Name: Un método de enriquecimiento para pequeñas vesículas extracelulares derivadas del tejido de cáncer de hígado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T12:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Aprenda un método de ultracentrifugación diferencial optimizado para enriquecer pequeñas vesículas extracelulares derivadas de tejido de cáncer de hígado con mayor pureza que los métodos clásicos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores agradecen al Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Gannan por apoyar este trabajo. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (números de subvención 82260422).

Se recolectó tejido de cáncer de hígado humano de pacientes diagnosticados con neoplasia maligna hepática en el Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Gannan. Todos los pacientes firmaron un formulario de consentimiento informado, y la recolección de muestras de tejido humano fue aprobada por el comité de ética del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Gannan. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, equipos y software utilizados en este protocolo.
1. Preparación
<ol><li>Coloque el agitador de decoloración de transferencia en la incubadora y ajuste la temperatura a 37 °C. Consulte la Figura 1 para todos los demás equipos necesarios.</li>
	<li>Limpie el bisturí y las pinzas rociándolas con alcohol al 75%.</li>
	<li>Preparar la solución digestiva midiendo 6 mg de colagenasa D (4 mg/ml) y 24 μL de DNasa Ι (80 U/ml) y añadiéndolas a 1,5 mL de medio básico RPMI-1640. Mezclar por inversión suave hasta que los aditivos estén completamente disueltos.</li>
	<li>Por adelantado, humedezca los filtros celulares de 70 μm y 0,22 μm con 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS).</li>
	<li>Coloque una placa de cultivo celular estéril de 100 mm en la nevera para contener los tejidos hepáticos después de la descongelación.</li>
	<li>Dentro de los 15 minutos después del aislamiento del tejido del carcinoma hepatocelular, enjuague la sangre en la superficie del bloque de tejido con PBS, transfiera el tejido a un tubo congelado estéril y guárdelo a -80 °C hasta el experimento durante no más de 2 semanas.</li>
</ol>2. Disociación tisular
<ol><li>Extraer la muestra de tejido del congelador de −80 °C y colocar aproximadamente 400 mg del tejido cortado en fragmentos de 2 mm x 2 mm x 2 mm en la placa de cultivo celular de 10 cm en la nevera.</li>
	<li>Mueva el tejido a una placa de 6 pocillos con 1.5 ml de la solución digestiva; a continuación, coloque la placa en el agitador de decoloración de transferencia (20 rpm/min) para incubar durante 20 min a 37 °C para la disociación completa del tejido canceroso hepático y la liberación de los sEV.</li>
	<li>Retire la placa de 6 pocillos de la incubadora y colóquela en la nevera. Añadir 80 μL de inhibidor de la fosfatasa y 200 μL de solución completa de inhibidor de la proteasa para detener la digestión.</li>
	<li>Transfiera la solución digestiva al filtro de células de 70 μm y fílela lentamente para eliminar cualquier residuo de tejido grande. Recoja el filtrado y colóquelo en un tubo de centrífuga de 2 ml.</li>
</ol>3. Ultracentrifugación diferencial
NOTA: Realice todos los pasos de centrifugación a 4 °C.
<ol><li>Centrifugar el filtrado a 500 × g durante 10 min y recoger el sobrenadante en un nuevo tubo de centrífuga de 2 ml. La mayoría de los pequeños restos de tejido se pueden eliminar.</li>
	<li>Centrifugar el sobrenadante a 3.000 × g durante 20 minutos para eliminar los restos celulares. Transfiera con cuidado el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga hasta que la punta de la pipeta esté a punto de tocar la sustancia blanca en la superficie.</li>
	<li>Centrifugar el líquido restante a 3.000 × g durante 3 min; Luego, aspire el sobrenadante para facilitar la recolección de vesículas. Para garantizar la pureza de los sEV, asegúrese de que la sustancia blanca no esté aspirada.</li>
	<li>Centrifugar el sobrenadante recogido a 12.000 × g durante 20 min y transferir 900 μL del sobrenadante a un tubo de ultracentrífuga de 4,7 ml. Centrifugar el líquido restante a 12.000 × g durante 3 min y luego recoger y mezclar ambos sobrenadantes en el mismo tubo de ultracentrífuga. Llene el tubo completamente con PBS.</li>
	<li>Centrifugar los sobrenadantes a 100.000 × g durante 60 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet llenando el tubo de ultracentrífuga con PBS y centrifugando nuevamente a 100,000 × g durante 60 min. Resuspender el pellet con 50 μL de PBS.</li>
	<li>Aspirar la suspensión sEV con una jeringa estéril de 1 ml y filtrarla a través de un filtro de membrana de 0,22 μm. Recoja el filtrado en un tubo de centrífuga de 600 μL y guárdelo a -80 °C para su posterior análisis.</li>
</ol>4. Evaluación de la calidad del enriquecimiento
<ol><li>Observe la morfología de los sEV bajo un microscopio electrónico de transmisión.<ol><li>Luego, deje caer 10 μL de la muestra de sEV en una red de cobre, incube a temperatura ambiente durante 10 minutos y límpiela con agua destilada estéril, usando papel absorbente para eliminar el exceso de líquido.</li>
		<li>Deje caer 10 μL de acetato de uranilo al 2% en la red de cobre para la tinción negativa durante 1 min. Use papel de filtro para absorber el líquido en la superficie de la red de cobre y séquelo durante 2 minutos bajo una lámpara incandescente.</li>
		<li>Observe la malla de cobre bajo un microscopio electrónico de transmisión e imagen a 80 kV.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilice un citómetro de flujo de nanopartículas para determinar la distribución del tamaño y la pureza de los sEV.<ol><li>Antes de arrancar la máquina, prepare tubos que contengan 200 μL de control de calidad, 200 μL de nanoesferas de sílice, 2 x 200 μL de agua ultrapura, 2 x 200 μL de solución de limpieza y 200 μL de PBS. NOTA: Antes de probar las muestras de sEV, es necesario realizar un control de calidad en el instrumento y probar el estándar de tamaño de partícula (la distribución del tamaño debe calcularse utilizando curvas estándar generadas con varias nanomicroesferas de diferentes diámetros [68-155 nm] bajo la misma condición de detección). Las perlas de control de calidad y las nanoesferas de sílice se diluyeron 100 veces con agua ultrapura en un volumen total de 200 μL.</li>
		<li>Compruebe el volumen de la solución de limpieza (>10 ml) y observe la diferencia entre los niveles del líquido de la vaina y el líquido residual (20-30 cm).</li>
		<li>Apague la fuente de alimentación principal del instrumento; Después de 20 s, encienda la computadora y espere los pitidos que indican que el instrumento está conectado correctamente para ejecutar el software.</li>
		<li>Haga clic en Iniciar para encender la cámara, el láser y la bomba de aire.</li>
		<li>Haga clic en Sheath Flow-Start Up y coloque agua ultrapura en la plataforma de carga. Después de 4 minutos (cuenta atrás del instrumento), haga clic en Sample-Boosting | Muestra-Descargar.</li>
		<li>Después de 30 s, coloque el tubo en blanco en la plataforma de carga y haga clic en Sample-Boosting | Muestra-Descargar. Luego, coloque el tubo que contiene el agua ultrapura en la plataforma de carga y, simultáneamente, haga clic en Sample-Boosting | Purga de flujo de vaina.</li>
		<li>Haga clic en Operación manual y coloque el tubo de concentración de partículas en la plataforma de carga. Luego, haga clic en Sample-Boosting durante 1 min y seleccione simultáneamente el control de calidad de 250 nm Std FL SiNPs en "SAMP. Inf."</li>
		<li>Haga clic en Muestreo de muestras y encienda el detector haciendo clic en SPCM. NOTA: En este punto, se puede ver la forma de onda de la señal en tiempo real.</li>
		<li>Haga clic en Muestreo automático e introduzca 1.0 en Sampling SET para fijar la presión en 1 KPa. Haga clic en la barra de herramientas y seleccione Señal grande.</li>
		<li>Ajuste la posición horizontal del láser y ajuste el láser a 2 μm; luego, haga clic en L o R para asegurarse de que la señal sea fuerte y uniforme.</li>
		<li>Haga clic en Time to Record para recopilar los datos, que saltarán automáticamente a Buffer cuando terminen. Luego, guarde los datos en un archivo Naf y haga clic en Sample-Unload.</li>
		<li>Coloque el tubo de solución de limpieza en la plataforma de carga, haga clic en Sample-Boosting, y después de 1 minuto, haga clic en Sample-Unloading. Use agua ultrapura para eliminar la solución de limpieza residual de la punta capilar.</li>
		<li>Coloque el tubo estándar del tamaño de partícula en la plataforma de carga y haga clic en Sample-Boosting durante 1 min.</li>
		<li>Seleccione el control de calidad de SiNPs Std FL de 68-155 nm en "SAMP. Inf" y haga clic en Muestreo de muestras. Luego, haga clic en la barra de herramientas y seleccione Señal pequeña.</li>
		<li>Haga clic en Time to Record para recopilar los datos, que saltarán automáticamente a Buffer cuando terminen. Luego, guarde los datos en un archivo Naf y haga clic en Sample-Unload.</li>
		<li>Coloque el tubo de solución de limpieza en la plataforma de carga, haga clic en Sample-Boosting y haga clic en Sample-Unload después de 1 min. Use agua ultrapura para eliminar la solución de limpieza residual de la punta capilar.</li>
		<li>Coloque el tubo PBS en la plataforma de carga; haga clic en Sample-Boosting durante 1 minuto.</li>
		<li>Seleccione el control de calidad de SiNPs Std FL de 68-155 nm en "SAMP. Inf" y haga clic en Muestreo de muestras. Luego, haga clic en la barra de herramientas y seleccione Señal pequeña.</li>
		<li>Haga clic en Time to Record para recopilar datos, que saltarán automáticamente a Buffer cuando termine. Guarde los datos en un archivo Naf y haga clic en Sample-Unload.</li>
		<li>Coloque el tubo de solución de limpieza en la plataforma de carga, haga clic en Aumento de muestras y Descarga de muestras después de 1 minuto. Use agua ultrapura para eliminar la solución de limpieza residual de la punta capilar.</li>
		<li>Compruebe la información de ejemplo como se describió anteriormente en los pasos 4.2.17-4.2.20; cambie el PBS (paso 4.2.17) a la muestra sEV y analice los datos.</li>
	</ol></li>
	<li>Identifique aún más los sEV por Western blot.<ol><li>Determine las concentraciones de proteínas de los sEV y tejidos utilizando el kit de cuantificación de proteínas BCA de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
		<li>Calcule el volumen de carga de sEV (por ejemplo, para 5 μg de proteína por pocillo) basándose en estos resultados cuantitativos. Agregue el búfer de carga en una proporción de 1: 4 y voltee la mezcla.</li>
		<li>Después de la desnaturalización en un baño metálico a 100 °C (termostato seco) durante 10 min, separe la proteína en un gel de poliacrilamida al 12% a 60 V durante 80 min.</li>
		<li>Transfiera el gel a una membrana de difluoruro de polivinilideno de 0,22 μm a 220 mA durante 2 h utilizando tampón de transferencia (25 mM Tris, 192 mM glicina, 20% metanol).</li>
		<li>Bloquear la membrana con leche en polvo descremada al 5% en Tween salino tamponado con Tris (TBST) durante 1 h a temperatura ambiente e incubar con el anticuerpo primario (anticuerpo CD9 monoclonal monoclonal de conejo, anticuerpo CD63 monoclonal humano de conejo, anticuerpo anti-humano monoclonal de conejo TSG101 anticuerpo, anticuerpo monoclonal de ratón GM130 humano) durante la noche a 4 °C. Diluir los anticuerpos primarios en leche descremada al 5% a 1:1.000.</li>
		<li>Después de tres lavados con TBST, incubar la membrana con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) a temperatura ambiente durante 1 h.</li>
		<li>Detecte el anticuerpo vinculado a HRP utilizando sustrato de transferencia ECL y luego recopile y analice las imágenes.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+as+mediators+of+intercellular+crosstalk+in+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism.</a> Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).</li>
<li>Hou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+exosome+isolation+methods+and+their+applications+in+proteomic+analysis+of+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).</li>
<li>Zhang, L., Yu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+cancer+development%2C+metastasis%2C+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Reviews+on+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).</li>
<li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((and+perspective+on+exosome+isolation+-+Efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">and perspective on exosome isolation - Efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li>
<li>Crescitelli, R., Lässer, C., Lötvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicle+subpopulations+from+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues.</a> Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).</li>
<li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpopulations+of+extracellular+vesicles+from+human+metastatic+melanoma+tissue+identified+by+quantitative+proteomics+after+optimized+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).</li>
<li>Jang, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+protein+enriched+extracellular+vesicles+discovered+in+human+melanoma+tissues+can+be+detected+in+patient+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420(2019).</li>
<li>Muralidharan-Chari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARF6-regulated+shedding+of+tumor+cell-derived+plasma+membrane+microvesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles.</a> Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).</li>
<li>Matejovič, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+separation+methods+for+tissue-derived+extracellular+vesicles+in+the+liver%2C+heart%2C+and+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Bio%22%5BJournal%5D)">Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle.</a> FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue-derived+exosomes+mitigate+the+metabolic+syndrome+in+high+fat+diet+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice.</a> Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+variability+of+small+extracellular+vesicles+derived+from+human+liver+cancer+tissues+and+cultured+from+the+tissue+explants+based+on+a+simple+enrichment+method%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).</li>
<li>Fang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-derived+exosomal+miR-1247-3p+induces+cancer-associated+fibroblast+activation+to+foster+lung+metastasis+of+liver+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer.</a> Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).</li>
<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+of+plasma+exosomes+revealed+novel+functional+long+noncoding+RNAs+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HCC-derived+exosomes+elicit+HCC+progression+and+recurrence+by+epithelial-mesenchymal+transition+through+MAPK%2FERK+signalling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway.</a> Cell Death & Disease. 9 (5), 513(2018).</li>
<li>Jingushi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+isolated+from+human+renal+cell+carcinoma+tissues+disrupt+vascular+endothelial+cell+morphology+via+azurocidin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin.</a> International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).</li>
<li>Camino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+adipose+tissue+extracellular+vesicles+protein+cargo+and+its+role+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366(2020).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Este protocolo describe un método repetible para extraer sEV del tejido del cáncer de hígado. Los sEV de alta calidad se obtienen mediante aislamiento tisular nítido, tratamiento con enzimas digestivas, ultracentrifugación diferencial y filtración y purificación de membrana filtrante de 0,22 μm. Para el análisis posterior, es extremadamente importante garantizar la alta pureza de los sEV. En el proceso de centrifugación diferencial, aparecerá una capa de sustancias blancas (composición desconocida) en la superficie del s...

Las vesículas extracelulares pequeñas (sEV) tienen aproximadamente 30 nm a 150 nm de diámetro y son secretadas por varias células1. Pueden comunicarse con las células de los tejidos y regular el microambiente local o distante mediante el transporte de moléculas biológicas importantes como lípidos, proteínas, ADN y ARN a varios órganos, tejidos, células y partes intracelulares. Por lo tanto, también pueden cambiar el comportamiento de las células receptoras 2,3. El aislamiento y la purificación de sEV específicos es un requisito previo esencial para estudiar su comportamiento biológico durante el desarrollo y el curso de la enfermedad. La ultracentrifugación diferencial, considerada como el estándar de oro, se usa comúnmente para separar los sEV de los tejidos en los que normalmente residen4. Los restos de tejido, los restos celulares, las vesículas grandes y los cuerpos apoptóticos se pueden eliminar mediante esta técnica, dejando solo los sEV.
Se ha demostrado que la colagenasa D y la DNasa I no afectan las características moleculares de las células o vesículas, y las propiedades de ambas enzimas contribuyen a la liberación de vesículas en la matriz extracelular 5. Estas enzimas se han utilizado para extraer sEVs del tejido del melanoma metastásico humano, tejido de cáncer de colon y tejido de la mucosa colónica 5,6,7. Sin embargo, la concentración y el tiempo de digestión de la colagenasa D y la DNasa I en estos métodos difieren, lo que lleva a conclusiones inconsistentes. Para evitar la coprecipitación de otros subtipos de sEVs, los investigadores han eliminado vesículas extracelulares más grandes (0,1 μm o 0,2 μm de diámetro) por filtración y/o centrifugación diferencial8. Dependiendo del tejido fuente, pueden ser necesarios diferentes métodos de aislamiento y purificación 9,10.
El uso del método tradicional de ultracentrifugación diferencial para extraer sEV del tejido hepático da como resultado una capa de materia blanca en la superficie del sobrenadante, sin ninguna forma de determinar sus propiedades. En un estudio previo11, se encontró que esta capa de materia blanca afecta la pureza de los sEV. Aunque el número de partículas y la concentración de proteínas de las muestras aisladas por el método tradicional fueron más altos que los del método actual, el coeficiente de variación fue grande, posiblemente porque muchos contaminantes pueden conducir a una repetibilidad deficiente de los resultados. Es decir, utilizando detergente (es decir, detectando la solubilidad de partículas en Triton X-100 al 1%), encontramos que la pureza de los sEVs obtenidos por este método era mayor. Por lo tanto, utilizamos este método para aislar y purificar sEV derivados del tejido de cáncer colorrectal para la investigación proteómica.
En la actualidad, la investigación sobre sEVs en cáncer de hígado se centra principalmente en suero, plasma y sobrenadante del cultivo celular12,13,14. Sin embargo, los sEV derivados del tejido del cáncer de hígado pueden reflejar con mayor precisión la patología fisiológica y el microambiente circundante del cáncer de hígado y evitar eficazmente la degradación y contaminación de otros EV15,16. Con el uso de la ultracentrifugación diferencial, este método puede enriquecer el rendimiento y obtener sEV de alta calidad, proporcionando una base importante para el estudio posterior del cáncer de hígado. Este método permite que el tejido del cáncer de hígado se separe por separación aguda y se disocie por la colagenasa D y la DNasa I. Luego, los desechos celulares, las vesículas grandes y los cuerpos apoptóticos se eliminan aún más mediante filtración y ultracentrifugación diferencial. Finalmente, los sEV se aíslan y purifican para estudios posteriores.

<table><tbody><tr><td>0,22 y micro; m Unidad de filtro de membrana</td><td>Millex</td><td>SLGPR33RB</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Jeringa estéril</td><td>Hubei Xianming Medical Instrument Company</td><td>YL01329</td><td></td></tr> 2<tr><td>% Acetato de uranilo</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>22400-2</td><td></td></tr><tr><td>4.7 mL Tubo de centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>361621</td><td></td></tr><tr><td>6 pocillos Placa de cutura</td><td>LABSELECT</td><td>11110</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Vaso</td><td>de precipitados Tianjin Kangyiheng Compañía de ventas de instrumentos experimentales</td><td>CF2100800</td><td></td></tr><tr><td>70 y micro; m Colador de células</td><td>Biosharp</td><td>BS-70-XBS</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Placa de cultivo celular</td><td>CELL TER</td><td>CS016-0128</td><td></td></tr><tr><td>600 &micro; L Tubo de centrífuga</td><td>Axygen</td><td>MCT060C</td><td></td></tr><tr><td>Kit de cuantificación de proteínas BCA</td><td>Thermo Fisher</td><td>RJ240544</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter Optima-Max-TL</td><td>Beckman&nbsp;</td><td>A95761</td><td></td></tr><tr><td>BioRad Mini trans-blot</td><td>Bio-Rad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>BioRad Mini-Protean</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo CD63</td><td>Abcam</td><td>ab134045</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo CD9</td><td>Abcam</td><td>ab263019</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5430R</td><td>Eppendorf</td><td>5428HQ527333</td><td></td></tr><tr><td>Solución de limpieza</td><td>NanoFCM</td><td>C1801</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa D</td><td>Roche</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>Red de cobre</td><td>Henan Zhongjingkeyi Compañía de tecnología</td><td>DJZCM-15-N1</td><td></td></tr><tr><td>Termostato seco</td><td>Hangzhou empresa de instrumentos allsheng</td><td>AS-01030-00</td><td></td></tr><tr><td>FITC Anti anti humano CD9 Anticuerpo</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1086C</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Solarbio</td><td>G8200</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-ratón anti-ratón acoplado a peroxidasa de rábano picante de cabra (HRP)&nbsp;</td><td>Proteintech</td><td>SA00001-1</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-conejo acoplado a peroxidasa de rábano picante de cabra (HRP)&nbsp;</td><td>Proteintech</td><td>SA00001-2</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Shanghai Zhenxing Chemical Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citómetro de flujo de nanopartículas</td><td>NanoFCM INC</td><td>FNAN30E20112368</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidores de la fosfatasa (PhosSTOP)</td><td>Roche</td><td>4906845001</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Servicebio</td><td>G4202</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de difluoruro de polivinilideno</td><td>Solarbio</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>QC Beads</td><td>NanoFCM</td><td>QS2502</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 medio básico</td><td>Industrias Biológicas&nbsp;</td><td></td><td></td>C11875500BT</tr><tr><td>Bisturí</td><td>Guangzhou Kehua Trading Company</td><td>NN-0623-1</td><td></td></tr><tr><td>Nanoesferas de sílice</td><td>NanoFCM</td><td>S16M-Exo</td><td></td></tr><tr><td>Agitador decolorante de transferencia TS-8</td><td>Kylin-Bell</td><td>E0018</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de transmisión</td><td>Thermo Scientific</td><td>Talos L120C</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Solarbio</td><td>T8060</td><td></td></tr><tr><td>TSG101 Anticuerpo</td><td>Proteintech</td><td>28283-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Pinza</td><td>Guangzhou Lige Technology Company</td><td>LG01-105-4X</td><td></td></tr></tbody></table>

un método de enriquecimiento para pequeñas vesículas extracelulares derivadas del tejido de cáncer de hígado

An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

Las pequeñas vesículas extracelulares (sEV) derivadas del tejido pueden reflejar el estado funcional de las células fuente y las características del espacio intersticial del tejido. El enriquecimiento eficiente de estos sEV es un requisito previo importante para el estudio de su función biológica y una clave para el desarrollo de técnicas de detección clínica y tecnología de portadores terapéuticos. Es difícil aislar los sEV del tejido porque generalmente están muy contaminados. Este estudio proporciona un método para el enriquecimiento rápido de sEV de alta calidad a partir de tejido de cáncer de hígado. El método implica un proceso de cuatro pasos: la incubación de enzimas digestivas (colagenasa D y DNasa Ι) con tejido, filtración a través de un filtro celular de 70 μm, ultracentrifugación diferencial y filtración a través de un filtro de membrana de 0,22 μm. Debido a la optimización de la etapa de ultracentrifugación diferencial y la adición de una etapa de filtración, la pureza de los sEV obtenidos por este método es mayor que la lograda por la ultracentrifugación diferencial clásica. Proporciona una metodología importante y datos de apoyo para el estudio de sEV derivados de tejidos.

Los sEV de los tejidos de cáncer de hígado humano han desempeñado un papel crucial en el diagnóstico, tratamiento y pronóstico de pacientes con cáncer de hígado. Este método utilizó instrumentos de laboratorio comunes para aislar y purificar sEV derivados de tejidos de cáncer de hígado; esto puede proporcionar apoyo metodológico para el estudio de los sEV. La figura 2 ilustra el proceso general de enriquecimiento de los sEV de los tejidos del cáncer de hígado. Los sEV en los espacios interce...

Aquí describimos el enriquecimiento de pequeñas vesículas extracelulares derivadas del tejido de cáncer de hígado a través de un método optimizado de ultracentrifugación diferencial.

Un método de enriquecimiento para pequeñas vesículas extracelulares derivadas del tejido de cáncer de hígado

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

Este método permite el aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares derivadas del tejido de cáncer de hígado con una pureza superior a la lograda por la ultracentrifugación diferencial clásica. Esta tecnología es simple, conveniente y fácil de operar, lo que puede proporcionar soporte metodológico para el estudio de pequeñas vesículas extracelulares. Para comenzar, retire la muestra de tejido del congelador a 80 grados centígrados.Coloque aproximadamente 400 miligramos del tejido en un plato de cultivo celular de 10 centímetros en la caja de hielo y pique finamente el tejido con un bisturí. Transfiera el tejido a una placa de seis pocillos con 1,5 mililitros de la solución digestiva. Luego, coloque la placa en el agitador de decoloración de transferencia e incube a 37 grados centígrados durante 20 minutos para la disociación completa del tejido del cáncer de hígado y la liberación de las pequeñas vesículas extracelulares, o sEV.Después de la incubación, coloque la placa de seis pocillos en la caja de hielo. Agregue 80 microlitros de inhibidor de fosfatasa y 200 microlitros de solución completa de inhibidor de proteasa para detener la digestión. Luego, transfiera la solución digestiva a un colador de células de 70 micrómetros colocado en un tubo de centrífuga de dos mililitros y fílelo lentamente para eliminar cualquier residuo de tejido grande.Centrifugar el filtrado a 500 g durante 10 minutos para eliminar los restos de tejido pequeño y recoger el sobrenadante en un nuevo tubo de centrífuga de dos mililitros. Centrifugar el sobrenadante a 3, 000 g durante 20 minutos para eliminar los restos celulares. Transfiera con cuidado el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga hasta que la punta de la pipeta esté a punto de tocar los residuos blancos en la parte inferior.Después de repetir la centrifugación del líquido restante, agrupe el sobrenadante en el tubo sin perturbar los desechos. Centrifugar el sobrenadante recogido a 12.000 g durante 20 minutos y transferir 900 microlitros del sobrenadante a un tubo de ultracentrífuga de 4,7 milímetros. Repita la centrifugación del líquido restante, y luego recoja y mezcle ambos sobrenadantes en el mismo tubo de ultracentrífuga.Llene el tubo completamente con PBS. Centrifugar el sobrenadante a 100, 000 g durante 60 minutos. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet llenando el tubo de ultracentrífuga con PBS.Después de repetir la centrifugación a 100, 000 g durante 60 minutos, vuelva a suspender el pellet con 50 microlitros de PBS. Aspire la suspensión sEV con una jeringa estéril de un mililitro y fíjela a través de un filtro de membrana de 0,22 micrómetros en un tubo de centrífuga de 600 microlitros. Almacene el filtrado a 80 grados centígrados para su posterior análisis.Utilice un citómetro de flujo de nanopartículas para determinar la distribución del tamaño y la pureza de los sEV. Compruebe el volumen de la solución de limpieza. Luego, observe la diferencia entre los niveles de la vaina y el líquido residual.Después de 20 segundos de encender la fuente de alimentación principal del instrumento, encienda la computadora. Espere a que aparezcan los pitidos que indican que el instrumento está conectado correctamente para ejecutar el software. Haga clic en Iniciar para encender la cámara, el láser y la bomba de aire.A continuación, haga clic en Sheath Flow y seleccione Start Up.Coloque agua ultrapura en la plataforma de carga. Después de cuatro minutos, haga clic en Muestra y potenciación, y luego seleccione Descargar en muestra. Después de 30 segundos, coloque el tubo en blanco en la plataforma de carga.Haga clic en Muestra, seleccione Aumentar y, a continuación, seleccione Descargar en muestra. Luego, coloque el tubo que contiene el agua ultrapura en la plataforma de carga. Simultáneamente, haga clic en Muestra y Potenciador, seguido de Flujo de vaina y Purga.Haga clic en Operación manual y coloque el tubo de concentración de partículas en la plataforma de carga. Luego, haga clic en Muestra, seleccione Boosting durante un minuto y seleccione simultáneamente el control de calidad de 250 nanómetros Standard Fluorescent Silica Nanospheres en Información de muestra. Seleccione Muestreo de muestra y encienda el detector haciendo clic en SPCM.Luego, haga clic en Muestreo automático e ingrese 1.0 en Conjunto de muestreo para fijar la presión a un kilopascale. Haga clic en la barra de herramientas y seleccione Señal grande. Ajuste la posición horizontal del láser y ajuste el láser a dos micrómetros.Luego, haga clic continuamente en L y R para asegurarse de que la señal sea fuerte y uniforme. Haga clic en Time to Record para recopilar los datos, que saltan automáticamente a Buffer cuando terminan. Luego, guarde los datos en Archivo Nfa y haga clic en Muestra para seleccionar Descargar.Coloque el tubo de solución de limpieza en la plataforma de carga. Haga clic en Muestra, seleccione Boosting y, después de un minuto, haga clic en Sample and Unload. Use agua ultrapura para eliminar la solución de limpieza residual de la punta capilar.Coloque el tubo estándar de tamaño de partícula en la plataforma de carga y haga clic en Sample Boosting durante un minuto. Seleccione 68 a 155 Control de calidad S16M-Exo en Información de muestra, haga clic en Muestra y, a continuación, en Muestreo. A continuación, haga clic en la barra de herramientas y seleccione Señal pequeña.Haga clic en Time to Record para recopilar los datos, que saltan automáticamente a Buffer cuando terminan. Luego, guarde los datos en un archivo Nfa y haga clic en Muestra para seleccionar Descargar. Después de eliminar los residuos con la solución de limpieza, coloque el tubo PBS en la plataforma de carga y realice los pasos demostrados para el tubo estándar de tamaño de partícula.A continuación, limpie la punta capilar como se demostró anteriormente y cargue la muestra de sEV para analizar los datos descritos anteriormente para el tubo estándar de tamaño de partícula. Los sEV purificados se examinaron bajo un microscopio electrónico de transmisión, que reveló la presencia de sEV con una morfología en forma de copa. Se realizó citometría de flujo para los sEVs.Y el tamaño de partícula varió de 40 a 200 nanómetros, y el tamaño promedio de partícula fue de 89 nanómetros. Se encontró que la pureza de los sEV enriquecidos era del 68,32%Los marcadores proteicos de sEV como CD63, CD9 y TSG101 fueron detectados por Western blot. GM130 se utilizó como marcador de control negativo de sEV, que se encontró en las células de tejido pero no en los sEV.Es crucial realizar los pasos de digestión enzimática, ultracentrifugación diferencial y filtración de membrana con el máximo cuidado para garantizar la pureza de pequeñas vesículas extracelulares.

an-enrichment-method-for-small-extracellular-vesicles-derived-from

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Los exosomas aislados en plasma se pueden utilizar como una forma no invasiva y repetible para la detección y el seguimiento de los biomarcadores para la detección temprana y la progresión de la enfermedad. Este vídeo describe el protocolo para la separación de exosomas de las muestras de plasma de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas, que podría utilizarse para extracciones de ADN y proteínas.

Aislamiento de exosomas: una técnica para separar exosomas del plasma de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas

Este es un protocolo para aislar las vesículas extracelulares del tejido (EV) del hígado. El protocolo describe un proceso de dos pasos que implica perfusión de colagenasa seguido de ultracentrifugación diferencial para aislar los vehículos eléctricos de tejido hepático.

Aislamiento de las vesículas extracelulares de tejido del hígado

Un exosomas es una nueva generación de compañías de entrega de drogas. Hemos establecido un protocolo de aislamiento de exosomas con alto rendimiento y pureza para entrega de siRNA. También había encapsulado con fluorescencia inespecífica siRNA en exosomas y había investigado la absorción celular de exosomas cargado de siRNA en las células cancerosas.

Preparación de exosomas siRNA entrega a las células cancerosas

Presentamos un protocolo detallado para aislar pequeñas vesículas extracelulares (EVs) de tejidos todo, incluyendo a muestras de cerebro y del tumor. Este método ofrece una técnica reproducible para extraer EVs de tejido sólido para mayores análisis aguas abajo.

Extracción de vesículas extracelulares de todo tejido

El presente protocolo describe un método para extraer vesículas extracelulares de la sangre periférica y tejidos sólidos con el posterior perfil de antígenos de superficie y cargas de proteínas.

Aislamiento y análisis de vesículas extracelulares trazables y funcionalizadas a partir del plasma y tejidos sólidos

Este protocolo demuestra cómo aislar pequeñas vesículas extracelulares de células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical humano (hUC-MSC-sEV) con un entorno de laboratorio simple. La distribución del tamaño, la concentración de proteínas, los marcadores de sEV y la morfología de los hUC-MSC-sEV aislados se caracterizan por el análisis de seguimiento de nanopartículas, el ensayo de proteínas BCA, el western blot y el microscopio electrónico de transmisión, respectivamente.

Un método simple de filtración de sobremesa para aislar pequeñas vesículas extracelulares de células madre mesenquimales humanas

El presente protocolo describe la centrifugación diferencial para aislar y caracterizar EVs representativas (exosomas y microvesículas) de MSCs humanas cultivadas. Otras aplicaciones de estos vehículos eléctricos también se explican en este artículo.

Aislamiento, caracterización y aplicación terapéutica de vesículas extracelulares a partir de células madre mesenquimales humanas cultivadas

El protocolo propuesto incluye pautas sobre cómo evitar la contaminación con endotoxinas durante el aislamiento de vesículas extracelulares de sobrenadantes de cultivos celulares y cómo evaluarlas adecuadamente.

Aislamiento de vesículas extracelulares de bajo contenido de endotoxinas derivadas de líneas celulares cancerosas

Aquí, presentamos un protocolo para aislar exosomas derivados del bazo de ratón utilizando una combinación de digestión con colagenasa tipo I y ultracentrifugación.

Aislamiento y caracterización de exosomas derivados de tejidos de bazo de ratón

Este protocolo describe el aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares del músculo esquelético murino y la médula ósea mediante digestión enzimática y cromatografía de exclusión de tamaño, permitiendo la recuperación reproducible de fracciones enriquecidas con vesículas de tejidos estructuralmente complejos y de bajo rendimiento para análisis molecular posteriores.

Aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares del músculo esquelético murino y médula ósea mediante cromatografía de exclusión de tamaño

Aprenda un método de ultracentrifugación diferencial optimizado para enriquecer pequeñas vesículas extracelulares derivadas de tejido de cáncer de hígado con mayor pureza que los métodos clásicos.

Un método de enriquecimiento para pequeñas vesículas extracelulares derivadas del tejido de cáncer de hígado

Explorar más videos