 RPM durante cinco semanas a temperatura ambiente.

Semanalmente, dé dos horas de choque osmótico sumergiendo las tráqueas en agua destilada antes de cambiar el medio. Después de cinco semanas, criogenice las muestras de tráquea usando una mezcla de 12 mililitros de 80% FBS y 20% DMSO en un recipiente de congelación a menos 80 grados centígrados. Después de 13 a 15 días, descongele las tráqueas en un baño de agua a 37 grados centígrados.

Luego, lávelos con PBS. Para irradiar la muestra, coloque cuatro piezas traqueales en 20 mililitros de PBS en matraces de cultivo de metacrilato T25, evitando la formación de burbujas. Conducir la irradiación utilizando un acelerador lineal con fotones de una energía nominal de 10 megavoltios aplanando haces sin filtro.

Aplicar una tasa de dosis de 2.400 unidades de monitor por minuto y establecer otros parámetros como se describe en el manuscrito. Una vez hecho esto, cultive la muestra en 30 mililitros de DMEM suplementado con FBS inactivado al 10% sin antibióticos ni antifúngicos. Incubar el cultivo en una incubadora de tejidos estándar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante dos semanas e inspeccionarlo cada 24 horas para detectar parámetros de contaminación como cambios de pH medio, color y turbidez.

Realice pruebas de tracción en una máquina de prueba universal de escritorio de tracción, o control de desplazamiento UTM, equipada con sensores de fuerza y posición y una computadora con software diseñado específicamente. Graba datos cada 0,4 segundos y expórtalos a una hoja de cálculo. Construir mordazas de tracción adaptadas al calibre medio de las tráqueas de conejo a partir de cloruro de polivinilo cristalino monocapa no tóxico puro, o tubos huecos de PVC.

Divida las conductas en segmentos de tres centímetros de largo. Para realizar la sutura termino-terminal sin sesgo, perfore 12 orificios preformados a dos milímetros del borde de las mandíbulas, separados por 2,5 milímetros. A continuación, conecte los tubos de vidrio de PVC a la tráquea de conejo mediante anastomosis termino-terminal con una sutura continua de monofilamento de nylon 6-0 a través de orificios de cinco milímetros realizados alternativamente presentes a dos milímetros del borde de la tráquea.

Estira todas las piezas a una velocidad de desplazamiento de 5,0 milímetros por minuto. Luego, registre las variables, como la tensión máxima y la tensión, la energía almacenada por unidad de volumen de tráquea y el módulo de Young. Realice pruebas de compresión radial en un UTM de escritorio de compresión equipado con una célula de carga de 15 newtons para obtener datos de fuerza, posición y tiempo.

Grabe datos y expórtelos a hojas de cálculo a intervalos de 0,5 segundos. Coloque las tráqueas con el área membranosa apoyada en la placa inferior antes del ascenso gradual de la placa hacia la placa superior a una velocidad constante de cinco milímetros por minuto. Calcule cada variable por unidad de longitud de la muestra, rigidez y energía por unidad de área de superficie necesaria para ocluir completamente la tráquea.

Coloque un stent de PVC intraluminal estéril de tamaño 14, asegurando un margen de tres a cuatro milímetros en cada extremo. Fije el stent con una sola puntada de monofilamento de nylon 6-0 a través del espacio intercartilaginoso del primer cartílago. En condiciones asépticas y con material estéril, realizar una incisión torácica central longitudinal de tres centímetros y cosechar colgajos pediculados bilaterales compuestos por fascia pectoral y un componente muscular.

Envuelva las tráqueas con el colgajo en cuatro conejos, una tráquea en cada hematórax. Una vez completada la cirugía, revertir la anestesia interrumpiendo la administración de isoflurano. De las ocho piezas que fueron expuestas a 0,5 kilogray de radiación, dos piezas exhibieron un cambio en el color de los medios en una semana.

Sin embargo, ninguna de las piezas que fueron irradiadas a uno o dos kilogrises mostró ningún cambio en el color del medio. En comparación con el control, no se detectaron cambios en el patrón de distribución de colágeno o fibra elástica en las muestras analizadas irradiadas a diferentes dosis de radiación. Los datos obtenidos en la prueba de tracción en tráqueas irradiadas se muestran aquí.

Las curvas de deformación por tensión para las tráqueas descelularizadas e irradiadas no revelaron cambios en comparación con las tráqueas no esterilizadas. Se muestran las pruebas de compresión realizadas en las tráqueas o controles nativos y las tráqueas descelularizadas, criopreservadas e irradiadas. Los gráficos correspondientes mostraron que la irradiación no cambió el porcentaje de oclusión en comparación con la tráquea nativa.

La irradiación gamma causó una disminución clínicamente mínima pero estadísticamente significativa en las características radiobiomecánicas y la fuerza variable por unidad de longitud. El examen histológico mostró el tejido conectivo altamente organizado en forma de pericondrio de la tráquea nativa. El cartílago estaba intacto y no mostraba signos de necrosis.

Al implantar elemento radiológico en un ser vivo, la esterilidad del implante y el proceso estéril son primordiales para evitar infecciones y rechazo tisular. Hay una amplia gama de órganos que se implantan después de la generación de tejido, y deben ser estériles. Siguiendo este proceso se puede lograr una esterilización completa sin afectar las características principales del órgano.