Cuantificación de ARN circulares mediante PCR digital de gotas

dd-PCR es un método altamente sensible y preciso para la cuantificación absoluta de ADN o ARN diana. Se ha utilizado para el diagnóstico de enfermedades donde otros métodos convencionales no dan resultados precisos. dd-PCR es la técnica más sensible para detectar moléculas de ácido nucleico muy poco abundantes.

A diferencia de la PCR cuantitativa, la dd-PCR no requiere ningún control genético de limpieza para la cuantificación. Debido a su sensibilidad y precisión, la dd-PCR se puede utilizar como una herramienta para el diagnóstico molecular y la investigación que involucra moléculas de ARN poco abundantes como micro ARN y ARN circulares. Antes de usar dd-PCR, se debe realizar RT-PCR o RT-qPCR para confirmar que los cebadores están amplificando sus genes diana sin ninguna amplificación de PCR no específica.

Para comenzar, prepare una secuencia de plantilla de PCR de 200 nucleótidos de longitud uniendo los últimos 100 nucleótidos de la longitud total de la secuencia circular de ARN a los primeros 100 nucleótidos de la secuencia circular de ARN. Utilice la secuencia de plantillas para primer, diseñada por la herramienta web Primer 3. Tome un plato de 10 centímetros que contenga aproximadamente 5 millones de células de mioblastos C2C12 proliferantes y un miotubo C2C12 diferenciado de cuatro días para el aislamiento de ARN.

Lave las células con 10 mililitros de 1X PBS tres veces y deseche el PBS con una pipeta. Agregue un mililitro de reactivo de aislamiento de ARN y lisar las células mediante un pipeteo vigoroso. Luego, agregue 200 microlitros de cloroformo y vórtice durante 15 segundos.

Centrifugar el tubo a cuatro grados centígrados durante 10 minutos a 12, 000 G.Tome 400 microlitros de la capa acuosa superior, cárguelo en una columna de sílice y centrifugar durante un minuto a 12, 000 G a temperatura ambiente. Lleve el flujo a un nuevo tubo y agregue 600 microlitros de etanol al 100%. Agregue 20 microlitros de perlas de sílice magnética y coloque el tubo en un termomezclador, ajustado a 25 grados centígrados y 1, 200 RPM durante cinco minutos.

Luego, coloque el tubo en un soporte magnético durante 30 segundos o hasta que la solución se aclare. Resuspenda las perlas de sílice magnéticas en 500 microlitros de tampón de lavado que contiene 90% de etanol. Después de colocar el tubo en el soporte magnético durante 30 segundos, deje que las perlas se asienten hacia el imán y deseche el tampón con una pipeta.

Seque el tubo al aire a 50 grados centígrados durante tres minutos en un termomezclador, manteniendo la tapa abierta. Agregue 20 microlitros de agua libre de nucleasas y resuspenda las perlas. Recoja el ARN disuelto en un nuevo tubo para la evaluación de la cantidad y la calidad utilizando un espectrofotómetro.

Mida la concentración de ARN usando un espectrofotómetro y tome un microgramo de ARN para la síntesis de ADNc. Mezcle un microgramo de ARN total con un microlitro de mezcla dNTP, cuatro microlitros de tampón de transcriptasa inversa 5X, dos microlitros de cebador aleatorio de transcriptasa inversa 10X, 0.25 microlitros de enzima transcriptasa inversa y 0.5 microlitros de inhibidor de RNasa. Enrasar el volumen a 20 microlitros con agua libre de nucleasas.

Coloque el tubo a 25 grados centígrados durante 10 minutos, seguido de 50 grados centígrados durante una hora. Luego coloque el tubo a 85 grados centígrados durante cinco minutos para inactivar la enzima. Configure la reacción de PCR de 22 microlitros en tubos o tiras de PCR de 0,2 mililitros, junto con un tubo de control negativo y tubos de control sin plantilla.

Agregue 11 microlitros de mezcla maestra dd-PCR, 5.5 microlitros de mezcla circular de cebador directo e inverso específica de ARN de una concentración micromolar y 5.5 microlitros de agua libre de nucleasas para configurar los tubos de reacción NTC. Del mismo modo, para configurar los tubos de reacción de prueba, agregue 11 microlitros de mezcla maestra dd-PCR, 5.5 microlitros de mezcla de cebador directo e inverso específica de ARN circular de una concentración micromolar y 5.5 microlitros de ADNc. Para la generación de gotas, transfiera 20 microlitros de la mezcla de PCR de tubos de PCR de 0,2 mililitros a los pocillos de muestra del cartucho generador de gotas.

Agregue 70 microlitros de aceite de generación de gotas a los pozos de petróleo del cartucho generador de gotas con cuidado, usando una pipeta. Cubra el cartucho generador de gotas con una junta de goma y colóquelo en la máquina generadora de gotas para obtener la mezcla de gotas de aceite de muestra, generada en los pocillos de gotas del cartucho. Para la amplificación por PCR, transfiera 40 microlitros de la mezcla de gotas de aceite de muestra de los pocillos de gotas del cartucho generador de gotas a una placa de PCR de 96 pocillos utilizando una pipeta.

Selle la placa de PCR de 96 pocillos con el sellador de papel de aluminio. Colóquelo en el bloque de la máquina selladora de placas, precalentado a 180 grados centígrados, y haga clic en el sello para sellar la placa de PCR. Luego, coloque la placa en el termociclador dd-PCR y ajuste la temperatura de la tapa a 105 grados centígrados y una velocidad de rampa a dos grados centígrados por segundo.

Una vez finalizada la PCR, coloque la placa en la máquina contadora de gotas dd-PCR con el soporte de la placa en la posición correcta para contar las gotas. Abra el software de análisis de gotas y configure la ejecución ingresando la información de la muestra. Haga clic en el botón analizar para analizar los datos después de completar la lectura de gotas.

Luego, haga clic en el botón Amplitud 1D para ver las gotas positivas y negativas. Para separar las gotas positivas de las negativas, coloque una línea de umbral común para todas las muestras con el mismo objetivo. Haga clic en el botón de exportación para exportar los datos de recuentos circulares de ARN como un archivo csv.

Los datos exportados muestran el número de ARN circulares presentes en cada muestra. Calcule manualmente el número de ARN circulares en cada muestra por nanogramo de ARN considerando la cantidad total de ADNc utilizado en cada reacción. El análisis de datos utilizando el software QuantaSoft se muestra aquí.

Todas las muestras, excepto MT1, mostraron más de 12, 000 recuentos de gotas. Dado que el recuento total de gotitas fue bajo en MT1, esta muestra no se consideró para el análisis final de los datos. Curiosamente, hubo una clara diferencia en el patrón de expresión de Circ B y C2 en la condición de miotubo diferenciada de cuatro días en comparación con las células de mioblastos.

El análisis de la abundancia de Circ B y C2 en términos de número de copias, indicó que las tres réplicas de mioblastos C2C12 tenían 76.8, 67 y 46 copias por nanogramo de ARN, mientras que las dos muestras de miotubos tenían 558 y 610 copias por nanogramo de ARN. Los datos en el gráfico de barras representan la media más menos la desviación estándar de dos a tres réplicas biológicas. ddPCR es uno de los métodos más avanzados para medir la expresión diferencial precisa del ARN circular objetivo.

Este método será una herramienta esencial para acelerar la investigación circular de ARN y las industrias de diagnóstico en el próximo año.