Name: Microingeniería de hidrogeles de colágeno 3D con alineación de fibras de largo alcance (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Aprende a microfabricar hidrogeles de colágeno 3D con alineación de fibras controlada mediante microfluidos. Esta técnica permite modelar entornos tisulares sanos y patológicos para estudiar el comportamiento celular in vitro.

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Este trabajo fue apoyado en parte por el Instituto Nacional de Salud bajo el número de concesión R21GM143658 y por la Fundación Nacional de Ciencias bajo el número de subvención 2150798. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de las agencias de financiación.

1. Fabricación del canal de dos piezas y la base de la plataforma modular
NOTA: El canal microfluídico se construye utilizando dos partes: el "recorte" del canal microfluídico, que es una cuchilla cortada de una lámina de polidimetilsiloxano (PDMS) de espesor definido, y la cubierta del canal, que se une reversiblemente al corte y forma el canal. El canal está rodeado por un marco de poli(metacrilato de metilo) (PMMA) que actuará como un depósito de medios (Figura 1). El marco de PMMA también se puede utilizar para enganchar magnéticamente módulos especializados para mayor funcionalidad.
<ol><li>Canales de corte de navajas de hojas PDMS: NOTA: El diseño del canal microfluídico para este paso se proporciona en la Figura suplementaria 1. El canal consta de cinco segmentos de longitud de 5 mm cada uno y anchos de 10 mm, 5 mm, 2,5 mm, 1,25 mm y 0,75 mm. La velocidad de la solución de colágeno, inyectada a un caudal constante (50-400 μL·min−1), aumenta localmente a lo largo del canal a medida que disminuye el ancho del canal para generar flujo extensional.<ol><li>Monte una lámina PDMS de 250 μm de espesor en una lámina portadora de plástico y corte con navaja el diseño microfluídico utilizando un cortador artesanal a una profundidad de cuchilla de 0,5 mm, velocidad de 1 cm·s−1 y alta fuerza.</li>
		<li>Usando un baño ultrasónico, limpie los recortes del canal microfluídico durante 5 minutos. Enjuague los canales sonicados en agua desionizada (DI) y séquelos en una placa calefactora limpia a 100 °C durante 5 min.</li>
		<li>Guarde los canales en una placa de Petri limpia y cubierta hasta que los use.</li>
	</ol></li>
	<li>Fabricación de la cubierta PDMS y pasivación superficial: NOTA: El corte de canal de la sección 1.1 requiere una cubierta que se puede colocar encima de ella para crear un canal cerrado en el que se pueda inyectar una solución de COL1 (Figura complementaria 1). La cubierta se puede quitar después de que el COL1 se haya autoensamblado. Para minimizar las posibilidades de que el COL1 en el canal se una a la cubierta, la cubierta se pasiva utilizando albúmina sérica bovina (BSA). Se proporciona el diseño del molde para la cubierta PDMS. El molde debe tener al menos 2 mm de espesor y debe tener una huella que sea igual a la huella del recorte del canal microfluídico. En este protocolo, la huella del molde era de 35 mm x 15 mm.<ol><li>Para preparar el molde, fije una lámina de adhesivo sensible a la presión (PSA) en una lámina de PMMA de 2,5 mm de espesor y corte con láser la forma de molde deseada.</li>
		<li>Limpie el molde de PMMA cortado con láser con una toallita húmeda y sin pelusa y retire el respaldo de la película de PSA. Fije el molde a una oblea de silicio de 100 mm de diámetro bt presionando firmemente.</li>
		<li>Prepare PDMS en una proporción de 10:1 (base:reticulante). Mezcle vigorosamente durante 1 minuto para asegurar una mezcla adecuada y desgasifique la mezcla en una cámara de vacío para eliminar las burbujas de aire.</li>
		<li>Verter la solución de PDMS desgasificada en el molde de PMMA/silicio y curar en una placa calefactora a 100 °C durante 20 min. Deje que el molde se enfríe, retire el PDMS curado y recorte cualquier exceso con una cuchilla de afeitar. NOTA: Asegúrese de que los lados orientados hacia la oblea de silicio (lados planos) de las cubiertas del PDMS estén orientados hacia arriba en todos los pasos siguientes.</li>
		<li>Utilice un punzón de biopsia de 1 mm de diámetro para crear orificios de entrada y salida que correspondan a los extremos del canal microfluídico. El recorte de canal del paso 1.1 se puede utilizar como plantilla para guiar la posición de los orificios.</li>
		<li>Sonicar la cubierta en isopropanol (IPA) durante 5 minutos, enjuagar con agua DI, secar con una fuente de aire comprimido y luego almacenar en una placa de Petri limpia y cubierta. Coloque la placa de Petri en una cámara de esterilización UV (descubierta) durante 1 minuto para esterilizar.</li>
		<li>Cubrir y transferir a un armario de bioseguridad (BSC).</li>
		<li>Pipetear 300 μL de 40 mg•mL-1 de albúmina sérica bovina (BSA) en 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) sobre las cubiertas del PDMS y extender la solución uniformemente con una punta de pipeta. Colocar en nevera a 4 °C durante al menos 4 h antes de usar.</li>
		<li>Mueva las tapas del refrigerador a un BSC, lave 5 veces con 1 PBS y déjelas secar al aire durante 10 minutos. NOTA: Las cubiertas PDMS se pueden almacenar en el refrigerador hasta 1 semana después de recubrirlas con BSA.</li>
	</ol></li>
	<li>Tratamiento con glutaraldehído de cubreobjetos NOTA: La funcionalización de los cubreobjetos con glutaraldehído une covalentemente COL1 al cubreobjetos y evita que el hidrogel se desprenda.<ol><li>Prepare una solución de trietoxisilano de aminopropilo (APTES) al 2% (v/v) en un vaso de precipitados de vidrio agregando 1 ml de APTES a 49 ml de acetona.</li>
		<li>Diluir una solución de glutaraldehído al 25% al 5% en agua DI. Hacer 2 ml de solución por cada cubreobjetos de 24 mm x 50 mm. Para cubreobjetos de 24 mm x 24 mm o 22 mm x 22 mm, haga 1 ml de solución para cada uno.</li>
		<li>Limpie los cubreobjetos en un sonicador de baño durante 5 minutos usando IPA. Enjuague el IPA de los cubreobjetos con agua DI. El IPA se enjuaga completamente cuando se puede ver una película suave de agua en el cubreobjetos.</li>
		<li>Secar los cubreobjetos en una placa caliente durante 5 min a 100 °C. Coloque los cubreobjetos secos en placas de Petri limpias, asegurándose de que no se superpongan.</li>
		<li>Usando una varita de descarga de corona, exponga los cubreobjetos a una descarga de corona durante 1 minuto cada uno. NOTA: Este paso debe realizarse en un área bien ventilada o en una campana química.</li>
		<li>Retire los cubreobjetos de la placa de Petri y luego sumérjalos en la solución APTES durante 10 s dentro de los 5 minutos posteriores a la exposición a la corona, asegurándose de que el cubreobjetos esté sumergido. NOTA: Asegúrese de llevar un registro de qué lado fue tratado con plasma y manténgalo mirando hacia arriba.</li>
		<li>A continuación, sumergir el cubreobjetos en acetona durante 10 s y secar con aire comprimido. Coloque el cubreobjetos seco de nuevo en la placa de Petri, con el lado tratado hacia arriba. NOTA: Repita los pasos 1.3.5-1.3.7 para todos los cubreobjetos.</li>
		<li>Pipetear 1 ml de solución de glutaraldehído sobre la superficie de cada cubreobjetos. Cubra la mayor superficie posible sin permitir que la solución se derrame sobre el borde del cubreobjetos. Se puede agregar más solución de glutaraldehído si es necesario. Asegúrese de no rayar la superficie con la punta de la pipeta.</li>
		<li>Deje que los cubreobjetos reposen en contacto con la solución durante 30 minutos y luego enjuague con agua DI durante 20 s. Seque los cubreobjetos con aire comprimido y vuelva a colocarlos en las placas de Petri, con el plasma tratado con el lado hacia arriba. NOTA: Los cubreobjetos se pueden almacenar hasta por 1 semana a temperatura ambiente (RT).</li>
	</ol></li>
	<li>Corte por láser de la base magnética modular NOTA: El diseño de la base magnética modular se proporciona en la Figura Suplementaria 1. La base modular sirve como un pozo para sostener los medios y también se puede utilizar para unir magnéticamente módulos especializados, como se describe en trabajos publicados anteriormente 22,37,38,39.<ol><li>Recorte los diseños de la capa de PMMA utilizando la configuración láser adecuada, como el número de pasadas y la potencia. NOTA: La configuración del láser debe ajustarse de tal manera que los imanes se puedan colocar en la capa de PMMA. Cada láser es diferente, y los parámetros de corte deben optimizarse experimentalmente. Para un láser de 45 W, se recomienda una velocidad del 100%, una potencia del 100% y 3 pasadas para cortar PMMA de 2 mm a 2 mm de espesor.</li>
		<li>Lave la pieza cortada con láser con agua y jabón para eliminar los residuos del proceso de corte por láser. NOTA: No utilice disolventes para limpiar las piezas cortadas con láser. Los disolventes pueden provocar la propagación de microfisuras en los bordes cortados con láser.</li>
	</ol></li>
	<li>Montaje de la plataforma<ol><li>Empuje los imanes (3/16 de diámetro, 1/16 de grosor) a mano en la base cortada con láser. Se puede usar un martillo suave o un extremo de destornillador para ayudar a empujar el imán. El grosor de los imanes debe ser menor que el grosor de la base de PMMA para garantizar que los imanes estén al ras de la superficie de la base. NOTA: Los imanes permiten al usuario agregar funcionalidad a la plataforma mediante la conexión de módulos adicionales.</li>
		<li>Despegue el respaldo de la hoja de PSA y fije la base a un cubreobjetos tratados con glutaraldehído con el lado funcionalizado hacia arriba.</li>
		<li>Coloque suavemente el recorte del canal PDMS en la cavidad definida por el marco. Presione hacia abajo con pinzas de punta ancha para eliminar las burbujas de aire y garantizar el contacto conformado.</li>
		<li>Coloque la cubierta del canal tratado con BSA en la parte superior del recorte del canal, con el lado de BSA hacia abajo. Asegúrese de que los puertos de entrada y salida del fluido estén alineados con el canal.</li>
		<li>El dispositivo está listo para la inyección de COL1.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Inyectar la solución de COL1 en el microcanal y retirar la cubierta para aplicaciones de cultivo celular
<ol><li>Preparación de la solución COL1<ol><li>Coloque todos los reactivos necesarios (solución madre de COL1 [6 mg·mL−1], agua ultrapura, 10x PBS, 0,1 M NaOH) en hielo en el gabinete de bioseguridad.</li>
		<li>Calcule el volumen de reactivos de la siguiente manera <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64457/64457eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/64457/64457eq02.jpg" style="margin: auto;"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/64457/64457eq03.jpg" style="margin: auto;"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/64457/64457eq04.jpg" style="margin: auto;"> NOTA: Por lo tanto, para hacer 1 ml de colágeno neutralizado de 2.5 mg·mL−1 a partir de un stock de 6 mg·mL−1, agregue 416.67 μL de colágeno, 429.16 μL de agua DI, 100 μL de 10x PBS y 54.16 μL de NaOH 0.1 M para un pH final de 7. Añadir 20 μL de NaOH 0,1 M para alcanzar un pH de 9,0.</li>
		<li>Añadir los reactivos en un vial vacío de 5 ml en el siguiente orden: i) COL1 stock, ii) DI agua, iii) 10x PBS, iv) 0,1 M NaOH. NOTA: Utilice una pipeta de desplazamiento para manipular la solución COL1. Puede producirse una pérdida significativa de la muestra si se utiliza una pipeta normal, lo que provoca fluctuaciones en la concentración de la solución final.</li>
		<li>Eleve el pH de la solución al pH deseado (típicamente entre 7-9).</li>
	</ol></li>
	<li>Inyección de la solución COL1<ol><li>Coloque una bomba de jeringa, una jeringa estéril refrigerada, una solución de COL1 neutralizada refrigerada y una aguja de bloqueo Luer de punta angular estéril de 20 G 90° en un gabinete de bioseguridad. Cargue la solución de COL1 en la jeringa, teniendo cuidado de evitar la introducción de burbujas.</li>
		<li>Acople la punta de la aguja de 90° 20 G a la jeringa, cargue la jeringa en la bomba de la jeringa, con la aguja hacia abajo y prepare la aguja con la solución COL1.</li>
		<li>Ajuste la bomba de jeringa al caudal requerido, entre 50-2.000 μL/min.</li>
		<li>Coloque los canales PDMS preparados (sección 1) en un conector de laboratorio y nivele con la aguja.</li>
		<li>Inserte la aguja en el puerto de entrada del canal PDMS (lado ancho). Inyecte el canal hasta que se acumule una gota de ~30 μL de COL1 en el lado de salida.</li>
		<li>Baje el gato de laboratorio y separe suavemente la aguja del canal recién llenado.</li>
		<li>Repita los pasos 2.2.5-2.2.9 hasta que todos los canales se hayan llenado con la solución COL1.</li>
		<li>Cargue los canales llenos en las placas de Petri junto con una toallita limpia y sin pelusa saturada con agua DI para evitar la deshidratación del gel COL1 recién formado.</li>
		<li>Cubra la placa de Petri y coloque los canales cargados en la incubadora (37 °C, 95% de humedad) durante 2 h antes del paso de despegado.</li>
	</ol></li>
	<li>Despegado y equilibrio de los medios<ol><li>Exponga el gel COL1 polimerizado levantando la cubierta del PDMS con pinzas. El tratamiento BSA evita que COL1 se adhiera a la cubierta.</li>
		<li>Agregue 650 μL de EGM al pozo.</li>
		<li>Deje los dispositivos en la incubadora (37 °C, 95% de humedad) durante un mínimo de 4 h para equilibrar el gel y el medio. Reemplace el medio antes de sembrar con celdas</li>
	</ol></li>
	<li>Células de siembra<ol><li>Coloque la tripsina tibia al 0,25% y los medios de cultivo junto con el número requerido de pipetas de 5 ml y 10 ml en el gabinete de bioseguridad.</li>
		<li>Cultivo de células endoteliales de venas umbilicales humanas (HUVECs) al 80% de confluencia en medios de crecimiento endotelial (EGM) a 37 °C, en 95% de humedad. Colocar el matraz de cultivo tisular que contiene HUVEC en el BSC después de comprobar la confluencia bajo un microscopio.</li>
		<li>Desechar el medio en el matraz T25 y lavar las celdas 2 veces con 1x PBS. Añadir 1 ml de tripsina al matraz y colocarlo en la incubadora (37 °C, 95% de humedad) durante 3 min.</li>
		<li>Compruebe el matraz bajo el microscopio después de 3 minutos para asegurarse de que las células estén completamente separadas de la superficie.</li>
		<li>Añadir 3 ml de EGM (con suero) al matraz para neutralizar la tripsina. A continuación, transfiera la solución celular con una pipeta de 5 ml a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar el tubo cónico que contiene células a 150 x g durante 5 min.</li>
		<li>Coloque el tubo cónico en el gabinete de bioseguridad y deseche el sobrenadante sin alterar el pellet celular. Resuspender las células en 1 ml de medios de cultivo frescos.</li>
		<li>Añadir y mezclar 15 μL de azul de tripano y 15 μL de la solución celular resuspendida en un tubo cónico de 1 ml.</li>
		<li>Inyecte azul de tripano y solución celular en ambos lados de un portaobjetos de conteo de células e inserte el portaobjetos en un dispositivo de conteo de células.</li>
		<li>Diluir la solución celular en medios de crecimiento endotelial a la concentración requerida en función de la concentración celular obtenida del dispositivo de recuento celular. NOTA: Un matraz T25 de HUVEC al 80% de confluencia producirá ~750.000 células·ml−1 si se diluye en 1 ml de medio. El volumen de la suspensión celular a sembrar se calcula como área de la superficie de cultivo × densidad/concentración celular de la suspensión celular. Ejemplo: Para sembrar 20,000 células·cm−2 en el pozo de 35 mm x 15 mm, se necesitarán ~140 μL de la suspensión celular.</li>
		<li>Aspire el medio en la matriz COL1 diseñada.</li>
		<li>Agregue el volumen requerido de la solución celular sobre el sustrato de COL1 y deje que las células se asienten durante un mínimo de 4 h antes de la imagen.</li>
	</ol></li>
	<li>Etiquetado del núcleo celular y el citoesqueleto<ol><li>Aspirar el medio de las células y lavar 3 veces con 1x PBS, 500 μL en cada lavado. Cubrir la capa celular con paraformaldehído al 4% durante 15 min en RT.</li>
		<li>Aspirar el paraformaldehído y lavar con 1x PBS Tween-20 durante 5 min.</li>
		<li>Permeabilizar la membrana celular utilizando 500 μL de solución Triton-X al 0,1% en PBS durante 15 min. Lavar con 1x PBS Tween-20 durante 5 min.</li>
		<li>Bloquear los sitios de unión no específicos con 500 μL de BSA al 4% en PBS durante 30 min a RT.</li>
		<li>Diluir la solución de etiqueta fluorescente de faloidina-actina en BSA al 4% (1 μL de material en 400 μL de BSA).</li>
		<li>Aspire la solución de BSA, agregue la solución de faloidina a las células y espere 30 minutos en RT.</li>
		<li>Diluir la tinción nuclear en BSA al 4% (1 μL en 500 μL), aspirar la faloidina, añadir la solución de tinción nuclear de trabajo, y esperar 15 min en RT.</li>
		<li>Aspire la solución de trabajo de manchas nucleares, lave con PBS Tween-20 3x durante 5 minutos cada uno, y reemplácelo con 1x PBS antes de la imagen.</li>
		<li>Imagen con un microscopio epifluorescente utilizando el canal FITC (ex 491 nm/em 516 nm) y el canal DAPI (ex 360 nm/em 460 nm) con una lente 40x. Imagen del colágeno utilizando un escaneo láser confocal en el modo de reflectancia utilizando la línea láser de 488 nm (15% de potencia) y el objetivo de inmersión en agua 40x.</li>
	</ol></li>
</ol>

Todos los autores declaran no tener intereses en conflicto.

Los protocolos para generar matrices COL1 con fibras alineadas han sido descritos utilizando métodos magnéticos, la aplicación directa de deformación mecánica y técnicas microfluídicas47. Los enfoques microfluídicos se utilizan comúnmente para crear sistemas microfisiológicos debido a sus características de flujo y transporte bien definidas, que permiten un control preciso sobre el microambiente bioquímico. Dado que las fibras COL1 alineadas proporcionan señales instructivas clave durante los proc...

Las células residen en una compleja red fibrosa 3D llamada matriz extracelular (MEC), la mayor parte de la cual está compuesta por la proteína estructural colágeno tipo I (COL1)1,2. Las propiedades biofísicas de la ECM proporcionan señales de orientación a las células y, en respuesta, las células remodelan la microarquitectura de la ECM 3,4,5. Estas interacciones recíprocas célula-matriz pueden dar lugar a dominios de fibra COL1 alineados6 que promueven la angiogénesis y la invasión celular en el ambiente tumoral 7,8,9 e influyen en la morfología celular 10,11,12, polarización13 y diferenciación 14. Las fibras de colágeno alineadas también promueven la cicatrización de heridas 15, desempeñan un papel clave en el desarrollo de los tejidos16 y contribuyen a la comunicación celular de largo alcance17,18. Por lo tanto, replicar la microarquitectura de fibra COL1 nativa in vitro es un paso importante hacia el desarrollo de modelos estructurados para estudiar las respuestas celulares a microambientes alineados.
Los sistemas de cultivo celular microfluídico se han establecido como una tecnología preferida para desarrollar sistemas microfisiológicos (MPS)19,20,21,22,23. Aprovechando los efectos favorables de escala a microescala, estos sistemas proporcionan un control preciso sobre los flujos de fluidos, admiten la introducción controlada de fuerzas mecánicas y definen el microambiente bioquímico dentro de un microcanal 21,24,25,26,27. Las plataformas MPS se han utilizado para modelar microambientes específicos de tejidos y estudiar interacciones multiorgánicas28. Simultáneamente, los hidrogeles han sido ampliamente explorados para recapitular la mecánica 3D y la influencia biológica de la ECM que se observan in vivo29,30. Con un énfasis creciente en la integración del cultivo 3D con plataformas microfluídicas, numerosos enfoques pueden combinar hidrogeles COL1 en dispositivos microfluídicos31,32,33. Sin embargo, los métodos para alinear hidrogeles COL1 en canales microfluídicos se han limitado a "esteras" delgadas 2D (<40 μm de espesor) en canales de <1 mm de ancho, ofreciendo un potencial limitado para modelar respuestas celulares en microambientes 3D alineados31,34,35,36.
Para lograr hidrogeles COL1 3D alineados en un sistema microfluídico, se ha demostrado que, cuando una solución de COL1 autoensamblable se expone a flujos extensionales locales (cambio de velocidad a lo largo de la dirección de la corriente), los hidrogeles COL1 resultantes muestran un grado de alineación de la fibra que es directamente proporcional a la magnitud de la velocidad de deformación extensional que experimentan37, 38. El diseño de microcanales en este protocolo es único en dos sentidos; primero, el diseño segmentado introduce tensión extensional local a la solución COL1, y segundo, su construcción de "dos piezas" permite al usuario alinear las fibras COL1 y luego desmontar el canal para acceder directamente a las fibras alineadas en un formato abierto. Este enfoque se puede adoptar para desarrollar plataformas microfluídicas modulares que desarrollen sistemas microfisiológicos con matrices COL1 ordenadas. El siguiente protocolo describe el proceso de fabricación de microcanales segmentados y detalla el uso de los canales para alinear el atelo bovino COL1. Este protocolo también proporciona instrucciones para cultivar células en COL1 en un formato de pozo abierto y discute la adición de funcionalidad a la plataforma utilizando una capa base magnética modular.

<table><tbody><tr><td>(3-aminopropil)trietoxisilano, 99% (APTES)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440140-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Serie IT de calibre 20 Punta dispensadora en ángulo</td><td>Jensen Global</td><td>JG-20-1.0-90</td><td></td></tr><tr><td>3/16" de diámetro x 1/16" de espesor Imán niquelado</td><td>KJ Magnetics</td><td>D31</td><td></td></tr><tr><td>3M (TC) 12X12-6-467MP</td><td>DigiKey</td><td>3M9726-ND</td><td></td></tr><tr><td>ACETONA REACTIVO ACS &ge; 99.5%</td><td>Signa Aldrich</td><td>179124-4L</td><td></td></tr><tr><td>BD-20AC TRATADOR DE CORONA DE LABORATORIO</td><td>Productos electrotécnicos</td><td>12051A</td> Albúmina sérica bovina <td></td></tr><tr><td>(BSA), fracción V, 98%, grado reactivo, Alfa Aesar</td><td>VWR</td><td>AAJ64100-09</td><td></td></tr><tr><td>Lámina acrílica de fundición transparente</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K181</td><td></td></tr><tr><td>Corning 100 mL Tripsina 10x, 2.5% Tripsina en HBSS [-] calcio, magnesio, rojo fenol, parvovirus porcino probado</td><td>VWR</td><td>45000-666</td><td></td></tr><tr><td>Countess II Contador de células automatizado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>software CT-FIRE</td><td>LOCI - Universidad de Wisconsin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 Medio de crecimiento de células endoteliales-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído 50% en solución acuosa, Grado Reactivo, Empaque = Botella de HDPE, Tamaño = 100 mL</td><td>VWR</td><td>VWRV0875-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Graphtec CELITE-50</td><td>Graphtec</td><td>CE LITE-50</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 m)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-630-080</td><td></td></tr><tr><td>Caucho de silicona de alta pureza de .010" de grosor, 6" x 8" Hoja, durómetro de 55 A</td><td>McMaster-Carr</td><td>87315K62</td><td></td></tr><tr><td>Células endoteliales de la vena umbilical humana</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C0035C</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen&nbsp; Tinción azul de tripano (0,4%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4154</td><td></td></tr><tr><td>Cortadora láser</td> de <td>espectro completo</td><td>20x12 serie</td><td></td>H Bomba de</tr><tr><td>jeringa de microfluídica</td><td>New Era Bombas de jeringa</td><td>NE-1002X</td><td></td></tr><tr><td>Microman E Pipeta de un solo canal, Gilson, modelo M1000E</td><td>Gilson</td><td>FD10006</td><td></td></tr><tr><td>Sondas moleculares Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Sondas moleculares Hoechst 33342, triclorhidrato, trihidrato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Nutragen Bovine Atelo Collagen</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5010-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Pbs (10x), pH 7.4</td><td>VWR</td><td>70011044.00</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049.00</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS, 10x), con Triton X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>J63521</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de soporte de repuesto para graphtec craft ROBO CC330L-20</td><td>USCUTTER</td><td>GRPCARSHTN</td><td></td></tr><tr><td>Restek Norm-Ject Jeringa de plástico 1 mL Luer Slip</td><td>Restek</td><td>22766.00</td><td></td></tr><tr><td>Oblea de silicio</td><td>University wafer</td><td>452</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio, ACS, Embalaje = Botella de polietileno, tamaño = 500 g</td><td>VWR</td><td>BDH9292-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp; Pierce 20x PBS Tween 20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28352.00</td><td></td></tr></tbody></table>

microingeniería de hidrogeles de colágeno 3d con alineación de fibras de largo alcance

Microengineering 3D Collagen Hydrogels with Long-Range Fiber Alignment

Las fibras alineadas de colágeno I (COL1) guían la motilidad de las células tumorales, influyen en la morfología de las células endoteliales, controlan la diferenciación de las células madre y son un sello distintivo de los tejidos cardíacos y musculoesqueléticos. Para estudiar la respuesta celular a microambientes alineados in vitro, se han desarrollado varios protocolos para generar matrices COL1 con alineación de fibra definida, incluidos métodos magnéticos, mecánicos, basados en células y microfluídicos. De estos, los enfoques microfluídicos ofrecen capacidades avanzadas, como un control preciso sobre los flujos de fluidos y el microambiente celular. Sin embargo, los enfoques microfluídicos para generar matrices COL1 alineadas para plataformas avanzadas de cultivo in vitro se han limitado a "esteras" delgadas (<40 μm de espesor) de fibras COL1 que se extienden a distancias inferiores a 500 μm y no son propicias para aplicaciones de cultivo celular 3D. Aquí, presentamos un protocolo para fabricar matrices 3D COL1 (130-250 μm de espesor) con regiones de escala milimétrica de alineación de fibra definida en un dispositivo microfluídico. Esta plataforma proporciona capacidades avanzadas de cultivo celular para modelar microambientes de tejidos estructurados al proporcionar acceso directo a la matriz de microingeniería para el cultivo celular.

Cuando una solución COL1 autoensamblable fluye a través de un canal con área de sección transversal decreciente, la velocidad de flujo (v x) de la solución COL1 aumenta localmente en una magnitud, ∂v x, a lo largo de la longitud de la constricción entre los dos segmentos (∂x), lo que resulta en una velocidad de deformación extensional (ε̇) donde ε̇ = ∂v x / ∂x. La velocidad de deformación extensional se puede calcular a partir de la velocidad del fluido, que se mide utilizando velocimetrí...

Este protocolo demuestra el uso de un canal microfluídico con geometría cambiante a lo largo de la dirección del flujo de fluido para generar tensión extensional (estiramiento) para alinear fibras en un hidrogel de colágeno 3D (<250 μm de espesor). La alineación resultante se extiende a lo largo de varios milímetros y está influenciada por la velocidad de deformación extensional.

Microingeniería de hidrogeles de colágeno 3D con alineación de fibras de largo alcance

Aligned collagen I (COL1) fibers guide tumor cell motility, influence endothelial cell morphology, control stem cell differentiation, and are a hallmark ...

Este método nos permite diseñar hidrogeles de colágeno 3D con niveles controlados de alineación de fibras para modelar entornos que se encuentran en tejidos sanos y enfermos en el cuerpo. Esta técnica proporciona un enfoque microfluídico simple para diseñar hidrogeles de colágeno alineados, introducir células y cuantificar cómo se comportan las células en entornos 3D definidos topográficamente. Demostrando el procedimiento estarán Neil Joshi, Mehran Mansouri, Ann Byerly y Justin Vidas para mi laboratorio.Para comenzar, monte una lámina PDMS de 250 micrómetros de espesor en un portador de plástico y corte con una navaja el diseño microfluídico con un cortador artesanal a una profundidad de cuchilla de 0,5 milímetros, velocidad de un centímetro por segundo y alta fuerza. Usando un baño ultrasónico, limpie los recortes del canal microfluídico durante cinco minutos. Enjuague los canales sonicados en agua desionizada y séquelos en una placa caliente a 100 grados centígrados durante cinco minutos.Guarde los canales en una placa de Petri limpia y cubierta hasta que los use. Para fabricar la capa de cobertura de PDMS y funcionalizar la superficie para futuras modificaciones, prepare una so

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Un bioprinter se utilizó para crear hidrogeles modelado basado en un molde de sacrificio. El molde poloxámero se rellenó con un segundo hidrogel y luego se eluyó, dejando huecos que estaban llenos de una tercera hidrogel. Este método utiliza elución rápida y buena capacidad de impresión de poloxámero para generar arquitecturas complejas a partir de biopolímeros.

Impresión Moldes inversa termosensible para la Creación de modelado hidrogeles de dos componentes para el 3D de cultivo celular

Este sistema modelo se inicia a partir de un gel de fibrina-miofibroblastos poblado que se puede utilizar para estudiar colágeno endógeno (re) organización en tiempo real de una manera no destructiva. El modelo de sistema es muy sintonizable, ya que se puede utilizar con diferentes fuentes de células, aditivos de medio, y se puede adaptar fácilmente a las necesidades específicas.

Ingeniería fibrina basado en construcciones de tejido de miofibroblastos y de aplicación de las restricciones y la tensión para inducir la organización de células y colágeno (Re)

En este trabajo, presentamos una técnica para la fabricación rápida de tejidos vasculares vivos mediante el cultivo directo de colágeno, células musculares lisas y células endoteliales. Además, se describe un nuevo protocolo para la caracterización mecánica de tejidos vasculares artificiales.

Ingeniería 3D Cellularized colágeno Geles para Vascular Regeneración Tisular

Se desarrolló una innovadora técnica de biofabricación para diseñar construcciones tridimensionales que se asemejan a las características arquitectónicas, componentes y propiedades mecánicas del tejido in vivo. Esta técnica presenta un material de sacrificio recientemente desarrollado, el caucho BSA, que transfiere características espaciales detalladas, reproduciendo las arquitecturas in vivo de una amplia variedad de tejidos.

Tridimensional Tecnología Biomimética: Novel biorubber Crea Definido micro y macro escala Arquitecturas de colágeno hidrogeles

El colágeno es un componente central de la ECM, y proporciona indicaciones esenciales para varios procesos celulares que van desde la migración a la diferenciación y la proliferación. Aquí se incluye es un protocolo para la incorporación de las células dentro de los hidrogeles de colágeno en 3D, y una técnica más avanzada para la generación de matrices de colágeno aleatorios o alineados utilizando PDMS microcanales.

Preparación de geles de colágeno en 3D y microcanales para el estudio de las interacciones 3D<em&gt; En Vivo</em

Aquí, proporcionamos un método para analizar el comportamiento del crecimiento de axons en matrices 3D, imitando su desarrollo natural.

Generación de hidrogeles a base de colágeno 3D para analizar el crecimiento y el comportamiento axonal durante el desarrollo del sistema nervioso

Aquí se presenta un método para la bioimpresión 3D de gelatina metacriloyl.

Protocolos de Bioimpresión 3D de Bioinks basados en Gelatin Methacryloyl Hydrogel

Este protocolo describe una plataforma de cultivo celular basada en membranas reconfigurable que integra el formato de pozo abierto con capacidades de flujo de fluidos. Esta plataforma es compatible con los protocolos estándar y permite transiciones reversibles entre los modos de cultivo microfluídico y de pozo abierto, adaptándose a las necesidades de los laboratorios de ingeniería y biociencias.

Transformación de modelos tisulares de barrera estática en sistemas microfisiológicos dinámicos

El siguiente protocolo presenta un método de extrusión basado en cizallamiento para la fabricación de hidrogeles de colágeno con fibrillas con patrones a nanoescala, que se puede aplicar a una amplia gama de aplicaciones de ingeniería de tejidos.

Producción de colágeno con patrones nanofibrilares para la ingeniería de tejidos

A continuación, presentamos un protocolo para fabricar nanofibras andamios electrospun con organización gradated de fibras y explorar sus aplicaciones en la regulación de la morfología celular / orientación. Gradientes con respecto a las propiedades físicas y químicas de las nanofibras andamios ofrecen una amplia variedad de aplicaciones en el campo biomédico.

Electrospun nanofibras andamios con gradaciones en Organización de fibra

Aprende a microfabricar hidrogeles de colágeno 3D con alineación de fibras controlada mediante microfluidos. Esta técnica permite modelar entornos tisulares sanos y patológicos para estudiar el comportamiento celular in vitro.

Microingeniería de hidrogeles de colágeno 3D con alineación de fibras de largo alcance

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