Name: Método de aislamiento para células madre hematopoyéticas a largo y corto plazo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Aprenda a aislar células madre hematopoyéticas de largo y corto plazo utilizando el sistema reportero Hoxb5 en ratones. Este método permite estudiar los mecanismos de renovación celular y la heterogeneidad del compartimento HSC mediante citometría de flujo.

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Agradecemos a Hiroshi Kiyonari por el cuidado de los animales y por proporcionar ratones receptores en RIKEN BDR, así como a Hitomi Oga, Kayoko Nagasaka y Masaki Miyahashi por la gestión del laboratorio en la Universidad de Kobe. Los autores también aprecian enormemente el apoyo continuo a este trabajo. Masanori Miyanishi fue apoyado por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) KAKENHI Grant Numbers JP17K07407 y JP20H03268, The Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research, The Life Science Foundation of Japan, The Takeda Science Foundation, The Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders, y AMED-PRIME, AMED bajo el número de subvención JP18gm6110020. Taro Sakamaki cuenta con el apoyo de los números de subvención JSPS KAKENHI JP21K20669 y JP22K16334 y cuenta con el apoyo de el JSPS Core-to-Core Program y el RIKEN Junior Research Associate Program. Katsuyuki Nishi fue apoyado por JSPS Número de subvención KAKENHI JP18J13408.

Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por el Centro RIKEN para la Investigación de Dinámica de Biosistemas.
1. Preacondicionamiento de los ratones receptores
<ol><li>Preparar ratones congénicos machos C57BL/6 de 8-10 semanas de edad como ratones receptores. El número de ratones receptores depende del protocolo experimental. Por lo general, preparamos de 10 a 20 ratones para cada condición.<ol><li>Alimente a los ratones con agua esterilizada suplementada con enrofloxacino (170 mg / L). Como los ratones receptores irradiados son altamente susceptibles a la infección, mantenga las jaulas lo más limpias posible. NOTA: La suplementación con antibióticos comienza 24 h antes de la irradiación y continúa durante 3 semanas después del trasplante para evitar infecciones.</li>
	</ol></li>
	<li>Irradiación corporal total<ol><li>La irradiación corporal total destruye las células de la médula ósea receptoras para asegurar el injerto de las células del donante. Transfiera los ratones receptores a una jaula de irradiación. Irradiar letalmente a los ratones receptores con una dosis única de 8,7 Gy a las 12-16 h antes del trasplante. NOTA: La dosis de radiación y el tiempo pueden variar dependiendo del equipo. La dosis de radiación letal debe confirmarse con el irradiador del investigador y la cepa de ratón.</li>
		<li>Devuélvalos a sus jaulas después de la irradiación corporal total.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Recolección de las células de la médula ósea del donante
<ol><li>Preparar un ratón macho Hoxb5-tri-mCherry de 12 semanas de edad, y sacrificar al ratón por exposición aCO2 seguida de luxación cervical o utilizando métodos aprobados por el comité local de ética animal. NOTA: El volumen de reactivo por ratón se describe en los pasos siguientes.</li>
	<li>En condiciones estériles, retire la piel y exponga los huesos (fémur, tibia, pelvis, húmero). Corte los músculos principales y tome los huesos (fémur, tibia, pelvis, húmero) del ratón. Colóquelos en platos de cultivo celular estéril con PBS helado sin Ca 2+- y Mg2+.</li>
	<li>Recorte los músculos y los tejidos fibrosos de los huesos con pinzas, tijeras pequeñas y toallitas húmedas para evitar la contaminación. Tenga cuidado de no romperse los huesos durante este paso. Deseche cualquier hueso roto para mantener la esterilidad.</li>
	<li>Esterilizar un mortero con etanol al 70% (EtOH), y dejar secar completamente. Equilibrar con tampón de tinción celular (PBS libre de Ca 2+ y Mg2+ suplementado con FBS inactivado por calor al 2%, 2 mM EDTA, 100 U/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina).</li>
	<li>Coloque los huesos en el mortero y agregue 3 ml de tampón de tinción celular. Aplastar los huesos abiertos con el mortero. Desagregue los grupos celulares mediante un pipeteo suave y transfiera la suspensión celular a través de un filtro celular de 100 μm a un tubo de 50 ml.</li>
	<li>Repita el paso 2.5 hasta que la solución se aclare. Por lo general, tres veces es suficiente.</li>
</ol>3. Separación de las células c-kit+ mediante clasificación magnética
<ol><li>Tinción de anticuerpos para clasificación magnética<ol><li>Centrifugar las muestras a 400 x g y 4 °C durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 ml de tampón de tinción celular. Añadir 10 μL de IgG de rata (5 mg/ml) para reducir la unión de anticuerpos no específicos, y pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta P1.000. Incubar en hielo durante 15 min.</li>
		<li>Añadir el anticuerpo c-Kit (clon 2B8) a una concentración de 4 μg/ml y mezclar con una pipeta P1.000. Incubar en hielo durante 15 min.</li>
		<li>Agregue 5 ml de tampón de tinción celular y mezcle bien. Centrifugar las muestras a 400 x g, 4 °C, 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 500 μL de tampón de tinción celular.</li>
		<li>Agregue 35 μL de microperlas anti-APC para enriquecer las células c-Kit+ y mezcle con una pipeta P1,000. Incubar en hielo durante 15 min.</li>
		<li>Agregue 4-5 ml de tampón de tinción celular. Centrifugar las muestras a 400 x g y 4 °C durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 ml de tampón de tinción celular.</li>
	</ol></li>
	<li>Clasificación magnética de las células c-Kit+<ol><li>Siga las instrucciones del fabricante para clasificar las celdas. En resumen, prepare una columna de clasificación magnética con 3 ml de tampón de tinción celular. Filtrar la muestra (1 ml) a través de un filtro celular de 40 μm y cargar la muestra en la columna de clasificación magnética.</li>
		<li>Lavar agregando 3 ml de tampón de tinción celular tres veces. Agregue el tampón de tinción celular solo cuando el depósito de columna esté vacío.</li>
		<li>Coloque la columna de clasificación magnética encima de un tubo de 15 ml helado y agregue 5 ml de tampón de tinción celular. Enjuague las celdas empujando firmemente el émbolo hacia la columna. Mantenga el flujo en hielo. NOTA: En caso de pérdida accidental de la muestra, mantenemos el flujo hasta el final del experimento.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Tinción de células madre hematopoyéticas
<ol><li>Centrifugar la muestra preparada en el paso 3.2.3 a 400 x g y 4 °C durante 5 min. Aspirar el sobrenadante.</li>
	<li>Añadir el anticuerpo CD34 (clon RAM34) a una concentración de 50 μg/ml al pellet, e incubar en hielo durante 60 min. NOTA: Se recomienda la preparación de las células de soporte durante la primera hora de incubación con CD34 para acortar el tiempo de procesamiento.</li>
	<li>Prepare la mezcla maestra de anticuerpos de acuerdo con la Tabla 1. Añadir 100 μL de la mezcla maestra a la muestra, e incubar en hielo durante 30 min. El anticuerpo para el antígeno CD34 (clon; RAM34) requiere 90 minutos para una tinción suficiente.</li>
	<li>Agregue 4-5 ml de tampón de tinción celular. Centrifugar la muestra a 400 x g y 4 °C durante 5 min. Aspirar el sobrenadante. Añadir estreptavidina-BUV737 a una concentración de 3 μg/ml al pellet, e incubar en hielo durante 30 min.</li>
	<li>Agregue 4-5 ml de tampón de tinción celular. Centrifugar la muestra a 400 x g y 4 °C durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 400 μL de tampón de tinción celular. Mantenga la muestra en hielo.</li>
</ol>5. Apoyo a la preparación celular
<ol><li>Preparar un ratón congénico CD45.1+ CD45.2+ de 12 semanas de edad; Idealmente, esta debería ser la misma edad que el ratón donante. Eutanasia del ratón por exposición aCO2 seguida de luxación cervical o utilizando métodos aprobados por el comité local de ética animal. NOTA: En el ejemplo proporcionado, los ratones congénicos CD45.1+ CD45.2+ fueron criados internamente cruzando B6. Ratones congénicos CD45.1 con ratones C57BL/6J16.</li>
	<li>En condiciones estériles, tome tanto los fémures como las tibias, y colóquelos en platos de cultivo celular estéril con PBS helado sin Ca 2+ y Mg2+. Recorte los músculos y tejidos fibrosos de los huesos con pinzas y tijeras pequeñas.</li>
	<li>Corte ambos extremos de los huesos con tijeras afiladas y estériles. Use una aguja de 23 G y una jeringa de 5 ml llena de tampón de suspensión de células heladas (PBS libre de Ca 2+ y Mg2+ suplementado con FBS inactivado por calor al 2%, 100 U/ml de penicilina y estreptomicina de 100 μg/ml) para enjuagar la médula ósea en una placa de cultivo celular estéril con tampón de suspensión celular. Desagregue los grupos de células mediante un pipeteo suave.</li>
	<li>Filtrar la suspensión celular a través de un filtro celular de 40 μm utilizando una pipeta P1,000. Contar el número de células de la suspensión celular con un hemocitómetro y preparar una suspensión de células de médula ósea que contenga 1 x 106 células/ml.</li>
	<li>Transfiera 200 μL de la suspensión de células de la médula ósea (2 x 105 células) a una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Mantener en hielo hasta su uso. NOTA: Se recomiendan placas de fondo redondo para facilitar la recolección de celdas.</li>
</ol>6. Hoxb5pos o Hoxb5neg pHSC clasificación
<ol><li>Configuración de Gating<ol><li>Transfiera 400 μL de la muestra preparada en el paso 4.5 a un tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo con una tapa de presión del filtro de células de 35 μm. Prepare el reactivo de tinción de células muertas y agréguelo a la muestra antes del análisis de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
		<li>Encienda un citómetro de flujo e inicie el software de análisis de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, pulse Cargar y adquiera los datos. NOTA: Se recomienda un citómetro de flujo equipado con cinco láseres y una boquilla de 70 μm para mejorar la pureza de las células clasificadas.</li>
		<li>Después de excluir dobletes, células muertas y células positivas para linaje, compuerta la fracción Lineage−c-Kit+Sca-1+. A continuación, elimine la fracción Flk2+. Luego, compuerta Hoxb5pos o Hoxb5neg pHSCs en la fracción CD150+CD34−/baja (Figura 2). Realizar la compensación por la superposición espectral en el primer experimento. NOTA: Se espera que las células positivas para Hoxb5 representen el 20% -25% de la fracción Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/Flk2− baja.</li>
	</ol></li>
	<li>Hoxb5pos o Hoxb5neg pHSC clasificación<ol><li>Prepare un tubo de unión a proteínas bajas en 1,5 ml con 600 μL de PBS libre de Ca 2+ y Mg2+ suplementado con FBS inactivado térmicamente al 10%.</li>
		<li>Coloque el tubo de unión a proteínas bajas de 1,5 ml en un dispositivo de recolección de clasificación y clasifique las pHSC Hoxb5pos o Hoxb5neg en el tubo de 1,5 ml utilizando la estrategia de compuerta establecida en el paso 6.1.3. En la primera clasificación, utilice el rendimiento del modo de precisión de clasificación.</li>
		<li>Ajuste la placa de 96 pocillos con las celdas de soporte preparadas en el paso 5.5 en la etapa de la unidad de deposición de células automatizada (ACDU). Coloque el tubo de unión a proteínas bajas de 1,5 ml preparado en el paso 6.2.2 en el puerto de carga de un citómetro de flujo.</li>
		<li>Clasifique laspHSC Hoxb5 pos o Hoxb5neg en una placa de 96 pocillos con las celdas de soporte utilizando la estrategia de compuerta establecida en el paso 6.1.3. Ordene 10 Hoxb5 pos oHoxb5 neg pHSC para probar sus capacidades de autorrenovación. NOTA: Se recomienda la doble clasificación para mejorar la pureza. En la segunda clasificación, utilice la pureza como el modo de precisión de clasificación recomendado.</li>
		<li>Normalmente, 500-1.000Hoxb5 pos pHSCs y 1.500-4.000 Hoxb5neg pHSCs se cosechan después de la doble clasificación. Proceda con los procedimientos de trasplante tan pronto como sea posible después de la clasificación HSC para mejorar la viabilidad celular (idealmente dentro de 1-2 h).</li>
	</ol></li>
</ol>7. Trasplante
<ol><li>Colocar en hielo la placa de 96 pocillos clasificada por HSC preparada en el paso 6.2.4. Manipule la placa de 96 pocillos clasificada por HSC en condiciones estériles, idealmente en una campana de celda.</li>
	<li>Anestesiar a un ratón receptor con isoflurano al 2% en una cámara de inducción de anestesia con gas. Una vez que el animal esté completamente anestesiado, retírelo y colóquelo de lado. Para asegurar suficiente anestesia, confirme que no hay movimiento en respuesta a un estímulo nocivo.</li>
	<li>Después de la confirmación de la anestesia adecuada, realice una inyección retroorbital lo antes posible para evitar que el ratón recupere la conciencia. La inyección retroorbital tarda menos de 30 s. NOTA: Dado que el tiempo de inyección es corto, terminamos el procedimiento sin aplicar ungüento oftálmico en los ojos. Sin embargo, si el procedimiento toma más tiempo, recomendamos el uso de ungüento oftálmico.</li>
	<li>Pipetea suavemente las células en la placa de 96 pocillos clasificada por HSC para mezclarlas. Recoger las células del donante en la placa de clasificación con una jeringa de insulina de 30 G e inyectarlas en el plexo venoso retroorbital de los ratones receptores. El volumen inyectable recomendado es de ≤200 μL.</li>
	<li>Observe hasta que los ratones estén conscientes y se muevan en una jaula limpia. Devuélvalos a sus jaulas después de confirmar su recuperación.</li>
</ol>8. Análisis de sangre periférica
<ol><li>Recoger 50 μL de sangre periférica de la vena de la cola, y resuspenderla con 100 μL de Ca 2+- y Mg2+-libre de PBS con 2 mM EDTA. Transfiera todas las muestras a una placa de 96 pocillos. Centrifugar a 400 x g y 4 °C durante 5 min, y desechar el sobrenadante.</li>
	<li>Agregue 200 μL de tampón de lisis de glóbulos rojos e incube en hielo durante 3 minutos. Centrifugar las muestras a 400 x g y 4 °C durante 5 min, y desechar el sobrenadante. Repita una vez más.</li>
	<li>Añadir 200 μL de tampón de tinción celular. Centrifugar las muestras a 400 x g y 4 °C durante 5 min, y desechar el sobrenadante.</li>
	<li>Prepare la mezcla maestra de anticuerpos de acuerdo con la Tabla 2. Añadir 50 μL de mezcla maestra de anticuerpos e incubar en hielo durante 30 min.</li>
	<li>Añadir 150 μL de tampón de tinción celular. Centrifugar las muestras a 400 x g y 4 °C durante 5 min, y desechar el sobrenadante.</li>
	<li>Añadir 200 μL de tampón de tinción celular. Centrifugar las muestras a 400 x g y 4 °C durante 5 min, y desechar el sobrenadante. Resuspender en 200 μL de tampón de tinción celular y agregar reactivo de tinción de células muertas antes del análisis de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Analizar el quimerismo de sangre periférica utilizando un citómetro de flujo como se describió anteriormente16. Recolectar sangre a las 4 semanas, 8 semanas, 12 semanas y 16 semanas después del trasplante para seguir la reconstitución multilinaje. En la Figura 3 se proporcionan gráficos de citometría de flujo representativos.</li>
</ol>

<ol><li>Weissman, I. L., Shizuru, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+of+the+identification+and+isolation+of+hematopoietic+stem+cells%2C+and+their+capability+to+induce+donor-specific+transplantation+tolerance+and+treat+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases.</a> Blood. 112 (9), 3543-3553 (2008).</li>
<li>Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+hierarchy+of+multipotent+hematopoietic+progenitors+in+human+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood.</a> Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).</li>
<li>Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+mouse+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells.</a> Science. 241 (4861), 58-62 (1988).</li>
<li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+function+of+c-kit+in+hemopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).</li>
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<li>Christensen, J. L., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flk-2+is+a+marker+in+hematopoietic+stem+cell+differentiation%3A+A+simple+method+to+isolate+long-term+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Flk-2 is a marker in hematopoietic stem cell differentiation: A simple method to isolate long-term stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (25), 14541-14546 (2001).</li>
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<li>Morita, Y., Ema, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+and+hierarchy+within+the+most+primitive+hematopoietic+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity and hierarchy within the most primitive hematopoietic stem cell compartment.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (6), 1173-1182 (2010).</li>
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<li>Fathman, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+CD11A+on+hematopoietic+stem+cells+denotes+the+loss+of+long-term+reconstitution+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Upregulation of CD11A on hematopoietic stem cells denotes the loss of long-term reconstitution potential.</a> Stem Cell Reports. 3 (5), 707-715 (2014).</li>
<li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li>
<li>Haas, S., Trumpp, A., Milsom, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+hematopoietic+stem+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of hematopoietic stem cell heterogeneity.</a> Cell Stem Cell. 22 (5), 627-638 (2018).</li>
<li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+heterogeneity%3A+Subtypes%2C+not+unpredictable+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell heterogeneity: Subtypes, not unpredictable behavior.</a> Cell Stem Cell. 6 (3), 203-207 (2010).</li>
<li>Muller-Sieburg, C. E., Sieburg, H. B., Bernitz, J. M., Cattarossi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+heterogeneity%3A+Implications+for+aging+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Stem cell heterogeneity: Implications for aging and regenerative medicine.</a> Blood. 119 (17), 3900-3907 (2012).</li>
<li>Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+bone+marrow+transplantation+%28BMT%29%3A+Providing+optimal+veterinary+and+husbandry+care+to+irradiated+mice+in+BMT+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Principles of bone marrow transplantation (BMT): Providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (1), 11-22 (2009).</li>
<li>Nishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+minimum+requirements+for+successful+haematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Identification of the minimum requirements for successful haematopoietic stem cell transplantation.</a> British Journal of Haematology. 196 (3), 711-723 (2022).</li>
<li>Sakamaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hoxb5+defines+the+heterogeneity+of+self-renewal+capacity+in+the+hematopoietic+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Hoxb5 defines the heterogeneity of self-renewal capacity in the hematopoietic stem cell compartment.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 539, 34-41 (2021).</li>
</ol>

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses asociados con este estudio.

Tradicionalmente, las HSC definidas por marcadores de superficie celular se han preparado para estudiar las funciones de las HSC, como la capacidad de autorrenovación y la potencia múltiple 19,20,21. Sin embargo, la fracción HSC inmunofenotípicamente definida (Linaje−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/lo Flk2−) contiene dos poblaciones discretas de HSC: LT-HSCs y ST-HSCs<sup...

Las células madre hematopoyéticas (HSC), que poseen capacidad de autorrenovación y multipotencia, residen en el ápice de la jerarquía hematopoyética 1,2. En 1988, Weissman y sus colegas demostraron por primera vez que el aislamiento de las HSC de ratón podría lograrse utilizando la citometría de flujo3. Posteriormente, se informó que una fracción definida por una combinación de marcadores de superficie celular, Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−, contenía todas las HSCs en ratones 4,5,6,7,8.
Las HSC inmunofenotípicamente definidas (Linaje−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) (en adelante, pHSCs) se consideraban previamente funcionalmente homogéneas. Sin embargo, análisis unicelulares recientes han revelado que las pHSCs todavía exhiben heterogeneidad con respecto a su capacidad de autorrenovación9,10 y multipotencia11,12. Específicamente, dos poblaciones parecen existir en la fracción pHSC con respecto a su capacidad de autorrenovación: las células madre hematopoyéticas a largo plazo (LT-HSCs), que tienen capacidad de auto-renovación continua, y las células madre hematopoyéticas a corto plazo (ST-HSCs), que tienen capacidad de auto-renovación transitoria 9,10.
Hasta la fecha, los mecanismos moleculares de la capacidad de autorrenovación que distinguen las LT-HSC y las ST-HSC siguen siendo poco conocidos. Es crucial aislar ambas poblaciones celulares en función de sus capacidades de autorrenovación y descubrir los mecanismos moleculares subyacentes. También se han introducido varios sistemas de notificación para purificar LT-HSC13,14,15; sin embargo, la pureza LT-HSC definida por cada sistema informador es variable, y hasta la fecha no se ha logrado una purificación exclusiva de LT-HSC.
Por lo tanto, el desarrollo de un sistema de aislamiento para LT-HSC y ST-HSC acelerará la investigación sobre la capacidad de autorrenovación en la fracción pHSC. En el aislamiento de LT-HSCs y ST-HSCs, un estudio que utilizó cribado imparcial de múltiples pasos identificó un solo gen, Hoxb5, que se expresa heterogéneamente en la fracción pHSC16. Además, el análisis de médula ósea de los ratones reporteros Hoxb5 reveló que aproximadamente el 20% -25% de la fracción pHSC consiste en célulasPos Hoxb5. Un ensayo de trasplante competitivo utilizando Hoxb5 pos pHSCs y Hoxb5 neg pHSCs reveló que solo Hoxb5pos pHSCs poseen capacidad de auto-renovación a largo plazo, mientras que Hoxb5neg pHSCs pierden su capacidad de auto-renovación en un corto período de tiempo, indicando que Hoxb5 identifica LT-HSCs en la fracción pHSC16.
Aquí, demostramos un protocolo paso a paso para aislar LT-HSC y ST-HSC utilizando el sistema informador Hoxb5 . Además, presentamos un ensayo de trasplante competitivo para evaluar la capacidad de autorrenovación de las pHSC Hoxb5pos/neg (Figura 1). Este sistema reportero Hoxb5 nos permite aislar prospectivamente LT-HSCs y ST-HSCs y contribuye a la comprensión de las características específicas de LT-HSC.

<table><tbody><tr><td>0,2 mL tira de 8 tubos, tapón de cúpula</td><td>SSIbio</td><td>3230-00</td><td></td></tr><tr><td>0,5M EDTA pH 8,0</td><td>Iinvtrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; m Filtro de células</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>30G jeringa de insulina</td><td>BD 326668</td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; m Filtro de células</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo, con filtro de células Tapón a presión</td><td>FALCON</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD Solución de tinción de viabilidad</td><td>BioLegend</td><td>420404</td><td></td></tr><tr><td>96 pocillos U-Bottom</td><td>FALCON</td><td>351177</td><td></td></tr><tr><td>Anti-APC-MicroBeads</td><td>Milteny biotec</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>Aspirador con trampa matraz</td><td>Biosan</td><td>FTA-1</td><td></td></tr><tr><td>B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2)</td><td>BioLegend</td><td>103232</td><td></td></tr><tr><td>B220-Biotina (RA3-6B2)</td><td>BioLegend</td><td>103204</td><td></td></tr><tr><td>B220-BV786 (RA3-6B2)</td><td>BD Biosciences</td><td>563894</td><td></td></tr><tr><td>B6. Ratones congénitos CD45.1&nbsp;</td><td>Sankyo Labo Service</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Baytril 10%</td><td>BAYER</td><td>341106546</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Aria II sistema de pedido especial&nbsp;</td><td>BD</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tampón antimanchas brillante</td><td>BD</td><td>566349</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70)</td><td>BioLegend</td><td>101222</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-Biotina (M1/70)</td><td>BioLegend</td><td>101204</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-BUV395 (M1/70)</td><td>BD Biosciences</td><td>563553</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-BV711 (M1/70)</td><td>BD Biosciences</td><td>563168</td><td></td></tr><tr><td>CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34)</td><td>Invitrogen</td><td>56-1271-82</td><td></td></tr><tr><td>CD150-BV421 (TC15-12F12.2)</td><td>BioLegend</td><td>115943</td><td></td></tr><tr><td>CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93)</td><td>Invitrogen</td><td>56-0161-82</td><td></td></tr><tr><td>CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34)</td><td>BD Biosciences</td><td>560230</td><td></td></tr><tr><td>CD34-FITC (RAM34)</td><td>Invitrogen</td><td>11034185</td><td></td></tr><tr><td>CD3-Alexa Fluor 700 (17A2)</td><td>BioLegend</td><td>100216</td><td></td></tr><tr><td>CD3&épsilon; -Biotina (145-2C11)</td><td>BioLegend</td><td>100304</td><td></td></tr><tr><td>CD3&épsilon; -BV421 (145-2C11)</td><td>BioLegend</td><td>100341</td><td></td></tr><tr><td>Ratones congénitos CD45.1/CD45.2</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>Criados en nuestro laboratorio</td></tr><tr><td>CD45.1-FITC (A20)</td><td>BD Biosciences</td><td>553775</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2-PE (104)</td><td>BD Biosciences</td><td>560695</td><td></td></tr><tr><td>CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5)</td><td>BioLegend</td><td>100430</td><td></td></tr><tr><td>CD4-Biotina (GK1.5)</td><td>BioLegend</td><td>100404</td><td></td></tr><tr><td>CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7)</td><td>BioLegend</td><td>100730</td><td></td></tr><tr><td>CD8a-Biotina (53-6.7)</td><td>BioLegend</td><td>100704</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Centrífuga 15ml</td><td>NICHIRYO</td><td>00-ETS-CT-15</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga 50ml</td><td>NICHIRYO</td><td>00-ETS-CT-50</td><td></td></tr><tr><td>c-Kit-APC-eFluor780 (2B8)</td><td>Invitrogen</td><td>47117182</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (-) sin Ca y Mg, líquido&nbsp;</td><td>Nacalai</td><td>14249-24</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino</td><td>Thermo Fisher</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10)</td><td>eBioscience</td><td>46135182</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo versión 10</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</tr><tr><td>Gmmacell 40 Exactor</td><td>Mejor Teratrónica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5)</td><td>BioLegend</td><td>108422</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1-Biotin (RB6-8C5)</td><td>BioLegend</td><td>108404</td><td></td></tr><tr><td>Hoxb5-tri-mRatones Cherry (C57BL/6J fondo)&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Criado en nuestro laboratorio</td></tr><tr><td>IgG a partir de suero de rata, grado técnico, >=80% (SDS-PAGE), solución acuosa tamponada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8015-100MG</td><td></td></tr><tr><td>isoflurano</td><td>Pfizer</td><td>4987-114-13340-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Toallitas Kimwipes S200</td><td>PAPEL NIPPON CRECIA&nbsp;</td><td>6-6689-01</td><td></td></tr><tr><td>LS Columnas</td><td>Milteny biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lisis&nbsp;</td><td>BD</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>MACS&nbsp; MultiStand</td><td>Milteny biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca para cultivo de tejidos (para célula de adhesión) 6Well</td><td>IWAKI</td><td>3810-006</td><td></td></tr><tr><td>Separador MidiMACS</td><td>Milteny biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Jaulas para tartas de ratón</td><td>Natsume Seisakusho</td><td>KN-331</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada multiusos</td><td>TOMY</td><td>EX-125</td><td></td></tr><tr><td>NARCOBIT-E (II)</td><td>Natsume Seisakusho</td><td>KN-1071-I</td><td></td></tr><tr><td>NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136)</td><td>BioLegend</td><td>108728</td><td></td></tr><tr><td>Solución mixta de penicilina-estreptomicina</td><td>nacalai</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>Mortero de porcelana &phi; 120mm con Pestle</td><td>Asone</td><td>6-549-03</td><td></td></tr><tr><td>Tubo LoBind de Proteínas 1.5 mL&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>Sca-I-BUV395 (D7)</td><td>BD Biosciences</td><td>563990</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de bisturí de acero inoxidable</td><td>FastGene</td><td>FG-B2010</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-BUV737</td><td>BD Biosciences</td><td>612775</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX-red</td><td>Invitrogen</td><td>S34859</td><td></td></tr><tr><td>Restricción de venas de cola para ratones estándar</td><td>Braintree</td><td>TV-150 STD</td><td></td></tr><tr><td>TCRb-BV421 (H57-597)</td><td>BioLegend</td><td>109230</td><td></td></tr><tr><td>Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119)</td><td>BioLegend</td><td>116220</td><td></td></tr><tr><td>Ter-119-Biotina (TER-119)</td><td>BioLegend</td><td>116204</td><td></td></tr><tr><td>Terumo 5ml Jeringa Concéntrica Luer-Slip</td><td>TERUMO</td><td>SS-05LZ</td><td></td></tr><tr><td>Terumo Aguja Hipodérmica 23G x 1</td><td>TERUMO</td><td>NN-2325-R</td><td></td></tr></tbody></table>

método de aislamiento para células madre hematopoyéticas a largo y corto plazo

Isolation Method for Long-Term and Short-Term Hematopoietic Stem Cells

La capacidad de autorrenovación y el potencial de diferenciación multilinaje se consideran generalmente como las características definitorias de las células madre hematopoyéticas (HSC). Sin embargo, numerosos estudios han sugerido que existe heterogeneidad funcional en el compartimento HSC. Análisis recientes de células individuales han reportado clones de HSC con diferentes destinos celulares dentro del compartimento HSC, que se conocen como clones de HSC sesgados. Los mecanismos subyacentes a los resultados heterogéneos o poco reproducibles son poco conocidos, especialmente con respecto a la duración de la autorrenovación cuando las fracciones purificadas de HSC se trasplantan mediante inmunotinción convencional. Por lo tanto, establecer un método de aislamiento reproducible para las HSC a largo plazo (LT-HSC) y las HSC a corto plazo (ST-HSC), definido por la duración de su autorrenovación, es crucial para superar este problema. Mediante el cribado imparcial de varios pasos, identificamos un factor de transcripción, Hoxb5, que puede ser un marcador exclusivo de LT-HSC en el sistema hematopoyético de ratón. Con base en este hallazgo, establecimos una línea de ratón reportero Hoxb5 y aislamos con éxito LT-HSC y ST-HSC. Aquí describimos un protocolo detallado para el aislamiento de LT-HSC y ST-HSC utilizando el sistema informador Hoxb5 . Este método de aislamiento ayudará a los investigadores a comprender mejor los mecanismos de autorrenovación y la base biológica de dicha heterogeneidad en el compartimento HSC.

Anteriormente, la capacidad de autorrenovación se ha medido mediante ensayos de trasplante competitivos, en los que se cree que las HSC del donante conservan su capacidad de autorrenovación solo si se observan células donantes de múltiples linajes en la sangre periféricareceptora 17. Además, varios relatos definen las LT-HSC como células que continúan produciendo células de sangre periférica varios meses después del segundo trasplante de médula ósea10,18<sup clas...

Presentamos un protocolo paso a paso para el aislamiento de células madre hematopoyéticas a largo plazo (LT-HSCs) y HSCs a corto plazo (ST-HSCs) utilizando el sistema reportero Hoxb5.

Método de aislamiento para células madre hematopoyéticas a largo y corto plazo

Self-renewal capacity and multi-lineage differentiation potential are generally regarded as the defining characteristics of hematopoietic stem cells ...

El método de aislamiento de células madre hematopoyéticas a largo y corto plazo o HSC ayudará a los investigadores a comprender mejor los mecanismos de renovación celular y la base biológica de la heterogeneidad en el compartimento HSC. Se identificó un factor de transcripción, Hoxb5, que puede ser un marcador exclusivo de HSC a largo plazo. En base a esto, se estableció una línea de ratones reporteros Hoxb5 y se aislaron con éxito las HSC a largo y corto plazo.Para comenzar la recolección de las células de la médula ósea del donante, esterilice un mortero con etanol al 70% y déjelas secar por completo. Equilibre aquellos con tampón de tinción celular compuesto de suplementos que contienen PBS sin calcio y magnesio. Coloque los huesos aislados del ratón macho donante Hoxb5-tri-mCherry en el mortero y agregue tres mililitros del tampón de tinción celular.Cepille los huesos abiertos con el mortero, luego desagregue los grupos celulares con un pipeteo suave y transfiera la suspensión celular a través de un colador de células de 100 micras a un tubo de 50 mililitros. Repita el proceso con tampón de tinción celular fresca hasta que la solución se vuelva clara. Por lo general, repetir tres veces es suficiente para producir una solución clara.Después de aislar los fémures y las tibias del ratón congénico CD45.1.2, corte ambos extremos de los huesos con tijeras estériles afiladas. Usando una aguja de calibre 23 equipada con una jeringa de cinco mililitros llena de tampón de suspensión de células heladas, enjuague la médula ósea en una placa de cultivo celular estéril que contenga tampón de suspensión celular. Desagregue los grupos de células mediante un pipeteo suave, luego filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 40 micras con una pipeta P1000.Para la configuración de compuerta, prepare la muestra siguiendo las instrucciones proporcionadas en el texto y transfiera 400 microlitros de ella a un tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo con una tapa de presión de filtro de celda de 35 micras. Prepare y agregue el reactivo de deformación de células muertas a la muestra antes del análisis, siguiendo las instrucciones del fabricante. Luego, encienda el citómetro de flujo e inicie el software de análisis siguiendo las instrucciones del fabricante.Luego, presione Cargar para comenzar a adquirir los datos. Después de excluir dobletes, células muertas y células positivas para linaje, compuerta la fracción positiva para el linaje negativo, la fracción positiva para c-kit, Sca-1. A continuación, elimine la fracción positiva de Flk2.Luego compuerta las pHSC positivas para Hoxb5 o negativas para Hoxb5 en la fracción CD150 positiva, CD34 negativa o baja. A continuación, prepare un tubo de unión de baja proteína de 1,5 milímetros con 600 microlitros de PBS libre de calcio y magnesio, complementado con FBS inactivado por calor al 10%. Para realizar la clasificación de pHSC Hoxb5 positivo o Hoxb5 negativo, coloque el tubo de unión de baja proteína de 1,5 mililitros preparado en un dispositivo de recolección de clasificación y clasifique las pHSC Hoxb5 positivas o negativas para Hoxb5 en el tubo utilizando la estrategia de compuerta mencionada anteriormente.En la primera clasificación, utilice el rendimiento del modo de precisión de clasificación. Coloque la placa de 96 pocillos con las celdas de soporte previamente preparadas en la etapa de la unidad de deposición de células automatizada. Luego, coloque el tubo de unión de baja proteína de 1.5 mililitros en el puerto de carga del citómetro de flujo.Clasifique las pHSC Hoxb5 positivas o Hoxb5 negativas en la placa de 96 pocillos con las celdas de soporte utilizando la estrategia de compuerta mencionada anteriormente. Clasifique 10 pHSC Hoxb5 positivas o Hoxb5 negativas para probar sus capacidades de autorrenovación. Las gráficas de citometría de flujo del análisis de médula ósea de los ratones donantes Hoxb5-tri-mCherry revelaron aproximadamente del 20 al 25% de las células en la fracción pHSC definida por linaje negativo, c-kit-positivo, Sca-1-positivo, CD150-positivo, CD34-negativo, o bajo, Flk2-negativo eran pHSCs Hoxb5-positivos.Aquí se muestran los gráficos de citometría de flujo representativos del análisis de sangre periférica de los ratones receptores. Además, el análisis de sangre periférica de los ratones receptores después del trasplante primario reveló que, aunque las pHSC Hoxb5 positivas y negativas para Hoxb5 presentaron quimerismo similar del donante cuatro semanas después del trasplante, se observó hematopoyesis continua solo en los receptores de pHSC positivas para Hoxb5. Las HSC Hoxb5 negativas comenzaron a perder la capacidad de producir células hematopoyéticas ocho semanas después del trasplante.En el análisis de trasplante secundario, sólo los receptores de CPHp positivos para Hoxb5 presentaron hematopoyesis robusta. En contraste, apenas se observaron células de donantes en los ratones receptores de pHSC negativos para Hoxb5, lo que sugiere que las pHSC negativas para Hoxb5 perdieron la capacidad de autorrenovación dentro de las 16 semanas posteriores al trasplante primario. Este protocolo suele tardar de nueve a 12 horas, por lo que es importante mantener la muestra a cuatro grados centígrados durante todo el procedimiento tanto como sea posible para mantener la viabilidad celular.

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Aislamiento y trasplante de células madre hematopoyéticas (HSC)

Este video muestra la forma de micro-disección del saco vitelino y la aorta-gonadal-mesonefros región a partir de embriones y el uso de la citometría de flujo para clasificar las células madre hematopoyéticas.

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Lentiviral mediada por derribo Durante Ex Vivo Eritropoyesis de las células estaminales hematopoyéticas

A continuación se describe el aislamiento de CD133 que expresan las células madre del hígado y las células madre del cáncer de hígado en su totalidad murino, un proceso que requiere de digestión de los tejidos, el enriquecimiento celular y citometría de flujo aislamiento. Se incluyen métodos para el aislamiento avanzado de células individuales y la expansión clonal.

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Un método para analizar la distribución de progenitores hematopoyéticos de médula ósea en citometría de flujo, así como para aislar eficazmente altamente purificadas células madre hematopoyéticas (HSC) se describe. El procedimiento de aislamiento se basa esencialmente en el enriquecimiento magnética de c-kit + células y células de clasificación para purificar las CMH para los estudios celulares y moleculares.

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Este video muestra una técnica para generar ratones del sistema inmunológico humano (HIS). Las células madre hematopoyéticas (HSC) CD34+ se aíslan de las células de la capa leucitaria de la sangre del cordón umbilical humano mediante perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos. Las HSC CD34+ se expanden en un medio de crecimiento enriquecido con citocinas y criopreservado. Finalmente, las HSC descongeladas se inyectan en una cría de ratón inmunodeficiente para establecer el modelo de ratón HIS.

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Este protocolo permite el mantenimiento de células madre hematopoyéticas humanas en reposo in vitro imitando el microambiente de médula ósea utilizando abundantes ácidos grasos, colesterol, concentraciones más bajas de citoquinas e hipoxia.

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Este estudio ha establecido un método estable y eficiente para el aislamiento, cultivo y determinación funcional de células madre CD34+ residentes en la pared vascular (CD34+ VW-SCs). Este método de aislamiento fácil de seguir y eficaz en el tiempo puede ser utilizado por otros investigadores para estudiar los posibles mecanismos implicados en las enfermedades cardiovasculares.

Aislamiento inmunomagnético de células madre CD34+ residentes en la pared vascular de ratones

Aquí presentamos protocolos que permiten el aislamiento de células estromales de hueso murino, médula ósea, timo y tejido tímico humano compatible con multiómicas unicelulares.

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Describimos un protocolo para extraer núcleos de alta calidad de tipos de células madre pluripotentes inducidas, estromales/endoteliales y de células sanguíneas criopreservadas para respaldar los análisis de secuenciación de próxima generación de un solo núcleo. La producción de núcleos intactos de alta calidad es imprescindible para los experimentos multiómicos, pero puede ser una barrera de entrada en el campo para algunos laboratorios.

Aislamiento nuclear de células sanguíneas criopreservadas in vitro

Aprenda a aislar células madre hematopoyéticas de largo y corto plazo utilizando el sistema reportero Hoxb5 en ratones. Este método permite estudiar los mecanismos de renovación celular y la heterogeneidad del compartimento HSC mediante citometría de flujo.

Método de aislamiento para células madre hematopoyéticas a largo y corto plazo

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