Name: Generación de organoides retinianos a partir de células madre pluripotentes sanas y específicas de la enfermedad retiniana inducida por humanos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Aprende a generar organoides retinianos tridimensionales a partir de células madre pluripotentes humanas. Este protocolo eficiente utiliza cultivos adherentes y en suspensión para estudiar enfermedades degenerativas retinianas y desarrollar terapias celulares.

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Los autores agradecen el apoyo científico y técnico del Dr. Chitra Kannabiran, genetista; Dr. Subhadra Jalali, Consultor de Retina; Dr. Milind Naik, cirujano oculoplástico; y el Dr. Swathi Kaliki, oncólogo ocular en el LV Prasad Eye Institute, Hyderabad hacia la generación de líneas iPSC normales y específicas del paciente. Los autores reconocen las subvenciones de investigación y desarrollo de la Junta de Investigación de Ciencia e Ingeniería, Departamento de Ciencia y Tecnología (IM), (SB / SO / HS / 177 / 2013), Departamento de Biotecnología (IM), (BT / PR32404 / MED / 30 / 2136 / 2019) y Becas de Investigación Senior de ICMR (SM , D.P.), UGC (T.A.) y CSIR (V.K.P.), Gobierno de la India.

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<li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li>
<li>Chichagova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+retinal+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of retinal organoids from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 95(2019).</li>
<li>Kelley, R. A., Chen, H. Y., Swaroop, A., Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+development+of+rod+photoreceptors+in+retinal+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+by+supplementation+with+9-cis+retinal%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Accelerated development of rod photoreceptors in retinal organoids derived from human pluripotent stem cells by supplementation with 9-cis retinal.</a> STAR Protocols. 1 (1), 100033(2020).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+cone+photoreceptors+through+simultaneous+inhibition+of+BMP%2C+TGFbeta+and+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling.</a> Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Mellough, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IGF-1+signaling+plays+an+important+role+in+the+formation+of+three-dimensional+laminated+neural+retina+and+other+ocular+structures+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">IGF-1 signaling plays an important role in the formation of three-dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 33 (8), 2416-2430 (2015).</li>
<li>Susaimanickam, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+minicorneal+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).</li>
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Todos los autores no tienen conflicto de intereses o divulgaciones financieras.

Las hiPSC son una herramienta poderosa para estudiar el desarrollo de órganos y tejidos in vitro. Recapitular el fenotipo de la enfermedad diferenciando las hiPSC sanas versus específicas de la enfermedad hacia el linaje retiniano puede ayudar a obtener nuevos conocimientos sobre la fisiopatología de diferentes formas de distrofias retinianas hereditarias. Se han descrito y adoptado varios protocolos para la diferenciación in vitro de PSCs en tipos de células retinianas. La mayoría de ellos implican el ...

La retina es un tejido sensible a la luz presente en la parte posterior del ojo de los vertebrados que convierte las señales de luz en impulsos nerviosos por un fenómeno bioquímico conocido como la vía de fototransducción. Los impulsos nerviosos iniciales generados en las células fotorreceptoras de la retina se transducen a otras interneuronas retinianas y células ganglionares de la retina (CGR) y llegan a la corteza visual del cerebro, lo que ayuda en la percepción de la imagen y la respuesta visual.
Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), se estima que 1,5 millones de niños son ciegos, de los cuales 1 millón están en Asia. La distrofia retiniana hereditaria (IRD) es una enfermedad cegadora importante que afecta a 1 de cada 4.000 individuos en todo el mundo 1,2,3, mientras que la prevalencia de ceguera asociada con la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) oscila entre el 0,6% y el 1,1% en los países en desarrollo 4. Los IRD son causados por defectos genéticos heredados en más de 300 genes diferentes involucrados en el desarrollo y la función de la retina5. Tales cambios genéticos resultan en la interrupción de las funciones normales de la retina y la degeneración gradual de las células de la retina, a saber, las células fotorreceptoras y el epitelio pigmentado de la retina (EPR), lo que conduce a una pérdida severa de la visión y ceguera. Se ha logrado un enorme progreso en otras condiciones de cegamiento que involucran la córnea, el cristalino, etc. Sin embargo, las distrofias de retina y las atrofias del nervio óptico no tienen ninguna terapia probada hasta la fecha. Dado que una retina humana adulta no tiene células madre6, fuentes alternativas como las células madre embrionarias (CES) y las células madre pluripotentes inducidas derivadas del paciente (iPSC) pueden proporcionar un suministro ilimitado de los tipos de células deseados y son muy prometedoras para el desarrollo de organoides tisulares complejos necesarios para estudios de modelado de enfermedades in vitro y para el desarrollo de terapias regenerativas7, 8,9,10.
Varios años de investigación en retina han llevado a una mejor comprensión de los eventos moleculares que orquestan el desarrollo temprano de la retina. La mayoría de los protocolos para generar células retinianas y organoides 3D a partir de PSC tienen como objetivo recapitular estos eventos de desarrollo in vitro, cultivando las células en un complejo cóctel de factores de crecimiento y moléculas pequeñas para modular los procesos biológicos conocidos de manera gradual. Los organoides retinianos así generados están compuestos por las principales células de la retina: células ganglionares de la retina (CGR), interneuronas, fotorreceptores y epitelio pigmentado de la retina (EPR)11,12,13,14,15,16,17,18,19 . A pesar de los intentos exitosos de modelar IRD utilizando organoides retinianos, el requisito del complejo cóctel de factores de crecimiento y moléculas pequeñas durante la diferenciación y la eficiencia relativamente baja de la generación de organoides retinianos plantea un gran desafío con la mayoría de los protocolos. Incluyen principalmente la formación de cuerpos embrioides, seguida de su diferenciación gradual en linajes retinianos utilizando condiciones de cultivo complejas en diferentes etapas de desarrollo in vitro 20,21,22.
Aquí, se informa un método simplificado y robusto para desarrollar organoides neurorretinianos 3D complejos a partir de control sano y hiPSC específicas de la enfermedad retiniana. El protocolo descrito aquí utiliza la diferenciación directa de cultivos hiPSC casi confluentes sin necesidad de formación de cuerpo embrioide. Además, la complejidad del medio de cultivo se simplifica, lo que lo convierte en una técnica rentable y reproducible que puede ser fácilmente adoptada por los nuevos investigadores. Implica un sistema de cultivo híbrido que consiste en cultivos monocapa adherentes durante las primeras 4 semanas de diferenciación retiniana hasta la aparición de grupos primordiales de campo ocular (EFP) distintos y autoorganizados. Además, las islas neurorretinianas circulares dentro de cada EFP se recogen manualmente y se cultivan en cultivos en suspensión durante 1-2 semanas para preparar copas retinianas 3D de múltiples capas u organoides que consisten en precursores neurorretinianos proliferantes PAX6 + y CHX10 +. El cultivo prolongado de organoides retinianos en medio que contiene taurina de 100 μM durante otras 4 semanas dio lugar a la aparición de precursores fotorreceptores RCVRN+ y CRX+ y células maduras con extensiones rudimentarias similares a segmentos internos.

<table><tbody><tr><td>0,22 y micro; m Filtros de jeringa</td><td>TPP</td><td>99722&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 15 mL</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 50 mL</td><td>TPP</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 pocillos</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Chx10; Anticuerpo anti-CRX monoclonal</td><td>Santa Cruz</td><td>SC365519</td> de <td>ratón con dilución 1:50</td></tr><tr><td>; Anticuerpo anti-Recoverina anti-Recoverina monoclonal</td><td>Abcam</td><td>ab140603</td> de conejo con <td>dilución 1:300</td></tr>, <tr><td>Anticuerpo anti-Recoverina anti-Recoverina monoclonal de ratón</td><td>Abcam</td><td>ab3201</td> con <td>dilución 1:250</td></tr><tr><td>; Policlonal de conejo&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Millipore</td><td>AB5585</td><td>Dilución 1:300</td></tr><tr><td>B-27 Suplemento (50x), sin suero</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coplin Tarro (50 mL)</td><td>Tarson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Matrix Certified</td><td>hESC Corning</td><td></td><td></td>354277</tr><tr><td>CryoTubes</td><td>Thermo Fisher</td><td>V7884</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX suplemento (medio basal)</td><td>Thermo Fisher</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq ADN polimerasa</td><td>Thermo Fisher</td><td>EP0709</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeco' s Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 kit mediano</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>Etileno diamina tetraacético sal disódica de ácido disódico dihidratado (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Falcon No tratado con TC Placa de Petri tratada, 60 mm&nbsp;</td><td>Corning</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Fetal&nbsp; Bovinos&nbsp; Suero, calificado, Estados Unidos&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>GelDocXR+ con software de laboratorio de imágenes</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td>Sistema de documentación de gel de agarosa&nbsp;</td></tr><tr><td>GlutaMAX Suplemento</td><td>Thermo Fisher 35050061</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-Ratón IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td>dilución 1:300</td></tr><tr><td>Cabra anti-Ratón IgG (H+L), Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A11030</td><td>1:300 dilución</td></tr><tr><td>Cabra anti-Conejo IgG (H+L), Alexa Fluo 546</td><td>Invitrogen</td><td>A11035</td><td>dilución 1:300</td></tr><tr><td>Cabra anti-Conejo- IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>dilución 1:300</td></tr><tr><td>HistoCore MULTICUT</td><td>Leica</td><td>Para el corte KnockOut</td>Serum <td></td></tr><tr><td>Replacement</td><td>Thermo Fisher</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-Acsórbico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A92902</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solución de Aminoácidos No Esenciales (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>N2 suplemento (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Para cuantificar el ARN</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Qualigens</td><td>23995</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur, 9 pulgadas, No Estériles, Desenchufadas</td><td>Corning</td><td>7095D-9</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo recombinante Anti-Otx2 , monoclonal de conejo</td><td>Abcam</td><td>ab183951</td><td>dilución 1:300</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-PAX6 recombinante; Monoclonal de conejo</td><td>Abcam</td><td>ab195045</td><td>dilución 1:300</td></tr><tr><td>Anticuerpo recombinante anti-RPE65, monoclonal de conejo</td><td>Abcam</td><td>ab231782</td><td>dilución 1:300</td></tr><tr><td>Proteína recombinante de Noggin humana</td><td>R& D Systems</td><td>6057-NG</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas 10 mL</td><td>TPP</td><td>94010</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas 5 mL</td><td>TPP</td><td>94005</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sodio Tribásico dihidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>Starfrost ( recubierto de silano) portaobjetos microscópicos</td><td>Knittel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Sistema de síntesis de primera cadena</td><td>Thermo Fisher</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Sistema de síntesis de primera cadena para RT-PCR</td><td>Invitrogen</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol&nbsp; Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Medio de montaje antidecoloración con DAPI&nbsp;</td><td>Laboratorios de vectores</td><td>H-1200&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectina</td><td>Thermo Fisher</td><td>A27940</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 diclorhidrato (inhibidor de la rho-quinasa)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Microscopio confocal</td></tr></tbody></table>

generación de organoides retinianos a partir de células madre pluripotentes sanas y específicas de la enfermedad retiniana inducida por humanos

Generation of Retinal Organoids from Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Las células madre pluripotentes pueden generar organoides tisulares complejos que son útiles para estudios de modelado de enfermedades in vitro y para desarrollar terapias regenerativas. Este protocolo describe un método más simple, robusto y gradual para generar organoides retinianos en un sistema de cultivo híbrido que consiste en cultivos monocapa adherentes durante las primeras 4 semanas de diferenciación retiniana hasta la aparición de grupos primordiales de campo ocular (EFP) distintos y autoorganizados. Además, las islas neurorretinianas en forma de rosquilla, circulares y translúcidas dentro de cada EFP se recogen manualmente y se cultivan bajo suspensión utilizando placas de cultivo no adherentes en un medio de diferenciación retiniana durante 1-2 semanas para generar copas ópticas 3D multicapa (OC-1M). Estos organoides retinianos inmaduros contienen precursores retinianos multipotentes proliferantes PAX6+ y ChX10+. Las células precursoras se autoensamblan linealmente dentro de los organoides y aparecen como estrías radiales distintas. A las 4 semanas después del cultivo en suspensión, los progenitores retinianos sufren un paro postmitótico y diferenciación de linaje para formar organoides retinianos maduros (OC-2M). Los precursores comprometidos con el linaje fotorreceptor se desarrollan dentro de las capas más externas de los organoides retinianos. Estas células fotorreceptoras CRX+ y RCVRN+ maduran morfológicamente para mostrar extensiones similares a segmentos internos. Este método se puede adoptar para generar organoides retinianos utilizando células madre embrionarias humanas (hESCs) y células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). Todos los pasos y procedimientos están claramente explicados y demostrados para garantizar la replicabilidad y para aplicaciones más amplias en ciencia básica e investigación traslacional.

La diferenciación de hiPSCs en linajes oculares se logra cultivando las células en diferentes cócteles de medio de cultivo que contienen suplementos y factores de crecimiento en pasos secuenciales en diferentes puntos de tiempo, como se describe en la Figura 1. Los cultivos de hiPSC se mantienen en medio Essential 8, el medio pluripotente de mantenimiento de células madre. Una vez que alcanzan una confluencia del 70%-80% (Figura 2A), el medio se reemplaza con el...

Este protocolo describe un método eficiente para diferenciar las hiPSC en grupos de campo ocular y generar organoides neurorretinianos utilizando condiciones de cultivo simplificadas que involucran sistemas de cultivo adherentes y en suspensión. Otros tipos de células oculares, como el EPR y el epitelio corneal, también se pueden aislar de campos oculares maduros en cultivos de retina.

Generación de organoides retinianos a partir de células madre pluripotentes sanas y específicas de la enfermedad retiniana inducida por humanos

Pluripotent stem cells can generate complex tissue organoids that are useful for in vitro disease modeling studies and for developing regenerative ...

Este protocolo describe un método simple y eficiente para diferenciar las IPC humanas en organoides neuroretinianos tridimensionales complejos para investigación y aplicaciones regenerativas. Esta técnica involucra cultivos adherentes y en suspensión, lo que permite la recolección selectiva y el enriquecimiento tanto de organoides retinianos como de células RP. Puede ofrecer un suministro viable y regular de fuentes celulares para desarrollar terapias basadas en células para enfermedades degenerativas de la retina.Tales organoides retinianos derivados de células madre y células RPE son útiles como modelos in vitro para estudiar el desarrollo ocular y las enfermedades retinianas hereditarias. Este método puede ser fácilmente replicado por laboratorios de investigación que ya están familiarizados con el manejo de cultivos humanos IPSC. La demostración visual apoya en gran medida la identificación de los campos oculares y el aislamiento de las copas neurorretinianas en función de su posicionamiento espacial y características morfológicas.Para comenzar, aspirar el medio gastado de 70 a 80% de cultivos humanos confluentes de IPSC en placas de seis pocillos. Agregue PBS a los pocillos, revuélvalos y aspire el tampón de lavado. Luego agregue un mililitro de solución de disociación celular o CDS a cada pocillo e incube la placa a 37 grados centígrados durante cinco a siete minutos hasta que las células se redondeen.Aspire el CDS y recoja la suspensión celular en un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Gire el tubo a 1.000 RPM durante cuatro minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 1,2 mililitros de Essential 8 medium.Dispense 200 microlitros de la suspensión celular en cada pocillo de una placa de seis pocillos recubierta de matriz que contenga 1,5 mililitros de medio de cultivo IPSC y 10 micromolares Y27632. Después de 12 a 24 horas, retire el medio gastado y agregue el medio de ascensión completa precalentado sin Y27632 para mantener los cultivos. Cambiar el medio de cultivo cada 24 horas hasta que los cultivos alcancen el 70 al 80% de confluencia.En el día cero, aspire el medio de mantenimiento IPSC humano y agregue un medio de inducción de diferenciación que contenga un nanogramo por mililitro BFGF y un nanogramo por mililitro Noggin a la placa de seis pocillos. Incubar las células a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono al 5%. El primer día, aspire el medio gastado y agregue un medio de inducción de diferenciación que contenga un nanogramo por mililitro BFGF y 10 nanogramos por mililitro Noggin.Incubar las células de nuevo a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono al 5%. En el día dos y tres, retire el medio gastado y agregue un medio de inducción de diferenciación que contenga 10 nanogramos por mililitro de Noggin. Después de agregar dos mililitros por pozo mediano a una placa de seis pocillos, incubar las células a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono al 5% y cambiar el medio cada 24 horas.En el cuarto día, retire el medio gastado y agregue el medio de diferenciación retiniana o RDM. Siga el mismo procedimiento para agregar dos mililitros por pozo mediano a una placa de seis pocillos e incubar los cultivos. Cambia el medio todos los días.Alrededor de los días 14 y 18, observe los cultivos bajo un microscopio con un aumento de 10X para la aparición de dominios en forma de roseta neural que consisten en progenitores tempranos del campo ocular. Alrededor de los días 21 y 28, observe los cultivos bajo un microscopio con un aumento de 4X y 10X para observar la aparición de EFP distintos autoorganizados con una isla central de estructuras neuroretinianas circulares 3D rodeadas de excrecencias contiguas de epitelio neuro y epitelio de superficie ocular. Tome una pipeta Pasteur estéril y sostenga la base en una mano y la punta capilar en la otra.Esterilice a la llama y caliente la región cerca de la mitad de la punta capilar con movimientos de rotación hasta que el vidrio se vuelva flexible. Luego aléjese de la llama y tire rápidamente de la punta capilar hacia afuera para crear una punta capilar fina con una luz cerrada. Sostenga la punta fina horizontalmente frente a la llama y pásela rápidamente a través de la llama en un movimiento hacia afuera para crear un gancho suave o una punta capilar en forma de L.Bajo un microscopio estéreo, elija manualmente las copas neuroretinianas bien formadas de los EFP individuales utilizando la zona de curvatura externa lisa del gancho capilar como una cuchara fina. En los días 25 y 30, añadir cuatro mililitros de medio de diferenciación retiniana precalentado en una placa de 60 milímetros de baja fijación al cultivo y mantener las copas retinianas para generar organoides retinianos 3D. Esto debe hacerse antes de cosechar las copas neuro retinianas.Coloque una micropipeta de un milímetro para aspirar 100 microlitros y use micropuntas de un mililitro con aberturas de diámetro ancho para aspirar y transferir las copas retinianas flotantes a los platos frescos de cultivo de baja adherencia preparados anteriormente. Mantener las copas retinianas en RDM como cultivos de suspensión no adherentes e incubarlas a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono al 5%. En los días 30 y 45, siguiendo un método de alimentación parcial, retire la mitad del volumen del medio gastado y reemplácelo con un volumen igual de medio fresco.En los días 45 y 60, cultivar los organoides retinianos durante otras dos semanas en RDM que contienen 100 taurina micromolar para apoyar una mejor supervivencia y diferenciación del linaje de los progenitores neuroretinianos y el desarrollo de tipos de células retinianas maduras. Los organoides retinianos se caracterizan en diferentes etapas de maduración para la expresión de varios marcadores progenitores retinianos mediante RT-PCR e inmunohistoquímica. Los resultados de la RT-PCR confirmaron la inducción y expresión de marcadores neuroretinianos en organoides retinianos de un mes de edad y organoides retinianos de dos meses de edad.Aquí se muestran las imágenes confocales de secciones inmunomarcadas de organoides retinianos inmaduros que utilizan anticuerpos contra los marcadores progenitores neuroretinianos Chx10, PAX6 y Otx2, y organoides retinianos maduros que utilizan anticuerpos contra los marcadores precursores fotorreceptores recoverin y CRX. La marcada capa más externa de los organoides retinianos con células fotorreceptoras diferenciadoras se amplía y se muestra en estas imágenes. Las rudimentarias extensiones internas en forma de segmento están marcadas por flechas blancas.Los grupos de EFP con la copa neuroretiniana en el centro y las excrecencias migratorias de RPE muestran pigmentación a lo largo de los bordes delanteros. Aquí se muestran excrecencias epiteliales pigmentadas bien diferenciadas de múltiples EFP alrededor de la isla neuroretiniana. Un mayor aumento de un EFP muestra la zona migratoria de los progenitores del EPR y el epitelio de la superficie ocular que rodea una copa neuroretiniana.Aquí se muestran cultivos adherentes extendidos que desarrollaron monocapas de células RPE inmaduras que contienen células pigmentadas y no pigmentadas. Los cultivos monocapa de células RPE completamente maduras y pigmentadas muestran morfología de adoquines en el día 60. Las células RPE que expresan PAX6, MITF y RPE65 se muestran en esta figura.Estas imágenes representan EFPs con agregados anormales de progenitores retinianos con laminación distorsionada y ausencia de estrías. EFP con la copa neuroretiniana en miniatura, pero que carece de la zona circundante del EPR y el epitelio de la superficie ocular se muestran en esta figura. La imagen representativa muestra agregados neuroretinianos irregulares formados en el cultivo en suspensión.Es muy importante comenzar el proceso de diferenciación utilizando cultivos de IPC de crecimiento casi confluentes para lograr una inducción eficiente de los campos oculares dentro de tres a cuatro semanas. Los organoides retinianos y las células del EPR generadas a partir de IPC normales y específicas del paciente se pueden utilizar como modelos de enfermedades de la retina y para probar nuevos fármacos terapéuticos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

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Generación de organoides retinianos a partir de células madre pluripotentes sanas y específicas de la enfermedad retiniana inducida por humanos (Video) | JoVE Journal

Generación de organoides retinianos a partir de células madre pluripotentes sanas y específicas de la enfermedad retiniana inducida por humanos

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