Name: Cuantificación de ARN circulares mediante PCR digital de gotas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Aprende a cuantificar ARN circulares mediante PCR digital de gotas en células C2C12. Este método ofrece alta sensibilidad y precisión para detectar moléculas de baja abundancia sin necesidad de genes de referencia.

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Este trabajo fue apoyado por fondos intramuros del Instituto de Ciencias de la Vida, la beca de investigación DBT (BT / PR27622 / MED / 30/1961 / 2018) y la beca Wellcome Trust / DBT India Alliance [IA / I / 18/2 / 504017] otorgada a Amaresh C. Panda. Agradecemos a otros miembros del laboratorio por corregir el artículo.

El ARN es sensible a las RNasas; por lo tanto, todos los reactivos, instrumentos y espacios de trabajo deben estar libres de RNasa y manejarse con cuidado.
1. Diseño divergente del cebador para circRNA (ver Figura 1)
<ol><li>Recupere la secuencia madura de los datos de anotación de circRNA utilizando BEDTools o desde el navegador del genoma UCSC uniendo la secuencia de exón/intrón presente entre las coordenadas de unión del empalme posterior18,19.</li>
	<li>Preparar una secuencia de plantilla de PCR de 200 nucleótidos de longitud uniendo los últimos 100 nucleótidos de la longitud total de la secuencia de circRNA a los primeros 100 nucleótidos de la secuencia de circRNA10. NOTA: Si la longitud del circRNA es inferior a 200 nucleótidos, divídala en dos mitades iguales y una los nucleótidos desde la última mitad hasta el comienzo de la primera mitad.</li>
	<li>Utilice la secuencia de plantilla anterior para el diseño de imprimación utilizando la herramienta web Primer3 y estableciendo una longitud de producto de PCR que oscile entre 120 y 180 nucleótidos en longitud20.</li>
	<li>Utilice la configuración predeterminada de Primer3 para otros parámetros como Tm y longitud de imprimación. Las secuencias de cebadores para circBnc2 se enumeran en la Tabla 1.</li>
	<li>Ordene las secuencias de cebadores divergentes para la síntesis de cualquier compañía sintetizadora de oligo.</li>
</ol>2. Aislamiento de ARN
NOTA: Aísle el ARN total de las células C2C12 de ratón utilizando cualquier kit disponible comercialmente o un método interno de aislamiento de ARN. El método interno de aislamiento de ARN utilizado aquí ha sido descrito previamente21. Las perlas de sílice magnética se preparan en el laboratorio utilizando el protocolo22 previamente publicado. Estas perlas magnéticas también se pueden adquirir de varios proveedores.
<ol><li>Tome un plato de 10 cm que contenga aproximadamente 5 x 106 células de mioblastos C2C12 proliferantes y un miotubo C2C12 diferenciado de 4 días para el aislamiento de ARN.</li>
	<li>Lave las células con 10 ml de 1x PBS tres veces y deseche el PBS con una pipeta.</li>
	<li>Raspa las células en 1 ml de 1x PBS con un raspador celular, centrifugarlas a 4 °C durante 5 min a 750 x g y desechar el PBS con una pipeta.</li>
	<li>Añadir 1 mL de reactivo de aislamiento de ARN (RIR) y lisar las células mediante un pipeteo vigoroso21.</li>
	<li>Añadir 200 μL (1/5 del volumen de RIR) de cloroformo y vórtice durante 15 s. Centrifugar el tubo a 4 °C durante 10 min a 12.000 x g.</li>
	<li>Tome 400 μL de la capa acuosa superior, cárguelo en una columna de sílice y centrifugar durante 1 minuto a 12,000 x g a temperatura ambiente. Lleve el flujo a un tubo nuevo y agregue 600 μL de etanol al 100%.</li>
	<li>Añadir 20 μL de perlas magnéticas de sílice y colocar el tubo en un termomezclador ajustado a 25 °C y 1.200 rpm durante 5 min. NOTA: El volumen de la perla puede aumentar o disminuir dependiendo del número inicial de células tomadas para la lisis. Las perlas de sílice magnética se pueden adquirir de proveedores comerciales.</li>
	<li>Coloque el tubo en un soporte magnético durante 30 s o hasta que la solución se aclare. Deseche el sobrenadante con cuidado con una pipeta.</li>
	<li>Resuspender las perlas de sílice magnética en un tampón de lavado de 500 μL que contenga 90% de etanol. Coloque el tubo en el soporte magnético durante 30 s. Gire el tubo dos veces en el soporte magnético para lavar las perlas. Deje que las perlas se asienten hacia el imán y deseche el tampón con una pipeta.</li>
	<li>Repita el paso 2.9 dos veces. Después del lavado, gire brevemente el tubo y vuelva a colocarlo en el soporte magnético durante 30 s. Deseche el tampón de lavado restante. Secar al aire el tubo a 50 °C durante 3 minutos en un termomezclador, manteniendo la tapa abierta.</li>
	<li>Añadir 20 μL de agua libre de nucleasas y volver a suspender las perlas. NOTA: El volumen de elución de ARN se puede disminuir hasta 10 μL para aumentar la concentración de ARN.</li>
	<li>Coloque los tubos durante 2-3 min a temperatura ambiente. Vuelva a colocar el tubo en el soporte magnético y déjelo reposar durante 30 s. Recoja el ARN disuelto en un nuevo tubo para la evaluación de la cantidad y la calidad utilizando un espectrofotómetro. NOTA: El ARN se puede almacenar a -20 °C o -80 °C para su almacenamiento a largo plazo. Para obtener un resultado óptimo, se recomienda proceder con el paso de síntesis de ADNc al día siguiente.</li>
</ol>3. Síntesis de ADNc
<ol><li>Mida la concentración de ARN usando un espectrofotómetro y tome 1 μg de ARN para la síntesis de ADNc.</li>
	<li>Mezcle 1 μg de ARN total con 1 μL de mezcla de dNTP (10 mM de dATP, dTTP, dGTP y dCTP), 4 μL de tampón 5x de transcriptasa inversa (RT), 2 μL de cebador aleatorio RT 10x, 0.25 μL de enzima transcriptasa inversa (200 U/μL) y 0.5 μL de inhibidor de RNasa (40 U/μL), y enrasar el volumen hasta 20 μL usando agua libre de nucleasas. NOTA: El volumen de la enzima transcriptasa inversa puede alterarse dependiendo de la concentración inicial de ARN tomada para la síntesis de ADNc.</li>
	<li>Golpee el tubo para mezclar la reacción y gire brevemente. Colocar el tubo a 25 °C durante 10 min seguido de a 50 °C durante 1 h.</li>
	<li>Para inactivar la enzima, coloque el tubo a 85 °C durante 5 min.</li>
	<li>Enfríe el tubo con hielo durante 2 minutos y agregue 480 μL de agua libre de nucleasas al tubo para que la concentración de ADNc sea de 2 ng / μL. NOTA: El ADNc puede almacenarse a -20 °C o utilizarse inmediatamente para el análisis de dd-PCR.</li>
</ol>4. Flujo de trabajo de PCR digital de gotas (dd-PCR)
NOTA: El flujo de trabajo de dd-PCR implica varios pasos, comenzando desde la preparación de la muestra, seguido de la generación de gotas, la amplificación por PCR, el conteo de gotas y el análisis de datos. Cada paso es crucial para la generación precisa de datos, ya que la dd-PCR implica la cuantificación absoluta de los productos y no necesita ninguna curva estándar. Por lo tanto, cada uno de los diferentes pasos de dd-PCR se ha descrito a continuación.
<ol><li>Preparación de la reacción dd-PCR.<ol><li>Configure la reacción de PCR de 22 μL en tubos o tiras de PCR de 0,2 ml junto con un tubo de control negativo y tubos NTC (control sin plantilla). NOTA: Cada par de cebadores divergentes diferentes para la detección de diferentes circRNAs debe tener una reacción NTC junto con muestras de prueba.</li>
		<li>Agregue 11 μL de dd-PCR master-mix (por ejemplo, EvaGreen Supermix) y 11 μL de agua libre de nucleasas para configurar el tubo de reacción de control negativo. NOTA: Descongele la mezcla maestra dd-PCR a temperatura ambiente seguida de un breve vórtice para formar una mezcla homogénea. Use la misma agua libre de nucleasa para configurar el tubo de reacción de control negativo y los tubos NTC que se usaron para diluir el ADNc.</li>
		<li>Agregue 11 μL de mezcla maestra dd-PCR, 5.5 μL de mezcla de cebador directo e inverso específica de circRNA de concentración de 1 μM y 5.5 μL de agua libre de nucleasas para configurar los tubos de reacción NTC. NOTA: Diluir los cebadores divergentes circulares específicos de ARN hacia adelante y hacia atrás de 100 μM y mezclar para preparar una concentración de trabajo de 1 μM de mezcla de cebador circRNA directo e inverso; por lo tanto, la concentración final del cebador es de 250 nM en la reacción de 22 μL.</li>
		<li>Añadir 11 μL de mezcla maestra dd-PCR, 5,5 μL de mezcla de cebador directo e inverso específica de circRNA de concentración de 1 μM y 5,5 μL de ADNc (2 ng/μL) para configurar los tubos de reacción de prueba.</li>
		<li>Vórtice seguido minuciosamente por centrifugar brevemente todos los tubos de reacción para obtener una mezcla de reacción homogénea en la parte inferior de los tubos.</li>
	</ol></li>
	<li>Generación de gotas.<ol><li>Transfiera los 20 μL de mezcla de PCR de tubos de PCR de 0,2 ml a los pocillos de muestra del cartucho generador de gotas.</li>
		<li>Agregue 70 μL de aceite de generación de gotas a los pocillos de petróleo del cartucho generador de gotas con cuidado utilizando una pipeta multicanal. NOTA: Incubar el aceite de generación de gotas a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de usarlo.</li>
		<li>Cubra el cartucho del generador de gotas con la junta de goma y colóquelo en la máquina generadora de gotas para obtener la mezcla de gotas de muestra y aceite, generada en los pocillos de gotas del cartucho.</li>
	</ol></li>
	<li>Amplificación por PCR.<ol><li>Transfiera 40 μL de la mezcla de gotas de aceite de muestra de los pocillos de gotas del cartucho generador de gotas a una placa de PCR de 96 pocillos utilizando una pipeta multicanal. NOTA: Transfiera cuidadosamente la mezcla de gotas de aceite de muestra mientras hace un ángulo a los pocillos a través de las puntas de la pipeta multicanal para evitar romper las gotas mientras las transfiere a la placa dd-PCR de 96 pocillos.</li>
		<li>Selle la placa de PCR de 96 pocillos con el sellador de papel de aluminio, colóquela en el bloque de la máquina selladora de placas precalentado a 80 ° C y haga clic en el sello para sellar la placa de PCR.</li>
		<li>Ahora, coloque la placa en el termociclador dd-PCR y configure el programa como se menciona en la Tabla 2 con la temperatura de la tapa establecida en 105 ° C y una velocidad de rampa de 2 ° C / s.</li>
	</ol></li>
	<li>Conteo de gotas.<ol><li>Una vez finalizada la PCR, coloque la placa en la máquina contadora de gotas dd-PCR con el soporte de la placa en la posición correcta para contar las gotas.</li>
		<li>Abra el software de análisis de gotas y configure la ejecución proporcionando información de la muestra.</li>
		<li>Haga clic en la opción de configuración. Luego, haga clic en la opción de plantilla para abrir una nueva plantilla .</li>
		<li>Defina cada pocillo poniendo los detalles del experimento, como el nombre de la muestra (cDNA utilizado o control negativo o NTC), el nombre del objetivo (nombre del cebador circRNA) y el tipo (desconocido), y el tipo de experimento como ABS (cuantificación absoluta) y Supermix (dd-PCR EvaGreen Supermix) utilizado, etc.</li>
		<li>Finalmente, guarde la plantilla e inicie la ejecución haciendo clic en la opción ejecutar y seleccione contar por fila o columna. Permita que la máquina complete el conteo de gotas, que toma aproximadamente 1 minuto / pozo.</li>
		<li>Haga clic en el botón Analizar para analizar los datos después de completar la lectura de gotas.</li>
		<li>Haga clic en el botón Amplitud 1D para ver las gotas positivas y negativas</li>
		<li>Para separar las gotas positivas de las negativas, coloque una línea de umbral común para todas las muestras con el mismo objetivo. NOTA: Las gotitas totales en cada muestra deben ser superiores a 10.000 para ser consideradas para la cuantificación absoluta. El NTC no debe mostrar recuentos positivos de gotas. La presencia de gotitas positivas en el NTC indica contaminación de los reactivos o amplificación de los dímeros de cebador. Es difícil averiguar si las gotas positivas tienen dímeros de imprimación o productos no específicos en NTC. Se recomienda comprobar los cebadores y evitar cualquier contaminación de los reactivos como práctica general para cualquier PCR, incluida la dd-PCR.</li>
		<li>Haga clic en el botón Exportar para exportar los datos de los recuentos de circRNA como un archivo .csv. Los datos exportados muestran el número de circRNAs presentes en cada muestra.</li>
		<li>Calcule manualmente el número de circRNAs en cada muestra por nanogramo de ARN considerando la cantidad total de ADNc utilizada en cada reacción.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

La investigación de CircRNA ha crecido en la última década con el descubrimiento de tecnologías de secuenciación de alto rendimiento. Como resultado, se ha considerado una molécula potencial para futuras terapias de ARN. Además, se sabe que actúa como biomarcador en varias enfermedades, incluyendo cáncer y enfermedades cardiovasculares 4,8. Sin embargo, la identificación del circRNA es complicada debido a su baja abundancia y a que solo tiene una secuencia especí...

Los avances recientes en las tecnologías de secuenciación de ARN y los nuevos algoritmos computacionales han descubierto un nuevo miembro de la creciente familia de ARN no codificantes, llamado ARN circular (circRNA)1. Como su nombre indica, los circRNAs son una familia de moléculas de ARN monocatenario sin extremos libres. Están formados por empalme no canónico de cabeza a cola llamado empalme posterior, donde el sitio aceptor de empalme aguas arriba se une covalentemente con el sitio donante de empalme aguas abajo para formar un círculo de ARN estable 1,2. Este proceso podría estar mediado por varios factores, incluyendo elementos repetitivos de Alu invertidos presentes en las aguas arriba y aguas abajo de los exones circularizados, o puede estar mediado por algunos factores de empalme o proteínas de unión a ARN (RBPs)2,3. Los ARN circulares generados exclusivamente a partir de la secuencia exónica o intrónica se clasifican como circARN exónicos y ARN intrónicos circulares o ci-ARN, mientras que algunos circARN exónicos retienen el intrón y se denominan circARN exón-intrón (EIcircRNAs)3,4. Las funciones de los circRNAs son multifacéticas, incluyendo la esponja de miRNA y/o RBP, la regulación de la transcripción y la regulación de la función celular traduciendo en péptidos 3,5,6,7. Varios relatos han destacado la importancia de los circRNAs en diversas enfermedades y procesos fisiológicos8. Además, los patrones de expresión específicos del tejido y la resistencia a la digestión de la exonucleasa lo convierten en un biomarcador funcional para el diagnóstico de enfermedades y también puede ser utilizado como una diana terapéutica adecuada8. Teniendo en cuenta su importancia en la regulación de la salud y las enfermedades, la cuantificación precisa de la expresión de circRNA es la necesidad del momento.
Se han desarrollado varios métodos bioquímicos para cuantificar circRNAs en muestras biológicas9. Uno de los métodos más convenientes y ampliamente aceptados para la cuantificación de circRNA es la transcripción inversa seguida de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (RT-qPCR) utilizando pares de cebadores divergentes10. Sin embargo, la mayoría de los circRNAs están en baja abundancia en comparación con los mRNAs lineales, lo que hace que sea difícil cuantificarlos11. Para superar este problema, buscamos usar PCR digital de gotas (dd-PCR) para cuantificar el número de circRNAs en una muestra dada con precisión. La dd-PCR es una tecnología avanzada de PCR que sigue el principio de microfluídica; genera múltiples gotitas acuosas en aceite, y la PCR ocurre en cada gota como una reacción individual12. La reacción ocurre en gotitas individuales y se analiza utilizando un lector de gotas, que da el número de gotitas positivas o negativas para el gen de interés12. Es la técnica más sensible para cuantificar con precisión un gen de interés, incluso si solo hay una copia única en una muestra determinada. La disminución de la sensibilidad hacia los inhibidores, una mejor precisión y la omisión del gen de referencia para la cuantificación lo hacen más ventajoso que la qPCR convencional13,14,15. Ha sido ampliamente utilizado como herramienta de investigación y diagnóstico para la cuantificación absoluta de un gen de interés16,17. Aquí, describimos el protocolo detallado de dd-PCR para la cuantificación de circRNA en la diferenciación de miotubos C2C12 de ratón y mioblastos C2C12 de ratón proliferantes utilizando cebadores divergentes.

<table><tbody><tr><td>Tubo de microcentifuge de 1,5 ml</td><td>Tarson</td><td>500010</td><td></td></tr><tr><td>Tiras de tubo de 0,2 ml con tapón</td><td>Tarson</td><td>610020, 510073</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de filtro</td><td>Tarson</td><td>528104</td><td></td></tr><tr><td>Agua destilada sin DNasa/RNasa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10977023</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Cell raspador</td><td>HiMedia</td><td>TCP223</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>SRL</td><td>96764</td><td></td></tr><tr><td>Diluyente de ADN</td><td>HiMedia</td><td>MB228</td><td></td></tr><tr><td>Imprimadores aleatorios</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>48190011</td><td></td></tr><tr><td>set dNTP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0181</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de RNasa murino</td><td>NEB</td><td>M0314S</td><td></td></tr><tr><td>Maxima reverse transcriptasa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EP0743</td><td></td></tr><tr><td>QX200 dd-PCR Evagreen Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1864033</td><td></td></tr><tr><td>Aceite de generación de gotas para Evagreen</td><td>Bio-Rad</td><td>1864006</td><td></td></tr><tr><td>PCR Placa Heat Seal, lámina, perforable</td><td>Cartuchos y juntas Bio-Rad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>DG8</td> Cartucho <td>Bio-Rad</td><td>1864007</td><td></td></tr><tr><td>DG8 soporte</td><td>Bio-Rad</td><td>1863051</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Generador de gotas</td><td>Bio-Rad</td><td>1864002</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Placas de 96 pocillos</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>PX1 Sellador de placas PCR</td><td>Bio-Rad</td><td>1814000</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Termociclador táctil con 96&ndash; Módulo de reacción de pozo profundo</td><td>Bio-Rad</td><td>1851197</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Lector de gotas</td><td>Bio-Rad</td><td>1864003</td><td></td></tr><tr><td>Quantasoft Software</td><td>Bio-Rad</td><td>1864011</td><td></td></tr><tr><td>Columna de sílice</td><td>Paraguas de Ciencias de la Vida</td><td>38220090</td><td></td></tr><tr><td>UCSC Navegador</td><td></td> del genoma <td>https://genome.ucsc.edu/</td><td></td></tr> <tr><td>Primer 3</td><td></td><td></td><td></td>https://primer3.ut.ee/</tr></tbody></table>

cuantificación de arn circulares mediante pcr digital de gotas

Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

La reacción en cadena de la polimerasa digital (dd-PCR) es uno de los métodos de cuantificación más sensibles; fracciona la reacción en casi 20,000 gotas de agua en aceite, y la PCR ocurre en las gotas individuales. La dd-PCR tiene varias ventajas sobre la qPCR convencional en tiempo real, incluida una mayor precisión en la detección de objetivos de baja abundancia, la omisión de genes de referencia para la cuantificación, la eliminación de réplicas técnicas para muestras y la demostración de una alta resistencia a los inhibidores en las muestras. Recientemente, la dd-PCR se ha convertido en uno de los métodos más populares para cuantificar con precisión el ADN o ARN objetivo para el análisis y diagnóstico de la expresión génica. Los ARN circulares (circRNAs) son una gran familia de moléculas de ARN cerradas covalentemente recientemente descubiertas que carecen de extremos 5' y 3'. Se ha demostrado que regulan la expresión génica actuando como esponjas para proteínas de unión a ARN y microARN. Además, los circRNAs se secretan en los fluidos corporales, y su resistencia a las exonucleasas los hace servir como biomarcadores para el diagnóstico de enfermedades. Este artículo tiene como objetivo mostrar cómo realizar el diseño divergente de cebadores, la extracción de ARN, la síntesis de ADNc y el análisis de dd-PCR para cuantificar con precisión los niveles específicos de ARN circular (circRNA) en las células. En conclusión, demostramos la cuantificación precisa de circRNAs utilizando dd-PCR.

El número absoluto de circRNAs en cada muestra se puede derivar de los datos de dd-PCR exportados. El análisis cuantitativo de PCR en tiempo real sugirió la expresión diferencial de circBnc2 en los miotubos C2C12 diferenciados (datos no mostrados). Aquí, queríamos verificar el número de copias absolutas de circBnc2 en mioblastos y miotubos C2C12 en proliferación. Dado que la expresión de circBnc2 se compara en dos condiciones, es realmente importante procesar todas las muestras para el aislamie...

Este protocolo describe el método detallado de PCR digital de gotas (dd-PCR) para la cuantificación precisa de los niveles de ARN circular (circRNA) en células utilizando cebadores divergentes.

Cuantificación de ARN circulares mediante PCR digital de gotas

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...

dd-PCR es un método altamente sensible y preciso para la cuantificación absoluta de ADN o ARN diana. Se ha utilizado para el diagnóstico de enfermedades donde otros métodos convencionales no dan resultados precisos. dd-PCR es la técnica más sensible para detectar moléculas de ácido nucleico muy poco abundantes.A diferencia de la PCR cuantitativa, la dd-PCR no requiere ningún control genético de limpieza para la cuantificación. Debido a su sensibilidad y precisión, la dd-PCR se puede utilizar como una herramienta para el diagnóstico molecular y la investigación que involucra moléculas de ARN poco abundantes como micro ARN y ARN circulares. Antes de usar dd-PCR, se debe realizar RT-PCR o RT-qPCR para confirmar que los cebadores están amplificando sus genes diana sin ninguna amplificación de PCR no específica.Para comenzar, prepare una secuencia de plantilla de PCR de 200 nucleótidos de longitud uniendo los últimos 100 nucleótidos de la longitud total de la secuencia circular de ARN a los primeros 100 nucleótidos de la secuencia circular de ARN. Utilice la secuencia de plantillas para primer, diseñada por la herramienta web Primer 3. Tome un plato de 10 centímetros que contenga aproxi

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este video, presentamos un procedimiento paso a paso para generar nano-gotas emulsionadas para detectar ácidos nucleicos objetivo mediante la reacción en cadena de la polimerasa digital o dPCR.

Reacción en cadena de la polimerasa digital en gotasas: un método para generar reacciones de PCR con nanogotas para detectar mutaciones tumorales raras

Describimos un ensayo digital de punto final para cuantificar ácidos nucleicos con una lectura simplificada (analógica). Medimos la fluorescencia masiva de ensayos digitales basados en gotas utilizando una máquina de qPCR estándar en lugar de instrumentación especializada y confirmamos nuestros resultados mediante microscopía.

Lectura granel simple de Digital ácidos nucleicos Cuantificación ensayos

Se describe un método sensible y preciso para la cuantificación de microRNAs libres de células utilizando una química basada en colorantes y tecnología de PCR digital en gotas.

Que circula MicroARN Cuantificación Usando ADN vinculante tinte Química y gotita de PCR digital

MicroRNAs circulación han demostrado promesa como biomarcadores para enfermedades cardiovasculares y los infartos agudos de miocardio. En este estudio, se describe un protocolo para la extracción de miRNA, transcripción inversa y PCR digital para la cuantificación absoluta de miRNAs en el suero de pacientes con enfermedad cardiovascular.

Digital PCR para cuantificar la circulación MicroRNAs en infarto agudo de miocardio y enfermedades cardiovasculares

Aquí, presentamos un protocolo para detectar mutaciones somáticas tumorales en el ADN circulante presente en fluidos biológicos del paciente (biofluidos). Nuestro método basado en la reacción en cadena de la polimerasa digital de gotas (dPCR) permite cuantificar la frecuencia alélica de la mutación tumoral (MAF), facilitando un complemento mínimamente invasivo para el diagnóstico y el monitoreo temporal de la respuesta tumoral.

Detección y seguimiento del ADN circulante asociado a tumores en biofluidos del paciente

Los ARN circulares (arnar) son ARN no codificantes que pueden tener funciones en la regulación transcripcional y en las interacciones mediantantes entre proteínas. Tras la evaluación de los diferentes parámetros para la construcción de bibliotecas de secuenciación de circRNA, se compiló un protocolo utilizando la preparación total de la biblioteca de ARN varada con el pretratamiento RNase R y se presenta aquí.

Identificación de ARN circulares mediante secuenciación de ARN

Este trabajo resume los pasos para desarrollar diferentes ensayos para la detección del SARS-CoV-2 utilizando un sistema ddPCR de dos colores. Los pasos son elaborados y se han incluido notas sobre cómo mejorar los ensayos y el rendimiento del experimento. Estos ensayos se pueden utilizar para múltiples aplicaciones RT-ddPCR del SARS-CoV-2.

Protocolos de PCR digital de gotas con transcripción inversa de dos pasos para la detección y cuantificación del SARS-CoV-2

Aquí presentamos un protocolo para medir el número absoluto de copias de ADN mitocondrial (mt) y los niveles de heteroplasmia de deleción de ADNmt en células individuales.

Medición del número de copias de ADN mitocondrial unicelular y la heteroplasmia mediante la reacción en cadena de la polimerasa de gotitas digitales

La cuantificación precisa de las copias del genoma del vector de virus adenoasociados (AAV) es fundamental, pero aún no se ha establecido un protocolo estandarizado. Este protocolo describe un método validado para preparar muestras purificadas de AAV y realizar una reacción en cadena de la polimerasa (dd_PCR) digital para cuantificar de forma fiable el título del genoma viral.

Cuantificación de genomas virales adenoasociados en muestras de vectores purificadas mediante reacción en cadena de la polimerasa por gotas digitales

Este estudio presenta un método robusto para aislar ARNm axonales utilizando inserciones de membrana porosas, permitiendo la separación total de neuronas frente a neuritas y la purificación de ARN. Combinado con RTddPCR, el enfoque permite la cuantificación absoluta de transcritos de baja copia, facilitando estudios sobre el transporte de ARNm y la traducción local con alta sensibilidad, reproducibilidad y amplia aplicabilidad experimental.

Aislamiento y cuantificación de ARNm axonales mediante inserciones porosas de membrana y RTddPCR

Aprende a cuantificar ARN circulares mediante PCR digital de gotas en células C2C12. Este método ofrece alta sensibilidad y precisión para detectar moléculas de baja abundancia sin necesidad de genes de referencia.

Cuantificación de ARN circulares mediante PCR digital de gotas

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