Bioensayo de letalidad utilizando Artemia salina L.
11 de octubre de 2022
Este trabajo tiene como objetivo evaluar y revisar el procedimiento de bioensayo de letalidad de Artemia salina , también identificado como ensayo de letalidad de camarones en salmuera. Este método simple y barato proporciona información sobre la toxicidad general (considerada como una evaluación preliminar de la toxicidad) de las muestras, es decir, los productos naturales.
Este protocolo es una herramienta muy útil para una evaluación preliminar de toxicidad general en diferentes tipos de muestras, tales como extractos, fracciones y compuestos de diferentes fuentes naturales o sintéticas. La principal ventaja de nuestro protocolo es que es muy fácil y barato y se puede utilizar en muchas muestras al mismo tiempo. Además, el equipo hecho a mano mejora la confiabilidad del sitio.
En esta etapa de la técnica, hacemos un cribado para seleccionar las muestras en función de su perfil preliminar de toxicidad general que se someterá a pruebas específicas adicionales, como líneas celulares expansivas o incluso pruebas in vivo. Este método se explota principalmente en los campos de la química de medicamentos y otros productos para analizar muestras bióticas. Nuestro protocolo también se puede utilizar para otros tipos de muestras, como los nanosistemas.
Mientras realiza por primera vez, tenga paciencia porque esto requiere habilidades de observación finas y mucha atención a todos los parámetros informados Marcia Filipe y Vera Isca, los estudiantes de doctorado de nuestro laboratorio ayudarán a demostrar este procedimiento. Comience colocando el recipiente en forma de embudo en el soporte negro y gire el embudo en una dirección adecuada para ver la marca de nivel y el grifo. Para hacer el equipo de migración hecho a mano cortamos la parte superior de dos botellas de plástico de 0,5 litros para obtener una altura final de 12 centímetros.
Cree un agujero de 1,5 centímetros de diámetro en un lado y siete centímetros desde el fondo de cada botella e inserte un tubo de goma de 13 centímetros entre las dos aberturas. Selle las aberturas con pegamento caliente y déjelas secar durante 15 minutos. Coloque las botellas sobre una superficie plana y llénelas con agua para verificar que no haya fugas.
Agregue 28 gramos de sal a 800 mililitros de agua del grifo para preparar la solución de sal artificial, o sal de camarones en salmuera a una concentración de 35 gramos por litro. Mezclar con una varilla de agitación hasta que toda la sal se disuelva completamente. Para preparar las muestras disolver una cantidad adecuada de cada extracto y compuesto dimetilsulfóxido, o DMSO, a una concentración final de 10 miligramos por mililitro.
Luego diluya 10 microlitros de cada muestra en un nuevo tubo de microcentrífuga utilizando 990 microlitros de la solución salina artificial para obtener una concentración final de 0.1 miligramos por mililitro. Bajo una campana extractora en un erlenmeyer, preparar una solución de dicromato de potasio en agua destilada a una concentración de un miligramo por mililitro. Llene el recipiente para incubar con el mediano hasta la marca de 500 mililitros y agregue una cuchara, o aproximadamente 0.5 gramos de quistes de camarones de salmuera a la solución salina.
Cierre el contenedor. Coloque una lámpara apuntando directamente hacia el equipo y enciéndalo. Conecte el sistema de suministro de aire al conector colocado en la parte superior del equipo y encienda la bomba.
Los quistes de camarones de salmuera eclosionan en la solución salina artificial bajo aireación vigorosa, iluminación continua y temperatura estable. Después de 24 a 48 horas, cuando los huevos hayan eclosionado, apague la bomba de aire y espere hasta que los nauplios se separen de las cajas de huevos vacías. Para separar los huevos no eclosionados de los nauplios vivos, abra el grifo de salida en la parte inferior y descargue el contenido del embudo en uno de los contenedores del contenedor de equipos de migración hechos a mano.
Asegúrese de que la solución que contiene los nauplios y los huevos residuales no eclosionados esté por debajo del nivel del tubo. Coloque el equipo en la incubadora durante cuatro horas, luego en el segundo recipiente agregue la solución salina residual por encima de la altura del tubo. Cubra el recipiente con nauplios y los huevos residuales no eclosionados con papel de aluminio y coloque la lámpara en el segundo recipiente con solo la solución salina.
Los camarones de salmuera serán atraídos por la luz y migrarán de un contenedor a otro, lo que llevará a una separación eficiente entre los huevos y la artemia viva. Del recipiente de cosecha, recoja 900 microlitros de solución salina que contenga de 10 a 15 nauplios y coloque la solución en un pocillo de una placa de 24 pocillos. Todas las muestras se analizan en cuadruplicados.
Añadir 100 microlitros de cada control negativo. Control positivo, la solución salina artificial, y cada una de las muestras a los pozos e incubar la placa bajo iluminación durante 24 horas. Después de 24 horas, registrar el número de larvas muertas en cada pocillo bajo un microscopio binocular a 12 aumentos de x.
Agregue 100 microlitros de solución de dicromato de potasio para inducir la muerte de las larvas vivas restantes y espere seis horas. Cuente el total de larvas muertas en cada pocillo bajo un microscopio y determine la tasa de mortalidad de acuerdo con la ecuación que se muestra en la pantalla. Realizar todas las pruebas por triplicado y calcular las desviaciones estándar.
Finalmente, exprese los resultados como la media de tres experimentos independientes, cada uno con cuadruplicados internos más, menos las desviaciones estándar. La estructura de los compuestos seleccionados extraídos de especies de Plectranthus y obtenidos por semisíntesis se muestran en esta figura. Un nauplio recién nacido de Artemia Salina como se ve bajo el microscopio se muestra en esta imagen.
Esta imagen gráfica representa la tasa de mortalidad de Artemia Salina después de 24 horas de exposición a cuatro extractos de metanol de especies de Plectranthus a 0,1 miligramos por mililitro. Todos los extractos fueron aceptables en términos de toxicidad general utilizando este ensayo. Aquí la sal corresponde a la solución salina o en blanco.
El dicromato de potasio se utilizó como control positivo y el DMSO como control negativo. Todos los extractos analizados mostraron resultados muy alentadores con valores muy bajos de porcentajes de mortalidad comparables a los registrados para el blanco y el control negativo. La tasa de mortalidad de Artemia Salina después de 24 horas de exposición a los cinco compuestos puros a 0,1 miligramos por mililitro se presenta en esta figura.
A partir de estos datos, es evidente que solo cinco muestran una toxicidad mínima utilizando este ensayo. Debe recordar tres pasos en particular, eclosión, migración y recolección. En consecuencia, tenemos otros camarones separados y los números con los que trabajar. El sitio preliminar es un modelo simple y de bajo costo de toxicidad de canal en comparación con otros sitios como el cultivo celular o el pez cebra.
Además, los sitios de citotoxicidad más caros pueden ser explotados.
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Descripción general
Este trabajo evalúa el bioensayo de letalidad en Artemia salina, un método sencillo y rentable para evaluar la toxicidad general de diversas muestras, particularmente productos naturales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Toxicología
- Bioquímica
- Farmacología
Antecedentes
- El ensayo de letalidad de Artemia salina es un método de evaluación de toxicidad preliminar.
- Se utiliza ampliamente en química medicinal y desarrollo de productos.
- El método puede evaluar extractos, fracciones y compuestos.
- Un equipo artesanal mejora la confiabilidad en las pruebas.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un método de cribado confiable para la toxicidad general.
- Seleccionar muestras para pruebas de toxicidad específicas adicionales.
- Facilitar la evaluación de muestras naturales y sintéticas.
Métodos Utilizados
- Utilización de Artemia salina como organismo de prueba.
- Selección de muestras basada en perfiles de toxicidad.
- Comparación de resultados entre múltiples muestras simultáneamente.
- Preparación de equipos hechos a mano para mejorar la fiabilidad de las pruebas.
Resultados principales
- Demuestra eficacia en el tamizaje de muestras bióticas.
- Proporcionó un método rentable para la evaluación de toxicidad.
- Permitió la selección de muestras para pruebas adicionales.
- Aplicable a diversos tipos de muestras, incluidos nanosistemas.
Conclusiones
- El ensayo de letalidad de Artemia salina es una herramienta valiosa en el cribado de toxicidad.
- Permite la evaluación preliminar de muestras diversas.
- Estudios posteriores pueden basarse en los hallazgos iniciales para evaluaciones detalladas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La evaluación de toxicidad en etapas tempranas es fundamental para reducir los riesgos en portafolios de productos naturales y compuestos sintéticos antes de realizar ensayos posteriores intensivos en recursos. El bioensayo de letalidad con Artemia salina ofrece una plataforma rápida, escalable y de bajo costo para seleccionar moléculas candidatas basándose en citotoxicidad general. Esto permite una priorización eficiente y una asignación adecuada de recursos en las etapas de descubrimiento y preclínicas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la eliminación rápida de candidatos altamente tóxicos antes de realizar estudios mecanicistas o basados en dianas.
- Contribuye a la reducción de riesgos biológicos al proporcionar datos iniciales de citotoxicidad para extractos, fracciones y compuestos.
- Facilita la predicción con mayor confianza al avanzar únicamente candidatos tolerables hacia modelos más complejos.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Prepara conjuntos de muestras validados para ensayos celulares o in vivo posteriores al excluir entidades con toxicidad evidente.
- Normaliza la evaluación de la toxicidad en diversos tipos de muestras, incluyendo nanosistemas y productos naturales.
- Proporciona tasas cuantitativas de mortalidad para obtener resultados de cribado reproducibles y comparables entre sí.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Proporciona un perfil de toxicidad fundamental para informar sobre el riesgo de traslación y orientar estudios posteriores de citotoxicidad o estudios in vivo.
- Se alinea con estrategias de fraccionamiento bio-dirigido para la identificación de productos naturales promisorios.
- Reduce la eliminación en etapas avanzadas al detectar compuestos con toxicidad general inaceptable en las primeras fases del proceso.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El ensayo de letalidad en A. salina se sitúa en la interfaz entre el descubrimiento inicial y la selección preclínica, antes de los estudios avanzados de citotoxicidad o estudios en animales.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la identificación de compuestos con perfiles de toxicidad aceptables para una mayor interrogación biológica.
- Tamizaje: Proporciona datos cuantitativos reproductibles sobre mortalidad para orientar decisiones de avance o descarte en el desarrollo de compuestos.
- Análisis: Permite la comparación estadística de la toxicidad de muestras mediante tasas de mortalidad y desviaciones estándar entre réplicas.
- Investigación Traducional: Ofrece datos preliminares de toxicidad que respaldan la continuidad desde modelos in vitro hasta modelos in vivo cuando sea necesario.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una herramienta de tamizaje ampliamente aplicable y de bajo requerimiento de recursos para bibliotecas diversas de compuestos y colecciones de extractos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la selección de compuestos en etapas iniciales.
- Valor operativo: Proporciona cribado de toxicidad estandarizado, escalable y rentable en múltiples muestras.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción del desarrollo y la eficiencia del capital al enfocar los recursos en candidatos viables.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización y el avance ajustados al riesgo de compuestos con perfiles de toxicidad favorables.
Consideraciones de Implementación
- Requiere habilidades básicas de laboratorio y atención al detalle para un manejo preciso de los nauplios y la evaluación de la mortalidad.
- Necesita un instrumental mínimo, con equipos caseros suficientes para un funcionamiento confiable.
- La estandarización de la preparación de muestras y las pruebas por réplicas es esencial para la reproducibilidad.
- Adaptable a una amplia variedad de tipos de muestras, incluyendo extractos, compuestos puros y nanosistemas.
- Limitado a la evaluación de toxicidad general; se requieren ensayos adicionales mecanicistas o específicos de células para un perfilado detallado.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:21
Equipment Preparation
2:15
Preparation of the Artificial Salt Solution and the Sample
3:26
Brine Shrimp Lethality Bioassay
6:44
Results: Lethality Evaluation of the Selected Pure Compounds and Extracts on Artemia salina
8:17
Conclusion
