Ensayo de cribado de alto contenido para la identificación de compuestos modificadores de citotoxicidad celular dependientes de anticuerpos

La citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, o ADCC para abreviar, puede estar mediada por células asesinas naturales, a las que nos referimos como células NK, granulocitos y macrófagos. Estas son las células efectoras de ADCC. Si un anticuerpo como trastuzumab, que se dirige al receptor del factor de crecimiento epidérmico, HER2, se une a las células tumorales, entonces estas células efectoras usan sus receptores FcyR para unirse a la región FC constante de los anticuerpos.

El anticuerpo une las células tumorales y las células efectoras portadoras del receptor FcyR, desencadenando la liberación de sus gránulos citotóxicos. Esto conduce a la apoptosis de las células cancerosas. El ADCC puede ser eficaz contra los tumores que no responden a los efectos antiproliferativos del trastuzumab.

Para configurar el sistema ADCC, necesitamos incubar conjuntamente las células de carcinoma de mama JIMT-1 anti-HER2 positivo con la línea celular NK-92 en presencia del anticuerpo anti-HER2 trastuzumab. La línea celular JIMT-1 que utilizamos para el ensayo expresa de manera estable la proteína verde fluorescente. Primero, codifique la placa de cribado de alto contenido de 96 pocillos con el medio JIMT.

Pipetear 50 microlitros de medio en cada pocillo de la placa. Coloque la placa en una incubadora de CO2 durante una hora. El recubrimiento es crucial para la unión de las células JIMT-1 a la superficie de vidrio de la placa.

Durante la etapa de recubrimiento, tripsinizar las células JIMT-1. Lave las células con dos mililitros de PBS estéril. A continuación, añadir un mililitro de tripsina-EDTA al matraz.

Vuelva a colocar el matraz en una incubadora de CO2 durante 10 minutos. Después de la incubación, golpee el matraz para comprobar si las células JIMT-1 se han desprendido. Detenga la digestión con dos mililitros de medios JIMT-1 y recoja la suspensión celular en un tubo de 15 mililitros.

Luego, cuente las células JIMT-1 con azul de tripano en una cámara de fundición azul. Ajuste el número de células a 133, 000 células por ml. Aspire el medio de recubrimiento y luego agregue 75 microlitros de suspensión celular a cada pocillo.

Permita que las células se adhieran durante una incubación nocturna a 37 grados centígrados en una incubadora de CO2. Al día siguiente, aspire el medio y agregue 50 microlitros de medio JIMT-1 fresco a los pocillos, y transfiera la placa al laboratorio de detección de alto rendimiento. El robot se utiliza para transferir los compuestos de prueba a las microplacas de cribado de alto contenido.

Con el brazo robótico, el robot agarra la unidad de herramienta de pasador, que está calibrada para transferir 25 nanolitros. Transfiera un total de 100 nanolitros de compuestos de prueba de la placa de biblioteca de compuestos a la placa de ensayo en cuatro pasos. Asegúrese de que la concentración final de los compuestos de ensayo sea de 20 micromolares.

Entre cada paso, primero, lave la herramienta de pasador en 50% DMSO y luego en etanol al 70%. Incubar la placa durante una hora en una incubadora de CO2 a 37 grados centígrados. Cultivo de células NK en matraces de cultivo de tejidos T25.

Mientras el tratamiento farmacológico de las células JIMT-1 está en curso, recoja las células NK de un matraz T25 a un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Contar las células NK-92 con azul de tripano en una cámara de recuento azul. Ajuste el número de células a 400, 000 células por ml.

Centrifugar el volumen de suspensión de células NK que contiene 400, 000 células por ml a 150 g durante tres minutos a temperatura ambiente. Prepare el medio ADCC agregando 20 microgramos por ml de anticuerpo anti-HER2 trastuzumab al medio JIMT-1. Pipetear 20.000 células NK en medio ADCC de 50 microlitros a las células GFP JIMT-1 objetivo.

El volumen final es de 100 microlitros, y la concentración final de trastuzumab es de 10 microgramos por ml. Coloque la placa de ensayo en el equipo de análisis de alto contenido, que tiene una incubadora incorporada establecida a 37 grados centígrados. Las placas se visualizan en dos puntos de tiempo.

Primero, adquirimos imágenes inmediatamente después de la adición de las células efectoras a las células objetivo, y el segundo conjunto de imágenes se toma tres horas después de la adición de células NK. Primero, seleccione el tipo de microplaca. Use placas de cribado de alto contenido de 96 pocillos.

Seleccione seleccionar el enfoque porque el ensayo se lleva a cabo en placas con un objetivo de 10x en modo no confocal. Elija la agrupación dos para duplicar la relación señal-ruido. Seleccione los canales, el tiempo de exposición, la potencia del láser, el plano de enfoque y la longitud de onda adecuados.

Tome las imágenes de campo claro a 650-760 nanómetros y detecte las células JIMT-1 transducidas por EGFP con una excitación de 488 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 500-550 nanómetros. Antes de comenzar la medición, tome imágenes de muestra con la función de instantánea para verificar la configuración correcta. Por último, establezca el número de campos y el número de puntos de tiempo para la creación de imágenes.

Elija, por ejemplo, nueve campos y dos puntos de tiempo. Para analizar la eficiencia del ADCC, cuente las celdas JIMT-1 viables en el pozo ADCC de control. Utilice el módulo de celdas finas para detectar regiones en la imagen que corresponden a celdas.

Detecte cada celda como una región de la imagen que tiene una intensidad de fluorescencia más alta que su entorno. Seleccione las celdas utilizando el algoritmo M incorporado con 80 micrómetros de diámetro. Establezca la configuración de sensibilidad de división, que divide un objeto grande en objetos más pequeños, en el valor 0,5.

Ajuste el umbral común, que es el nivel más bajo de intensidad de píxeles, a cero. Excluir la detección de área de fondo con alta intensidad de fluorescencia EGFP en dos pasos. Primero, aplique la función calcular propiedades de intensidad para determinar la intensidad de fluorescencia EGFP en la región celular previamente seleccionada.

Luego, establezca un umbral de intensidad mínima y máxima utilizando la opción de población seleccionada, de modo que obtengamos el número de células objetivo JIMT-1 GFP viables al final de ADCC. Calcule la eficiencia de ADCC dividiendo el número de celda detectado después de tres horas por el número de celda detectado en el tiempo cero. Nos gustaría demostrar la aplicación práctica de nuestro método con resultados representativos.

Hemos instalado una placa de prueba con 16 compuestos retirados al azar de los estantes. También se incluyeron tres compuestos, colchicina, vincristina y podofilotoxina con efecto inhibidor esperado de ADCC. DMSO se utilizó como control negativo.

Cada medicamento se usó en cuatro repeticiones en el plato. La figura muestra el resultado de la pantalla de prueba. En el grupo menos NK, se probó la toxicidad de los fármacos en las células JIMT-1.

En el grupo más NK, se agregaron células NK y trastuzumab, lo que causó aproximadamente un 50% de citotoxicidad. El efecto inhibidor esperado de ADCC de los tres compuestos de prueba podría detectarse con el ensayo. Hemos establecido un sistema de ensayo de cocultivo que modela la interacción clínicamente relevante entre las células de cáncer de mama, las células NK y el anticuerpo monoclonal terapéutico trastuzumab.

El ensayo se basa en microscopía automatizada combinada con análisis de imágenes y es adecuado para la detección de bibliotecas de compuestos químicos para identificar fármacos modificadores de ADCC. El procedimiento se puede utilizar potencialmente para identificar moléculas adyuvantes que potencian una respuesta antitumoral o para identificar productos químicos con un efecto adverso.