Name: Establecimiento de organoides endometriales 3D a partir del útero del ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Aprende a aislar epitelio uterino puro de ratón mediante disociación enzimática y mecánica para establecer organoides endometriales 3D. Este método permite estudiar la señalización endometrial y su renovación.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a la Dra. Stephanie Pangas y al Dr. Martin M. Matzuk (M.M.M.) por la lectura crítica y edición de nuestro manuscrito. Los estudios fueron apoyados por las subvenciones del Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano Eunice Kennedy Shriver R00-HD096057 (D.M.), R01-HD105800 (D.M.), R01-HD032067 (M.M.M.) y R01-HD110038 (M.M.M.), y por la Subvención de Apoyo al Centro Oncológico NCI-P30 (NCI-CA125123). Diana Monsivais, Ph.D. tiene un Premio al Embarazo de la Próxima Generación del Burroughs Wellcome Fund.

El manejo de ratones y los estudios experimentales se realizaron bajo protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Baylor College of Medicine y las pautas establecidas por la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
1. Aislamiento del epitelio uterino de ratones utilizando métodos enzimáticos y mecánicos
NOTA: Esta sección describe los pasos necesarios para establecer, pasar, congelar y descongelar organoides endometriales epiteliales de ratones utilizando un andamio de matriz de gel. Estudios previos han determinado que los cultivos óptimos de organoides endometriales de ratón se establecen a partir de ratones durante la fase4 del estro, que puede determinarse mediante el examen citológico de un hisopo vaginal15. Se utilizaron ratones WT hembra adultos (6-8 semanas de edad, híbridos C57BL / 6J y 129S5 / SvEvBrd) para todos los experimentos. Los ratones fueron sacrificados humanamente de acuerdo con las pautas aprobadas por IACUC utilizando sedación con isoflurano seguida de desarticulación cervical. Una vez que los ratones son sacrificados, se deben seguir los siguientes pasos. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con los materiales y soluciones utilizados en este protocolo.
<ol><li>Deje que la matriz de gel se descongele en hielo durante aproximadamente 1-2 h antes de usar.</li>
	<li>Para diseccionar el ratón, use tijeras para hacer una incisión en la línea media en el abdomen y retire suavemente la piel para exponer la capa peritoneal subyacente. Use fórceps para sostener la capa peritoneal y haga incisiones laterales con las tijeras para exponer el contenido abdominal.<ol><li>Localice los cuernos uterinos moviendo suavemente las almohadillas de grasa abdominal a un lado. Diseccionarlos sosteniéndolos primero en la unión cervical y usando tijeras para cortar a lo largo de la grasa mesentérica. Después de la disección del útero del ratón, retire completamente el tejido graso del cuerno uterino con tijeras pequeñas. NOTA: Mantenga la esterilidad durante el aislamiento celular esterilizando todas las herramientas quirúrgicas antes de usarlas, rocíe el abdomen del ratón con etanol al 70% y realice todos los pasos posteriores a la disección bajo una campana de cultivo de tejido estéril.</li>
	</ol></li>
	<li>Corte cada cuerno uterino en pequeños fragmentos, cada uno midiendo aproximadamente 4-5 mm.</li>
	<li>Coloque todos los fragmentos uterinos de un útero en un pocillo de una placa de 24 pocillos que contenga 0,5 ml de tripsina al 1%. Permita que la solución enzimática entre en la luz uterina, causando la separación enzimática del epitelio endometrial del estroma subyacente.</li>
	<li>Incubar la placa de 24 pocillos en una incubadora de cultivo de tejidos humidificado a 37 °C durante aproximadamente 1 h.</li>
	<li>Después de la incubación de 1 h, transfiera los fragmentos uterinos a una placa de cultivo tisular de 35 mm que contenga 1 ml de solución tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco.</li>
	<li>Bajo un microscopio de disección, use fórceps finos y una pipeta de 1 ml para separar mecánicamente el epitelio uterino de la trompa uterina. Mientras mantiene presionado un extremo de un fragmento uterino con los fórceps, pase suavemente la punta de la pipeta longitudinalmente a través del fragmento, apretando el epitelio por el otro extremo de la trompa uterina. Observe las hojas epiteliales separadas del fragmento uterino bajo el microscopio de disección.</li>
	<li>Utilice la pipeta de 1 ml para recoger y transferir suavemente las láminas epiteliales a un tubo de 1,5 ml.</li>
	<li>Repita el proceso para los fragmentos uterinos restantes, transfiriendo todas las láminas epiteliales al mismo tubo de recolección.</li>
	<li>Granular las láminas epiteliales disociadas por centrifugación durante 5 min a 375 × g.</li>
	<li>Retire con cuidado el sobrenadante para evitar alterar el pellet celular.</li>
	<li>Resuspender el pellet celular en 0,5 mL de 2,5 mg/mL de colagenasa + 2 mg/ml de solución de DNasa. Pipetear hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 10 veces, o hasta que se logre una suspensión de una sola celda.</li>
	<li>Agregue 0.5 ml de DMEM / F12 + 10% de suero bovino fetal (FBS) + antibióticos, y centrifugar las células durante 5 minutos a 375 × g. NOTA: Para obtener información adicional sobre el antibiótico de amplio espectro utilizado para el cultivo celular, consulte la Tabla de materiales.</li>
	<li>Retire cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda las células en 1 ml de DMEM / F12 + 10% FBS + antibióticos. Centrifugar las celdas durante 5 min a 375 × g.</li>
</ol>2. Procesamiento del compartimento estromal
NOTA: Esta sección describe los protocolos necesarios para aislar el compartimiento estromal del endometrio del ratón. Dado el creciente interés en los experimentos de cocultivo epitelial/estromal, es importante poder procesar las poblaciones de células estromales además de las células epiteliales que generarán organoides.
<ol><li>Una vez que todo el epitelio se ha separado enzimática y mecánicamente de los fragmentos uterinos, las estructuras tubulares restantes son los compartimentos "estromal / miometrial". Recoja este tejido en una colagenasa de 2,5 mg/ml + 2 mg/ml de DNasa en solución HBSS.</li>
	<li>Incubar la muestra estromal/miometrial en una agitadora de 37 °C durante 15 min.</li>
	<li>Después de la incubación, agregue 500 μL de DMEM / F12 + 10% FBS + antibióticos por ratón, y filtre los fragmentos no disociados a través de un filtro celular de 40 μm.</li>
	<li>Granular las células por centrifugación durante 5 min a 375 × g.</li>
	<li>Retire con cuidado el sobrenadante y resuspenda el pellet celular en 1 ml de DMEM / F12 + 10% FBS + antibióticos. Agregue la mezcla gota a 10 ml de DMEM / F12 + 10% FBS + antibióticos en una placa de cultivo celular de 10 cm. Incubar la placa a 37 °C en una incubadora de cultivo celular humidificada.</li>
	<li>Para generar cocultivos de células epiteliales y estromales endometriales de ratón, seguir los métodos descritos para organoides endometriales humanos utilizando sistemas de matriz de colágeno o sin andamios 6,8. NOTA: Si bien estas técnicas aún no se han publicado para ratones, se pueden adaptar en función de los protocolos publicados con endometrio humano.</li>
</ol>3. Encapsulación del epitelio uterino en matriz de gel para establecer organoides
NOTA: Mantenga la matriz de gel en hielo hasta que esté lista para ser utilizada.
<ol><li>Retire el sobrenadante y resuspenda el pellet celular en un volumen de matriz de gel que sea 20 veces mayor que el del pellet celular (es decir, si el pellet celular es de 20 μL, resuspenda las células con 400 μL de matriz de gel). Vuelva a suspender el pellet con cuidado para evitar la introducción de burbujas.</li>
	<li>Deje que la suspensión de la matriz de gel / celda se asiente a temperatura ambiente durante ~ 10 min.</li>
	<li>Una vez que la suspensión de la matriz de gel / celda se convierta en un gel semisólido, use una micropipeta P200 con una punta de 200 μL de diámetro ancho para aspirar suavemente 25 μL de la suspensión de matriz / celda de gel. Dispense tres domos separados de 25 μL por pocillo de una placa de 12 pocillos y permita que la matriz de gel se cure durante 15 minutos en una incubadora de cultivo de tejido humidificado a 37 °C.</li>
	<li>Después de que la matriz de gel se haya curado, agregue 750 μL de medio organoide a cada pocillo que contenga cúpulas de matriz de gel. Incubar a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos humidificado. NOTA: La formulación de los medios organoides se indica en la Tabla de materiales. Los organoides generalmente se forman dentro de los 4 días posteriores al cultivo inicial.</li>
</ol>4. Análisis de la expresión génica de organoides endometriales tras el tratamiento con estradiol
NOTA: Esta sección describe los métodos utilizados para perfilar la expresión génica de los organoides epiteliales endometriales utilizando qPCR en tiempo real después del tratamiento con estradiol (E2; ver Tabla 1). Debido a que el endometrio está bajo el control cíclico de la hormona ovárica E2, probar la capacidad de respuesta de los organoides a E2 es una medida importante de la función fisiológica. Hemos obtenido ARN de alta calidad y generado suficiente ARNm para perfilar la expresión génica mediante qPCR y/o secuenciación de ARN a partir de nuestros organoides epiteliales endometriales. Esta sección describe cómo recolectar organoides y procesarlos para el análisis posterior de la expresión génica. El medio de tratamiento seleccionado refleja el utilizado para tratar las células endometriales cultivadas. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que este medio de tratamiento puede optimizarse en consecuencia, como se hace para el tratamiento de cultivos 3D endometriales humanos con hormonas 8,16,17.
<ol><li>Cultivar los organoides endometriales como se describió anteriormente.</li>
	<li>Retire el medio organoide y reemplácelo con 750 μL de medio de inanición cuatro días después de la siembra. Incubar durante la noche.</li>
	<li>A la mañana siguiente, retire el medio de inanición. Añadir 750 μL de medio de tratamiento que contenga cualquiera de los vehículos o 10 nM E2. Incubar durante 48 h.</li>
	<li>Proceda con el aislamiento de ARN siguiendo el protocolo del fabricante del kit.</li>
</ol>5. Análisis histológico de organoides endometriales
NOTA: La obtención de imágenes de las características morfológicas de los organoides endometriales es fundamental para evaluar el efecto celular de los factores de crecimiento, las manipulaciones genéticas o los inhibidores de moléculas pequeñas. Esta sección describe las técnicas utilizadas para fijar, procesar y obtener imágenes de los organoides epiteliales endometriales mediante tinciones histológicas y tinción inmunofluorescente de anticuerpos.
<ol><li>Preparar tubos de microcentrífuga de 1,5 ml que contengan 1 ml de paraformaldehído al 4% en 1x PBS. Colócalos en hielo.</li>
	<li>Aspirar el medio de los pocillos de la placa de 12 pocillos que contiene los organoides.</li>
	<li>Usando una punta de pipeta de 1 ml con una punta cortada, transfiera 500 μL de paraformaldehído al 4% a cada pocillo y separe suavemente las cúpulas de la matriz de gel del fondo de la placa.</li>
	<li>Aspire suavemente todas las cúpulas de la matriz de gel en la punta de la pipeta y transfiéralas al tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.</li>
	<li>Fijar los organoides colocándolos sobre un rotador a 4 °C durante la noche.</li>
	<li>A la mañana siguiente, centrifugar el tubo a 600 × g durante 5 min para granular los organoides. Retire suavemente la solución de paraformaldehído al 4% con una pipeta y deséchela. Lave los organoides 2x con etanol al 70%.</li>
	<li>Después del último lavado, retire todo menos 50-100 μL de etanol del tubo. Deje el tubo a un lado.</li>
	<li>Coloque un tubo de gel de procesamiento de muestras en un baño de agua y microondas durante ~ 30 s para derretir el gel. Asegúrese de que el gel de procesamiento de muestras no hierva controlando la consistencia del gel. NOTA: Una vez que el gel de procesamiento de muestras esté derretido, pero no hirviendo, trabaje rápidamente para encapsular los organoides.</li>
	<li>Transfiera suficiente gel de procesamiento de muestras para cubrir toda la superficie del molde (aproximadamente 250 μL).</li>
	<li>Mientras el gel de procesamiento de la muestra aún está fundido, transfiera rápidamente los 50 μL de solución de etanol al 70% que contiene los organoides. Asegúrese de que los organoides estén hundidos o empujados a la parte inferior del molde.</li>
	<li>Coloque el molde histológico en un cubo de hielo y permita que el gel de procesamiento de la muestra se enfríe y solidifique.</li>
	<li>Una vez que el gel de procesamiento de muestras esté completamente seco, transfiera cuidadosamente el cuadrado del gel de procesamiento de muestras a una bolsa de muestras, haciendo un seguimiento del plano donde se encuentran los organoides.</li>
	<li>Colocar la bolsa en un casete histológico y procesar utilizando métodos estándar utilizados para la fijación de formalina y la incrustación de parafina de los tejidos18.</li>
	<li>Después de la fijación e incrustación en parafina, sección en secciones de 5 μm utilizando un micrótomo19. Proceda con los procedimientos estándar de tinción o inmunotinción de hematoxilina y eosina (H&E), como se describe a continuación.</li>
</ol>6. Tinción de hematoxilina y eosina
<ol><li>Desparafinar las secciones de la siguiente manera: xileno, 2 x 10 min; 100% etanol, 2 x 3 min; 80% etanol, 3 min; 60% etanol, 3 min; dH 2 O,2x 3 min; 1 min en hematoxilina; agua del grifo (3 x 5 s); 1 min en eosina.</li>
	<li>Deshidratar las secciones de la siguiente manera: 60% etanol, 3 min; 80% etanol, 3 min; 95% etanol, 3 min; 100% etanol, 2 x 3 min; xileno, 2 x 15 min.</li>
	<li>Montar con medio de montaje.</li>
</ol>7. Tinción por inmunofluorescencia
<ol><li>Desparafinar las secciones como se describe en el paso 6.1.</li>
	<li>Realizar la recuperación de antígenos<ol><li>Sumerja los portaobjetos en una solución de recuperación de antígenos en un recipiente apto para microondas.</li>
		<li>Microondas a fuego alto durante 20 minutos, utilizando intervalos de 5 minutos para asegurarse de que la solución no hierva.</li>
	</ol></li>
	<li>Después de completar el paso de recuperación de antígenos de 20 minutos, permita que los portaobjetos se enfríen en hielo durante 40 minutos mientras aún están sumergidos en el tampón de recuperación de antígenos.</li>
	<li>Lave las diapositivas con 1x TBST durante 3 minutos</li>
	<li>Bloquear los portaobjetos incubando en BSA al 3% en TBST durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubación de anticuerpos primarios<ol><li>Diluir el anticuerpo en BSA al 3% en TBST (1:50-1:1.000, dependiendo de Ab).</li>
		<li>Incubar durante la noche a 4 °C en una cámara humidificada.</li>
		<li>Lavar 3 x 5 min con TBST.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubación secundaria de anticuerpos<ol><li>Diluir el anticuerpo en BSA al 3% (en TBST) (1:250), o en suero de burro normal al 5%.</li>
		<li>Incubar durante 1 h a temperatura ambiente (RT) en la oscuridad, ya que el anticuerpo se conjuga con un fluoróforo.</li>
	</ol></li>
	<li>Tinción nuclear<ol><li>Diluir 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) 1:1.000 en TBST.</li>
		<li>Incubar durante 5 min en RT.</li>
		<li>Lavar 2 x 5 min con TBST.</li>
	</ol></li>
	<li>Montura<ol><li>Utilice una gota de medio de montaje para montar el cubreobjetos.</li>
		<li>Selle el cubreobjetos con esmalte de uñas al día siguiente.</li>
	</ol></li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Aquí, describimos los métodos para generar organoides epiteliales endometriales a partir del endometrio del ratón y los protocolos utilizados rutinariamente para su análisis posterior. Los organoides endometriales son una herramienta poderosa para estudiar los mecanismos que controlan las enfermedades relacionadas con el endometrio, como la endometriosis, el cáncer de endometrio y el fracaso de la implantación. Estudios históricos publicados en 2017 reportaron las condiciones para cultivar cultivos a largo plazo y renova...

El endometrio, el tejido mucoso del revestimiento interno de la cavidad uterina, es un tejido único y altamente dinámico que desempeña un papel crítico en la salud reproductiva de una mujer. Durante la vida reproductiva, el endometrio tiene el potencial de someterse a cientos de ciclos de proliferación, diferenciación y descomposición, coordinados por la acción concertada de las hormonas ováricas: estrógeno y progesterona. Los estudios de ratones genéticamente modificados han descubierto mecanismos biológicos básicos que sustentan la respuesta endometrial a las hormonas y el control de la implantación embrionaria, la decidualización de las células estromales y el embarazo1. Sin embargo, los estudios in vitro han sido limitados debido a las dificultades para mantener tejidos endometriales primarios de ratón no transformados en cultivos celulares 2D tradicionales 2,3. Los avances recientes en el cultivo de tejidos endometriales como sistemas de órganos 3D, u organoides, presentan una nueva oportunidad para investigar las vías biológicas que controlan la regeneración y diferenciación de las células endometriales. Los sistemas organoides endometriales de ratón y humano se han desarrollado a partir de epitelio endometrial puro encapsulado en varias matrices4,5, mientras que el endometrio humano se ha cultivado como cocultivos epiteliales/estromales sin andamios 6,7, y más recientemente como ensamblajes epiteliales/estromales encapsulados en colágeno8 . El crecimiento y el potencial regenerativo de los cultivos de organoides epiteliales están respaldados por un cóctel definido de factores de crecimiento e inhibidores de moléculas pequeñas que han sido determinados empíricamente para maximizar el crecimiento y la regeneración de los organoides 4,5,9. Además, la capacidad de congelar y descongelar organoides endometriales permite el almacenamiento a largo plazo de organoides endometriales de ratones y humanos para futuros estudios.
Los ratones genéticamente modificados han revelado las complejas vías de señalización que controlan el embarazo temprano y la decidualización, y se han utilizado como modelos de pérdida de embarazo, cáncer de endometrio y endometriosis. Estos estudios genéticos se han logrado en gran medida con la deleción celular específica de alelos flanqueados por loxP ("floxed") utilizando recombinasas cre que son específicamente activas en los tejidos reproductivos femeninos. Estos modelos de ratón incluyen el ampliamente utilizado receptor de progesterona-cre 10, que tiene una fuerte actividad recombinasa en los tejidos epiteliales y estromales endometriales, lactoferrina i-cre, que induce la recombinación epitelial endometrial en ratones adultos11, o Wnt7a-cre, que desencadena la deleción epitelial específica en tejidos derivados de Müllerian12 . El cultivo de tejidos endometriales a partir de modelos de ratón genéticamente modificados como organoides 3D ha brindado una excelente oportunidad para investigar la biología endometrial y facilitar la identificación de factores de crecimiento y vías de señalización que controlan la renovación y diferenciación de las células endometriales13,14. Los métodos para el aislamiento y cultivo de tejido endometrial de ratón se describen en la literatura y reportan el uso de diversas estrategias enzimáticas para el aislamiento del epitelio uterino para el posterior cultivo de organoides epiteliales endometriales4. Si bien la literatura previa proporciona un marco crítico para los protocolos de cultivo de organoides epiteliales endometriales 4,5,6, este documento proporciona un método claro y completo para generar, mantener, procesar y analizar estos organoides. La estandarización de estas técnicas es importante para acelerar los avances en el campo de la biología reproductiva de la mujer. Aquí, presentamos una metodología detallada para la purificación enzimática y mecánica del tejido epitelial endometrial de ratón para el posterior cultivo de organoides endometriales en un andamio de matriz de gel. También describimos las metodologías para los análisis histológicos y moleculares posteriores de los organoides epiteliales endometriales de ratón encapsulados en matriz de gel.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Organoide Formulación de medios</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte></td><td><fuerte>Número de catálogo</fuerte></td><td><fuerte>Concentración final</fuerte></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Factor de crecimiento Matriz de membrana basal reducida (GFR), *sin LDEV</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>100%</td></tr><tr><td>Tripsina de páncreas bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1426-1G</td><td>1%</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634010</td><td>1X</td></tr><tr><td>N2 suplemento</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td>1X</td></tr><tr><td>B-27&trade; Suplemento (50X), menos vitamina A</td><td>Life Technologies</td><td>12587010</td><td>1X</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>100 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>N-acetil-L-cisteína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td>1.25 mM</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030024</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636-100G</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>Inhibidor de ALK-4, -5, -7, A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>EGF humano recombinante</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>Recombinante humano Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>Recombinante humano Rspondin-1</td><td>Peprotech</td><td>120-38</td><td>500 ng/mL</td></tr><tr><td>Recombinante humano FGF-10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>HGF humano recombinante</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>WNT3a</td><td>R& D systems</td><td>5036-WN</td><td>200 ng/mL</td></tr><tr><td><fuerte>Otros suministros y reactivos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte></td><td><fuerte>Número de catálogo</fuerte></td><td><fuerte>Concentración final</fuerte></td></tr><tr><td>Colagenasa de Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0130-1G</td><td>5 mg/ mL</td></tr><tr><td>Desoxirribonucleasa I del páncreas bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN25-100MG</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>DPBS, sin calcio, sin magnesio</td><td>ThermoFisher</td><td>14190-250</td><td>1X</td></tr><tr><td>HBSS, sin calcio, sin magnesio</td><td>ThermoFisher</td><td>14170112</td><td>1X</td></tr><tr><td>Falcon&nbsp; Microplacas de poliestireno (24 pocillos)</td><td>Fisher Scientific</td><td>#08-772-51</td><td></td></tr><tr><td>Falcon&nbsp; Microplacas de poliestireno (12 pocillos)</td><td>Fisher Scientific</td><td>#0877229</td><td></td></tr><tr><td>Coladores de células Falcon, 40 &micro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>#08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>MiniPrep de ARN de zol directo (50 y micro; g)</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-331</td><td></td></tr><tr><td>Trizol reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES, rojo sin fenol</td><td>ThermoFisher</td><td>11039021</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino fetal, Carbón tirado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6765-500ML</td><td>2%</td></tr><tr><td>Estratiol (E2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1024-1G</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>Formaldehído 16% en acuoso solución, grado EM VWR</td><td></td><td>15710</td><td>4%</td></tr><tr><td>Epredia Cassette 1 cassettes de tejido ranurado</td><td>Fisher Scientific</td><td>1000961</td><td></td></tr><tr><td>Epredia Moldes de base de inclusión de acero inoxidable</td><td>Fisher Scientific</td><td>64-010-15&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 grados (100%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-601&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Histoclear</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-899-90147</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-277-97</td><td></td></tr><tr><td>Epredia Bolsas de biopsia de nailon</td><td>Fisher Scientific</td><td>6774010</td><td></td></tr><tr><td>HistoGel Gel de procesamiento de muestras</td><td>VWR</td><td>83009-992</td><td></td></tr><tr><td>Solución de hematoxilina Premium</td><td>VWR</td><td>95057-844</td><td></td></tr><tr><td>Solución de eosina Y (amarillenta) Premium</td><td>VWR</td><td>95057-848</td><td></td></tr><tr><td>TBS Tampón, 20X, pH 7,4</td><td>GenDEPORT</td><td>T8054</td><td>1X</td></tr><tr><td>TBST (10X), pH 7,4</td><td>GenDEPORT</td><td>T8056</td><td>1X</td></tr><tr><td>Ácido cítrico&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0759-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sodio tribásico dihidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4641-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153-100G</td><td>3%</td></tr><tr><td>DAPI Solución (1 mg/mL)</td><td>ThermoFisher</td><td>62248</td><td>dilución 1:1000</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antidecoloración Medio de montaje</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000-10</td><td></td></tr><tr><td>Esmalte de uñas transparente</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1849418</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Portaobjetos de microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>22037246</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cubreobjetos</td><td>VWR VWR</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript VILO Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>11755050</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4364346</td><td></td></tr><tr><td>Krt8 Antibody (TROMA-I)&nbsp;</td><td>DSHB</td><td>TROMA-I&nbsp;</td><td>Dilución 1:50</td></tr><tr><td>Vimentina Antobody</td><td>Cell Signaling</td><td>5741S</td><td>Dilución 1:200</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-rata IgG (H+L) anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21209</td><td>dilución 1:250</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti de burro anti-Rabbin anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21206</td><td>Dilución 1:250</td></tr><tr><td>ZEISS Stemi 508 Stereo Microscopio</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEISS Axio Vert.A1 Microscopio de rutina invertido con cámara digital</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Primer Sequence</strong</td><td>>Forward (5'-3')</td><td>Reverse (5'-3')</td><td>_</td></tr><tr><td>Lipocalin 2 (Lcn2)</td><td>GCAGGTGGTACGTTGTGGG</td><td>CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC</td><td></td></tr><tr><td>Lactoferrina (Ltf)</td><td>TGAGGCCCTTGGACTCTGT</td><td>ACCCACTTTTCTCATCTCTCTTC</td><td></td></tr><tr><td>Progesterona (Pgr)</td><td>CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC</td><td>TAACTTCAGACATCATCATTTCCGG</td><td></td></tr><tr><td>Gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa (Gapdh)</td><td>CAATGTGTCCGTCGTGGATCT</td><td>GCCTGCTTCACCACCTTCTT</td><td></td></tr></tbody></table>

establecimiento de organoides endometriales 3d a partir del útero del ratón

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

El tejido endometrial recubre la cavidad interna del útero y está bajo el control cíclico del estrógeno y la progesterona. Es un tejido que se compone de epitelio luminal y glandular, un compartimento estromal, una red vascular y una población compleja de células inmunes. Los modelos de ratón han sido una herramienta poderosa para estudiar el endometrio, revelando mecanismos críticos que controlan la implantación, la placentación y el cáncer. El reciente desarrollo de cultivos de organoides endometriales 3D presenta un modelo de vanguardia para diseccionar las vías de señalización que subyacen a la biología endometrial. Establecer organoides endometriales a partir de modelos de ratón genéticamente modificados, analizar sus transcriptomas y visualizar su morfología a una resolución de una sola célula son herramientas cruciales para el estudio de las enfermedades endometriales. Este documento describe métodos para establecer cultivos 3D de epitelio endometrial de ratones y describe técnicas para cuantificar la expresión génica y analizar la histología de los organoides. El objetivo es proporcionar un recurso que pueda usarse para establecer, cultivar y estudiar la expresión génica y las características morfológicas de los organoides epiteliales endometriales.

Imágenes de contraste de fase de organoides endometriales de ratón Establecimos organoides a partir de epitelio endometrial de ratón WT, como se describe en el protocolo adjunto (ver diagrama en la Figura 1). Después de la disociación enzimática del epitelio endometrial del ratón, las láminas epiteliales se separaron mecánicamente de las células del estroma uterino y se disociaron aún más con colagenasa para generar una suspensión unicelular. Si se realiza correctamente, ...

Este protocolo describe metodologías para establecer organoides epiteliales endometriales de ratón para la expresión génica y análisis histológicos.

Establecimiento de organoides endometriales 3D a partir del útero del ratón

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

Este protocolo es significativo ya que muestra una metodología paso a paso para aislar epitelio uterino altamente puro del útero de ratón para el cultivo de organoides endometriales. Este método utiliza eficientemente la disociación enzimática y mecánica para aislar el epitelio uterino. Las técnicas se simplificaron para establecer, tratar y analizar organoides del epitelio endometrial derivados del epitelio aislado.Comience descongelando la matriz de gel en hielo durante aproximadamente una o dos horas antes de usarla. Luego disecciona al ratón sacrificado haciendo una incisión en la línea media en el abdomen con tijeras y pelando suavemente la piel para exponer la capa peritoneal subyacente. Localice los cuernos uterinos moviendo suavemente las almohadillas de grasa abdominal a un lado y sostenga los cuernos uterinos en la unión cervical antes de cortarlos a lo largo de la grasa mesentérica.Después de la disección del útero del ratón, retire completamente el tejido graso del cuerno uterino con tijeras pequeñas. Una vez hecho esto, corte cada cuerno uterino en pequeños fragmentos, cada uno mide aproximadamente cuatro a cinco milímetros. Coloque todos los fragmentos uterinos de un útero en un pocillo de una placa de 24 pocillos que contenga 0,5 mililitros de tripsina al 1%.Luego incube la placa de 24 pocillos en una incubadora de cultivo de tejido humidificado de 37 grados centígrados durante aproximadamente una hora para la separación enzimática del epitelio endometrial del estroma subyacente. Después de la incubación, transfiera los fragmentos uterinos a una placa de cultivo de tejido de 35 milímetros que contenga un mililitro de solución tamponada de fosfato de Dulbecco o DPBS. Luego, separe el epitelio uterino de la trompa uterina bajo un microscopio de disección sosteniendo un extremo de un fragmento uterino con los fórceps y pasando suavemente la punta de la pipeta longitudinalmente a través del fragmento, apretando el epitelio fuera del otro extremo de la trompa uterina.Luego observe las hojas epiteliales separadas del fragmento uterino bajo el microscopio de disección. A continuación, transfiera suavemente todas las láminas epiteliales al mismo tubo de 1,5 mililitros con la pipeta de un mililitro. Y granular las láminas epiteliales disociadas por centrifugación a 375 x g durante cinco minutos.Retire con cuidado el sobrenadante sin alterar el pellet celular y vuelva a suspender el pellet celular en 0,5 mililitros de 2,5 miligramos por mililitro de colagenasa más dos miligramos por mililitro de solución de ADN. Pipetear hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 10 veces o hasta que se logre una suspensión de una sola célula. A continuación, agregue 0.5 mililitros de DMEM F / 12 más 10% de suero bovino fetal o FBS más antibióticos y centrifugue las células durante cinco minutos a 375 x g.Retire el sobrenadante, resuspenda las células en un mililitro DMEM / F12 más 10% FBS más antibióticos y centrifugue las células. Coloque la matriz de gel en hielo hasta que esté lista. A continuación, retire el sobrenadante de las células centrífugas y resuspenda el pellet celular utilizando 20 veces el volumen de la matriz de gel sin introducir las burbujas.Deje que la suspensión de células de matriz de gel se asiente a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos. Una vez que la suspensión de células de matriz de gel se convierta en un gel semisólido, use una micropipeta P200 con una punta de 200 microlitros de diámetro ancho y aspire suavemente 25 microlitros de la suspensión de células de matriz de gel. Dispense tres domos separados de 25 microlitros por pocillo de una placa de 12 pocillos y permita que la matriz de gel se cure durante 15 minutos y una incubadora de cultivo de tejido humidificado de 37 grados centígrados.Después de curar la matriz de gel, agregue 750 microlitros de medio organoide a cada cúpula de matriz de gel que contenga pocillos, e incubador a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo de tejidos humidificados. Las imágenes de contraste de fase de organoides endometriales de ratón mostraron que la separación de células epiteliales y estromales produjo muestras con no más del 10% al 15% de contaminación del tipo de célula opuesta. Las células epiteliales endometriales se ensamblaron en organoides en tres o cuatro días.Los organoides endometriales fijados en parafina con formol seccionados se visualizaron mediante tinciones de hematoxilina y eosina, que mostraban la capa única de epitelio y centros huecos, los lúmenes de los organoides. Las imágenes de microscopio de fluorescencia mostraron que todas las células en los organoides eran positivas para citoqueratina 8 y contenían DAPI, lo que indica que la fijación, incrustación y procesamiento de los organoides endometriales es compatible con la inmunotinción basada en anticuerpos. La PCR cuantitativa en tiempo real mostró que la estimulación con 10 nanomolares de estradiol aumentó la expresión de lipocalina 2, lactoferrina y receptor de progesterona en los organoides epiteliales, lo que indica que los organoides epiteliales endometriales se pueden utilizar con éxito para medir los cambios en la expresión génica en respuesta al estradiol.Es importante asegurarse de que se obtenga una separación clara del epitelio endometrial durante la etapa de disociación mecánica. Uno debe ser capaz de observar el epitelio emergiendo de la trompa uterina. Otros métodos incluyen el establecimiento de los organoides epiteliales por encapsulación en una matriz de gel.Si se desea, el compartimiento estromal se puede digerir aún más para crear cocultivos estromales epiteliales 3D. El método puede ayudar a responder preguntas sobre las señales que controlan la renovación del endometrio. Podría ayudar a tratar enfermedades en las mujeres, como la endometriosis, la pérdida del embarazo y el cáncer.

establishing-3d-endometrial-organoids-from-the-mouse-uterus

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Una descripción de la inducción quirúrgica de la endometriosis en ratones y ratas por auto-trasplante de tejido uterino de la cascada arterial del mesenterio intestinal.

Modelo de ratón de la endometriosis quirúrgicamente inducida por la Auto-trasplante de tejido uterino

Se presenta un protocolo para generar organoides endometriales primarios humanos que consisten en células epiteliales y estromales y retienen las características del tejido endometrial nativo. Este protocolo describe los métodos desde la adquisición de tejido uterino hasta el procesamiento histológico de organoides endometriales.

Generación de organoides endometriales primarios humanos multicelulares

Muchos modelos de roedores de endometriosis están limitados por la complejidad técnica, la reproducibilidad y / o la necesidad de animales inmunocomprometidos o ratones reporteros especiales. Presentamos un sistema simplificado de inducción de lesiones utilizando cualquier ratón experimental con un sistema de puntuación objetivo verificable de forma independiente y sin necesidad de ovariectomía o cirugía de supervivencia.

Un modelo murino singénico de endometriosis utilizando ratones de ciclo natural

Este estudio presenta un nuevo modelo de ratón diseñado específicamente para simular el endometrioma, un subtipo clínicamente significativo de endometriosis. Mediante la utilización de ratones C57BL/6J, el modelo tiene como objetivo dilucidar los mecanismos fisiopatológicos que subyacen a la infertilidad relacionada con el endometrioma, ofreciendo una herramienta refinada para cerrar la brecha de conocimiento actual en medicina reproductiva.

Establecimiento de un modelo experimental de endometrioma en ratones para estudiar su infertilidad relacionada

En este trabajo se presenta un protocolo para aislar y cultivar células madre epiteliales endometriales (reESCs) de rata, generando organoides endometriales de rata. Este método facilita los estudios in vitro de las enfermedades endometriales, permitiendo la edición génica y otras manipulaciones celulares.

Generación y caracterización de organoides de útero de rata a partir de células madre epiteliales endometriales de rata

Este artículo describe un protocolo detallado para producir un endometrio delgado fiable y reproducible con una tasa de mortalidad muy baja y adherencias intrauterinas mínimas mediante la inyección de etanol al 95% en el útero de ratón en 1-3 minutos.

Establecimiento de un modelo de ratón de endometrio delgado

Este protocolo detalla el desarrollo de modelos de ratón de carcinoma de ovario seroso de alto grado (HGSOC) in vitro e in vivo. A partir de la derivación de organoides de trompas de Falopio murinos, su modificación genética para recapitular la genética HGSOC humana y su introducción en la bolsa ovárica de ratones singénicos para el desarrollo in vivo de tumores.

Desarrollo de líneas de organoides derivados de ratones a partir de células epiteliales de trompas de Falopio para el modelado de carcinoma de ovario seroso de alto grado

Este protocolo describe un método definido basado en hidrogel para generar organoides mamarios humanos que recapitulan características clave de la morfogénesis mamaria en un sistema de cultivo tridimensional controlado.

Un método definido basado en hidrogel para generar organoides mamarios humanos tridimensionales que recapitulan la morfogénesis mamaria

Inyección intravítrea es una técnica ampliamente utilizada en la investigación de las ciencias visuales de enfermedades oculares o en la aplicación directa del tratamiento local. Este vídeo demuestra un protocolo de inyección intravítrea con una jeringa de 1 ml con una pipeta de vidrio. Consejos útiles acerca de cómo evitar una hemorragia masiva y daños en el objetivo se les da.

Inyección intravítrea para el establecimiento de modelos Enfermedades Oculares

En este artículo se describe un protocolo para el aislamiento y mantenimiento de cultivos primarios de fibroblastos de la piel y el tejido pulmonar de los roedores salvajes.

El establecimiento de cultivos primarios de fibroblastos de adultos de los roedores

Aprende a aislar epitelio uterino puro de ratón mediante disociación enzimática y mecánica para establecer organoides endometriales 3D. Este método permite estudiar la señalización endometrial y su renovación.

Establecimiento de organoides endometriales 3D a partir del útero del ratón

Explorar más videos