Colección de exudados de raíz de alfalfa para estudiar el impacto del ftalato de di (2-etilhexilo) en la producción de metabolitos
2 de junio de 2023
La secreción de exudados radiculares suele ser una estrategia de desintoxicación externa para las plantas en condiciones de estrés. Este protocolo describe cómo evaluar el impacto de los xenobióticos en la alfalfa a través del análisis metabolómico no dirigido.
Este protocolo describe cómo evaluar el impacto de los xenobióticos en la alfalfa mientras se realiza un análisis metabolómico no dirigido. La técnica es muy simple y conveniente para la operación y se pueden identificar más tipos de exudados de raíz. Lo que ayuda a construir la huella metabolómica de los exudados de la raíz de la planta.
Comience la esterilización de las semillas de medicago sativa o alfalfa enjuagando las semillas con hipoclorito de sodio al 0,1% durante 10 minutos. Seguido de un lavado con alcohol etílico al 75% durante 30 minutos. A continuación, enjuague las semillas esterilizadas varias veces con agua destilada.
Y luego germinarlos en el papel de filtro húmedo colocado en una placa de Petri estéril. A 30 grados centígrados en la oscuridad. Después de la germinación, transfiera 20 semillas grandes y regordetas germinadas uniformemente a una canasta de injerto en una botella de cultivo llena de solución nutritiva.
Colocar todas las botellas de cultivo en una cámara de crecimiento con condiciones controladas. Después de dos semanas, transfiera 15 plántulas de alfalfa uniformes a una nueva botella de vidrio para exponerlas a un miligramo por kilogramo y 10 miligramos por kilogramo de estrés DEHP para el experimento de cultivo. Envuelva las botellas de vidrio de tratamiento y control con papel de aluminio y parafilm para evitar la fotólisis y volatilización del DEHP.
Complemente la solución nutritiva diariamente para mantener el nivel de líquido. Coloque y gire aleatoriamente las botellas cada dos días para garantizar condiciones de crecimiento consistentes para las plántulas de alfalfa. Después de siete días de cultivo, retire las plántulas de alfalfa de las botellas.
Y lávelos con agua ultrapura varias veces para prepararlos para la recolección de exudados de raíces. Comience el experimento de recolección de exudado de raíz transfiriendo 10 plántulas de alfalfa uniformes a tubos de centrifugación llenos de 50 mililitros de agua desionizada esterilizada. Para recoger los exudados de la raíz, mantenga los tubos en posición vertical durante seis horas con las raíces sumergidas en agua.
Una vez hecho esto, envuelva los tubos de centrífuga con papel de aluminio para proteger las raíces de la luz. Retire las plantas y liofilique el líquido recogido para el perfil de metabolitos. Proceda con el experimento de extracción agregando 1.8 mililitros de solución de extracción a las muestras liofilizadas.
En vórtice durante 30 segundos. A continuación, aplique las ondas de ultrasonido a los tubos durante 10 minutos en un baño de agua helada. Antes de centrifugar las muestras.
Transfiera cuidadosamente 200 microlitros de sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Aspire 45 microlitros de sobrenadante del tubo de centrífuga y mézclelo en muestras de control de calidad o control de calidad a un volumen final de 270 microlitros. Una vez hecho esto, liofilizar los extractos en un concentrador de vacío.
Una vez que se complete el secado, agregue cinco microlitros de ribonucleasa estándar interna y continúe secando. Después de la evaporación, agregue 30 microlitros de solución de clorhidrato de metoxiaminación e incube los tubos a 80 grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, agregue 40 microlitros de reactivo BSTFA a las muestras antes de colocar los tubos a 70 grados centígrados durante 1,5 horas para la derivatización.
Una vez finalizada la incubación y la muestra derivatizada alcance la temperatura ambiente, añadir cinco microlitros de ésteres metílicos de ácidos grasos disueltos en cloroformo a las muestras derivatizadas. Usando una columna capilar que mide 30 metros por 250 micrómetros por 0.25 micrómetros, separe un microlitro de los exudados de la raíz con un gas portador helio a una velocidad de flujo de 1.0 mililitros por minuto. Ajuste la temperatura de inyección a 280 grados centígrados.
Y mantenga la temperatura de la línea de transferencia a 280 grados centígrados. Ajuste el programa del horno para la separación. Después de separar los extractos, realice espectrometría de masas en modo de colisión de electrones con una energía de menos 70 electronvoltios.
Mantenga la temperatura de la fuente de iones a 250 grados centígrados. Obtenga espectros de masas utilizando el modo de monitoreo de escaneo completo con un rango de escaneo de masa de 50 a 500 masa por carga a una velocidad de 12.5 espectros por segundo. Se detectaron 778 picos en el cromatógrafo de la muestra de control.
De los cuales se identificaron 314 metabolitos según los espectros de masas. Los ácidos se subdividieron en ácidos grasos, aminoácidos, ácidos orgánicos y ácidos fenólicos. Además, algunas sustancias comunes generalmente presentes en los exudados de la raíz también se detectaron en los exudados de la raíz de alfalfa, incluyendo pirimidinas, hidroxipirimidinas, flavonoides, fenoles, cetonas, pirimidinas y diterpenos.
Se trazó un mapa de calor basado en la puntuación VIP para visualizar la variación en los metabolitos diferenciales entre los diferentes tratamientos con DEHP. En comparación con las muestras de control, la exposición al DEHP cambió significativamente el contenido de 50 metabolitos y exudados de raíz de alfalfa. Principalmente incluyendo algunos carbohidratos y ácidos orgánicos de bajo peso molecular.
El análisis de las vías metabólicas mostró que el DEHP inhibió significativamente el metabolismo de los carbohidratos que son el producto de la fotosíntesis, lo que indica que el DEHP puede suprimir la fotosíntesis de la alfalfa hasta cierto punto, se observó que el DEHP promueve el metabolismo de los ácidos grasos que ayudan a resistir el estrés del DEHP. Al menos los exudados de la raíz de la semilla deben realizarse para cada tratamiento para garantizar un análisis preciso de los datos metabolómicos. Podemos determinar el metabolismo diferencial e investigar más a fondo las reglas importantes en el comportamiento ambiental de los contaminantes.
Las interacciones entre las plantas y la comunidad biológica de campo más amplia se pueden descifrar principalmente mediante el uso de este método.
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Resumen
Este protocolo describe un método para evaluar el impacto de los xenobióticos en la alfalfa mediante análisis metabolómico sin objetivos específicos. Destaca la importancia de los exudados radiculares como estrategia de desintoxicación en plantas bajo condiciones de estrés.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología Vegetal
- Metabolómica
- Respuestas al Estrés Ambiental
Antecedentes
- Los exudados radiculares desempeñan un papel crucial en las interacciones de las plantas con su entorno.
- Los xenobióticos pueden afectar la salud y el metabolismo de las plantas.
- La metabolómica no dirigida permite un perfilado completo de los metabolitos.
- Comprender estas interacciones puede orientar las prácticas agrícolas.
Objetivo del estudio
- Evaluar los efectos de los xenobióticos en la alfalfa.
- Identificar diversos tipos de exudados radiculares.
- Construir una huella metabolómica de los exudados radiculares de las plantas.
Métodos Utilizados
- Sterilización de semillas de alfalfa utilizando hipoclorito de sodio y alcohol etílico.
- Lavado de las semillas con agua destilada tras la esterilización.
- Aplicación de técnicas de análisis metabolómico no dirigido.
- Identificación de metabolitos en los exudados radiculares.
Resultados principales
- Identificación exitosa de diversos exudados radiculares.
- Conocimientos sobre los mecanismos de detoxificación de la alfalfa.
- Establecimiento de un perfil metabolómico para investigaciones futuras.
- Demuestra la eficacia del método para evaluar las respuestas de las plantas a los xenobióticos.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un método confiable para estudiar las respuestas de las plantas a factores de estrés ambientales.
- Los exudados radiculares son vitales para comprender la salud de las plantas bajo estrés.
- Este enfoque puede aplicarse a otras especies vegetales para obtener conocimientos más amplios.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El perfilado metabolómico no dirigido de exudados radiculares de alfalfa bajo estrés por DEHP permite reducir mecanísticamente los riesgos de las interacciones planta-ambiente, relevantes para las líneas de biotecnología agroquímica y ambiental. El análisis cuantitativo de metabolitos diferenciales respalda la confianza predictiva en las vías de respuesta al estrés, aportando información para el descubrimiento temprano y la investigación traslacional sobre el impacto de xenobióticos. Este flujo de trabajo sitúa a la metabolómica de exudados radiculares como una capacidad reutilizable para la evaluación general del portafolio de estrategias de resiliencia y detoxificación vegetal.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar las vías de detoxificación vegetal en respuesta a la exposición a xenobióticos.
- Apoya la validación funcional de los cambios metabólicos inducidos por estrés en la interfaz raíz-suelo.
- Facilita una confianza predictiva en la identificación de metabolitos y vías clave para estudios posteriores.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Prepara perfiles metabolómicos validados para análisis comparativos posteriores.
- Normaliza la recolección de exudados radiculares y la medición mediante GC-TOF-MS para garantizar la reproducibilidad.
- Genera resultados cuantitativos adecuados para el cribado de alto rendimiento de factores de estrés ambientales.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relaciona los cambios en metabolitos con el descubrimiento de biomarcadores ambientales para lograr continuidad traslacional.
- Permite el avance ajustado al riesgo de estrategias candidatas para la mitigación del estrés.
- Proporciona información mecanicista sobre las interacciones planta-ambiente relevantes para la agricultura sostenible.
Integración de la Canalización y Flujo de Trabajo
Este método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la prueba inicial de hipótesis sobre las respuestas al estrés en plantas hasta la identificación de biomarcadores metabólicos y la validación preclínica de mecanismos de desintoxicación.
- Biología del Descubrimiento: Apoya el análisis basado en hipótesis de la composición de los exudados radiculares bajo estrés xenobiótico definido.
- Selección: Proporciona perfiles cuantitativos reproductibles de metabolitos para el análisis comparativo de condiciones.
- Análisis: Ofrece datos de alto contenido mediante GC-TOF-MS y salidas bioinformáticas para la asignación de rutas metabólicas.
- Investigación Traducional: Conecta los cambios metabolómicos con estrategias de biomarcadores ambientales cuando están respaldados por análisis de rutas metabólicas.
- Reutilización Empresarial: Establece un flujo de trabajo estandarizado adaptable a otros sistemas vegetales y agentes estresantes.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en los mecanismos de respuesta al estrés en plantas y en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Proporciona protocolos metabolómicos estandarizados, escalables y reproducibles.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de continuar o no con estrategias de mitigación de riesgos ambientales y de resiliencia de cultivos.
- Impacto en el portafolio: Permite la priorización ajustada al riesgo de estudios sobre interacciones planta-ambiente en diversos programas de I+D.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en metabolómica de plantas e instrumentación GC-TOF-MS.
- Exige una infraestructura analítica robusta para el procesamiento de muestras de alto rendimiento y el análisis de datos.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de recolección de muestras y de interpretación de datos.
- Adaptable a diversos modelos vegetales y factores de estrés ambiental con optimización del protocolo.
- Depende de una replicación rigurosa y de un control de calidad para obtener resultados metabolómicos confiables.
