Name: Imágenes de células vivas de globos intactos ex vivo utilizando un novedoso soporte impreso en 3D (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T14:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: Aprende a obtener imágenes de células vivas en córneas heridas utilizando un soporte impreso en 3D. Este método permite monitorear señalización de calcio y migración celular en tiempo real manteniendo la viabilidad del tejido ocular.

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Nos gustaría agradecer a los NIH por el siguiente apoyo de subvención: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) y 5T32GM008541-24 (KS). También nos gustaría reconocer al Fondo de Investigación del Ojo de los Leones de Massachusetts y al Fondo de Trasplante de Córnea de Nueva Inglaterra.

Los procedimientos que involucran sujetos animales fueron aprobados por la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología para el Uso de Animales en Cuidados Oftalmológicos e Investigación de la Visión y el protocolo IACUC de la Universidad de Boston (201800302).
1. Diseño de los soportes impresos en 3D y la barra de cubierta
<ol><li>Diseñe los soportes impresos en 3D y la barra de cubierta que representan el diámetro promedio de los globos del ratón e imprima en 3D el diseño (Figura 1A, B).</li>
	<li>Mantenga el diámetro de la pared interna del soporte ligeramente más grande que el diámetro promedio del globo para tener en cuenta los diferentes tamaños de ratones individuales. Mantenga la altura del soporte en aproximadamente la mitad del diámetro del globo, asegurando un ajuste ajustado del globo cuando se asegura con la barra de cubierta impresa en 3D.</li>
	<li>Ajuste el tamaño de la barra de cubierta del soporte a la longitud del diámetro exterior del soporte con un ancho que sea de 1/4 a 1/2 del diámetro del soporte. La barra de cobertura está dimensionada para permitir el acceso al globo cuando se asegura en el soporte para la hidratación y la extracción del ojo al final del experimento.</li>
	<li>Imprima el soporte y la barra de cubierta.</li>
</ol>2. Recogida de muestras
<ol><li>Eutanasia en ratones (se utilizaron ratones machos C57BL/6 de 9-12 semanas y 27 semanas de edad para este estudio) utilizando protocolos establecidos de acuerdo con las directrices institucionales. Para este protocolo, realice la eutanasia con dióxido de carbono seguida de la decapitación.</li>
	<li>Retire la cabeza del ratón y colóquela inmediatamente sobre hielo para preservar la viabilidad del tejido. Nuclee los globos usando herramientas de disección mientras previene el daño tisular.</li>
	<li>Proptose el globo con pinzas. Recorte el nervio óptico con tijeras de disección justo debajo de donde lo sostienen las pinzas. NOTA: Para mayor precaución, realice los siguientes pasos en una campana de flujo laminar.</li>
	<li>Incubar los globos en 2 ml de medio en una placa de cultivo celular p35 que incluya un indicador de calcio y/o tinción de membrana celular durante 1 h en una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C con condiciones de poca luz. Asegúrese de que los globos estén sumergidos en el medio de tinción para una tinción uniforme.<ol><li>Para los experimentos realizados aquí, utilice el indicador de calcio, Fluo4-AM (1:100)2, y la contratificación de la membrana celular, tinción de membrana plasmática de color rojo intenso (1:10.000)2, con una concentración final de 1% (v/v) de DMSO y 0,1% (p/v) de ácido plurónico en 2 mL de medio libre de suero de queratinocitos (KSFM) con los siguientes suplementos de crecimiento: 25 μg/ml de extracto hipofisario bovino, 0,02 nM factor de crecimiento epidérmico, 0,3 mM CaCl2 y penicilina-estreptomicina (100 unidades/ml y 100 μg/ml, respectivamente). NOTA: Las condiciones y tiempos de incubación son variables dependiendo del indicador de calcio, el tipo de tejido y el volumen de la muestra. Cuando se usa ácido plurónico, se recomienda precaución ya que hace que el tejido sea permeable. Este protocolo requiere un 10% de ácido plurónico. Se ha determinado experimentalmente que las concentraciones más bajas de ácido plurónico son ineficaces, y las concentraciones más altas corren el riesgo de dañar el tejido.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Preparación de portamuestras
<ol><li>Adhiera los soportes a un cubreobjetos limpio con fondo de vidrio con pegamento que no se haya utilizado anteriormente. El pegamento utilizado en este protocolo proviene de contenedores de un solo uso para garantizar la esterilidad y se usa un recipiente nuevo sin abrir cada vez.</li>
	<li>Lave el soporte en etanol al 70%. Coloque pegamento en el soporte y adhiera el soporte al cubreobjetos inferior de vidrio. Asegúrese de que no haya pegamento dentro del área interna del soporte, ya que el pegamento puede fluorescer, lo que complica las imágenes.</li>
	<li>Espere hasta que el pegamento se solidifique. Confirme que el soporte esté seguro contra el cubreobjetos. NOTA: Se utilizaron placas celulares P35 con cubreobjetos con fondo de vidrio para los experimentos presentados en este manuscrito. Otras diapositivas y / o placas con fondo de vidrio pueden ser sustituidas según las necesidades del experimento.</li>
</ol>4. Heridas en los globos oculares
<ol><li>Retire los globos de la solución de tinción con goteros estériles, teniendo cuidado de evitar daños tisulares en la región de interés. Lave los globos durante 5 minutos a temperatura ambiente con solución salina estéril tamponada con fosfato para eliminar el exceso de mancha, y coloque los globos en el medio para transportarlos al microscopio.</li>
	<li>Enrolle los globos con una aguja estéril de 25 G en la región de interés.<ol><li>Con un gotero estéril, levante y sostenga el globo desde la parte posterior del ojo. Esto mantendrá el globo estable, evitará que ruede y permitirá que se hagan heridas consistentes. Usando esta configuración, el nervio óptico estará dentro de la boquilla del gotero y la córnea estará mirando hacia afuera.</li>
		<li>Para una herida por rasguño, mueva suavemente una aguja estéril de 25 G a través de la córnea expuesta. Para una herida punzante, presione suavemente la aguja directamente en la córnea central. Asegúrese de que la herida no perfore la córnea. NOTA: Omita este paso si no se requiere una respuesta de herida o un entorno herido para el experimento. Estudios previos han demostrado que tanto las heridas por rasguños como las heridas punzantes en córneas murinas realizadas con este método son consistentes tanto en diámetro como en profundidad10. La confirmación de las dimensiones de la herida entre globos independientes se realizó mediante un análisis de región de interés.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Colocación de la muestra en el soporte
<ol><li>Coloque la córnea o la región limbal sobre el cubreobjetos en el área interna del soporte y estabilice utilizando la cubierta impresa en 3D (Figura 1C-H).</li>
	<li>Confirme que el globo está colocado correctamente y que el sitio de interés está en contacto con el cubreobjetos de vidrio. Una vez que el globo se ha colocado en el soporte, no intente quitar el globo, ya que esto puede causar daño tisular.</li>
	<li>Adhiera la cubierta impresa en 3D al soporte con pegamento, asegurando la estabilización. Asegúrese de que la barra de cubierta se adhiera al soporte y no al globo terráqueo. NOTA: El área que se va a fotografiar se coloca hacia abajo porque el protocolo está escrito para su uso en un microscopio invertido. El protocolo se puede adaptar para microscopios verticales utilizando soportes con un radio interior más pequeño y la eliminación de la barra de cubierta. Esto resultará en una menor estabilización del globo.</li>
</ol>6. Imágenes de muestra
<ol><li>Encienda el microscopio y la cámara ambiental y verifique que la cámara esté humidificada. Ajuste la cámara ambiental a 35 °C y 5% deCO2 durante la duración del experimento. NOTA: Los microscopios con cámaras ambientales son preferibles para este procedimiento para prevenir la deshidratación y mantener el globo a temperaturas óptimas, pero no son necesarios.</li>
	<li>Coloque el cubreobjetos, el soporte y el globo estabilizado en la etapa del microscopio dentro de la cámara ambiental e imagen utilizando técnicas de imágenes de células vivas9.</li>
	<li>Pipetear medios de crecimiento adicionales en el cubreobjetos para evitar la deshidratación y mantener la viabilidad del tejido. Asegúrese de que haya suficiente medio en el pozo para cubrir el globo en el soporte. Dependiendo de la duración de la imagen, agregue un medio fresco cuando sea necesario durante todo el experimento.</li>
	<li>Comience los experimentos utilizando técnicas y protocolos de imágenes de células vivas. Utilice ajustes de láser de baja potencia para preservar el tejido y prevenir el daño tisular en experimentos de larga duración. Utilice objetivos apropiados para largas distancias de trabajo. Los experimentos en este manuscrito se realizaron utilizando un objetivo 20x. NOTA: La potencia y ganancia del láser, la duración experimental, la ubicación y el plano de imagen son variables dependiendo de los parámetros experimentales. Los experimentos de imágenes en globos intactos que van de 1 h a 4 h de duración se han realizado con éxito en publicaciones anteriores10.</li>
	<li>Grabe y guarde los datos en el formato de archivo preferido. El software utilizado por el microscopio produce archivos .czi para el registro de datos.</li>
	<li>Deseche los globos según los protocolos institucionales estándar al final del protocolo.</li>
</ol>

<ol><li>Kneer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fat+diet+induces+pre-type+2+diabetes+with+regional+changes+in+corneal+sensory+nerves+and+altered+P2X7+expression+and+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization.</a> Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+Ca2%2B+mobilizations%3A+A+quantitative+approach+to+predict+their+importance+in+cell-cell+communication+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sustained Ca2+ mobilizations: A quantitative approach to predict their importance in cell-cell communication and wound healing.</a> PLoS One. 14 (4), 0213422(2019).</li>
<li>Stepp, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wounding+the+cornea+to+learn+how+it+heals%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Wounding the cornea to learn how it heals.</a> Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).</li>
<li>Klepeis, V. S., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randal, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factors+but+not+gap+junctions+play+a+role+in+injury-induced+Ca2%2B+waves+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 114 (23), 4185-4195 (2001).</li>
<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+changes+in+Ca%282%2B%29+mobilization+and+protein+phosphorylation+implicated+in+impaired+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced changes in Ca(2+) mobilization and protein phosphorylation implicated in impaired wound healing.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (10), 972-985 (2014).</li>
<li>Boucher, I., Rich, C., Lee, A., Marcincin, A., Trinkaus-Randall, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P2Y2+receptor+mediates+the+epithelial+injury+response+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">The P2Y2 receptor mediates the epithelial injury response and cell migration.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (2), 411-421 (2010).</li>
<li>Awal, M. R., Wirak, G. S., Gabel, C. V., Connor, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collapse+of+global+neuronal+states+in+Caenorhabditis+elegans+under+isoflurane+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Collapse of global neuronal states in Caenorhabditis elegans under isoflurane anesthesia.</a> Anesthesiology. 133 (1), 133-144 (2020).</li>
<li>Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+gentle+hydrogel+encapsulation+of+living+organisms+enables+long-term+microscopy+over+multiple+hours%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours.</a> Communications Biology. 1, 73(2018).</li>
<li>Rhodes, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pannexin1%3A+Role+as+a+sensor+to+injury+is+attenuated+in+pretype+2+corneal+diabetic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Cellular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Pannexin1: Role as a sensor to injury is attenuated in pretype 2 corneal diabetic epithelium.</a> Analytical Cellular Pathology. 2021, 4793338(2021).</li>
<li>Segars, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+dependent+changes+in+corneal+epithelial+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Age dependent changes in corneal epithelial cell signaling.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 886721(2022).</li>
<li>Xu, P., Londregan, A., Rich, C., Trinkaus-Randall, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+epithelial+and+stromal+corneal+stiffness+occur+with+age+and+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Changes in epithelial and stromal corneal stiffness occur with age and obesity.</a> Bioengineering. 7 (1), 14(2020).</li>
<li>Minns, M. S., Teicher, G., Rich, C. B., Trinkaus-Randall, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinoreceptor+P2X7+regulation+of+Ca%282%2B%29+mobilization+and+cytoskeletal+rearrangement+is+required+for+corneal+reepithelialization+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Purinoreceptor P2X7 regulation of Ca(2+) mobilization and cytoskeletal rearrangement is required for corneal reepithelialization after injury.</a> The American Journal of Pathology. 186 (2), 285-296 (2016).</li>
<li>Tadvalkar, G., Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+euthanasia+and+enucleation+on+mouse+corneal+epithelial+axon+density+and+nerve+terminal+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">The impact of euthanasia and enucleation on mouse corneal epithelial axon density and nerve terminal morphology.</a> The Ocular Surface. 18 (4), 821-828 (2020).</li>
</ol>

No tenemos conflictos de intereses que revelar.

Este protocolo describe una técnica de imagen de células vivas que utiliza un soporte impreso en 3D para estabilizar e inmovilizar los ojos intactos de los animales. Está diseñado para eludir varias desventajas significativas reconocidas con protocolos previos de imágenes de células vivas de tejido corneal ex vivo . Este protocolo ofrece muchas ventajas para la obtención de imágenes de células vivas de globos intactos. Reduce significativamente el daño tisular innecesario que podría interferir con la respuesta d...

Córnea La córnea es una estructura transparente y avascular que cubre la superficie anterior del ojo que refracta la luz para permitir la visión y protege el interior del ojo del daño. Como la córnea está expuesta al medio ambiente, es susceptible al daño tanto por causas mecánicas (rascado) como por infección. Una lesión corneal en un paciente sano generalmente se cura dentro de 1-3 días. Sin embargo, en pacientes con afecciones subyacentes, incluida la deficiencia de células madre limbares y la diabetes tipo II, el proceso de cicatrización de la herida corneal puede prolongarse en gran medida1. Como la córnea está altamente inervada, estas úlceras corneales que no cicatrizan y las erosiones corneales recurrentes son muy dolorosas y disminuyen en gran medida la calidad de vida de los pacientes que las experimentan1.
Señalización celular Cuando una córnea sana se lesiona, los eventos de señalización de calcio en las células adyacentes a la herida preceden y provocan la migración celular al lecho de la herida, donde cierran la lesión sin riesgo de cicatrización 2,3. Estos eventos de señalización han sido bien caracterizados en modelos de cultivo de células epiteliales corneales utilizando imágenes de células vivas2. Los experimentos preliminares demuestran significativamente más señalización de calcio después de una lesión en células no diabéticas en comparación con las células diabéticas. Sin embargo, la caracterización de los eventos de señalización celular en globos ex vivo ha demostrado ser un desafío técnico.
Imágenes de células vivas Estudios previos han registrado con éxito eventos de señalización de calcio a partir de modelos de cultivo celular in vitro de cicatrización de heridas corneales 4,5,6. El desarrollo de una metodología para producir imágenes de alta calidad de estos eventos de señalización en tejido ex vivo es de gran interés porque permitiría el estudio de estos eventos en un sistema más complejo y real. Los enfoques anteriores han implicado la disección de la córnea seguida de la inmovilización en un gel PEG inducido por UV 7,8,9. La inmovilización es un paso esencial pero desafiante cuando se trabaja con tejido vivo, ya que debe permanecer viable e hidratado durante todo el transcurso del experimento. Además, la inmovilización no debe dañar el tejido. Mientras que la solución de PEG inmovilizó el tejido, la resolución y la calidad de las imágenes producidas no fueron consistentes. Por lo tanto, los soportes impresos en 3D se desarrollaron para inmovilizar globos intactos para producir imágenes de mayor calidad con menos riesgo de daño tisular.
El enfoque Se desarrolló un soporte impreso en 3D único para inmovilizar globos intactos ex vivo para obtener imágenes de células vivas. Este soporte evita el daño de dos fuentes principales: permite obtener imágenes de un globo enucleado sin la necesidad de diseccionar la córnea y elimina la exposición a la luz UV. Sin estas fuentes de daño, las imágenes obtenidas representaron con mayor precisión la respuesta a las lesiones por rasguños realizadas experimentalmente. Además, el soporte impreso en 3D se calibró con las dimensiones precisas del ojo murino. Esto proporcionó un ajuste mucho mejor que la inmovilización en la solución PEG, lo que llevó a una imagen de mayor calidad en objetivos de menor potencia debido a la disminución del movimiento del tejido. Una barra de cubierta unida a la parte superior del soporte asegura que el globo permanezca inmóvil durante toda la duración del experimento y que no haya desplazamiento del globo cuando se aplica un medio de crecimiento para mantener la hidratación y la viabilidad. La capacidad de imprimir el soporte a dimensiones precisas también nos permite generar un ajuste óptimo para ojos murinos de diferentes tamaños debido a la edad o estado de la enfermedad. Esta tecnología se puede aplicar más ampliamente para desarrollar soportes para los ojos de diferentes especies en función de sus dimensiones.

<table><tbody><tr><td>1.75 plástico de ácido poliláctico (PLA) azul</td><td>Creality (Shenzen, China)</td><td>N/A</td><td>Material para el soporte</td></tr><tr><td>Plato de 35 mm, cubreobjetos n.º 1.5, diámetro de vidrio de 14 mm, recubierto de poli-D-lisina</td><td>MatTek Corporation (Ashland, MA)</td><td>P35GC-1.5-14-C</td><td>Pozo para imágenes.&nbsp;</td></tr><tr><td>Software Autodesk Fusion 360</td><td>Autodesk (San Rafael, CA).</td><td>N/A</td><td>Software utilizado para la impresión de los soportes.</td></tr><tr><td>BD 25 G 7/8 agujas estériles de un solo uso 100 agujas/caja</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)</td><td>305124</td><td>Para heridas inducidas experimentalmente en los globos</td></tr><tr><td>CellMask DeepRed</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td><td>C10046</td><td>Contratinción de membrana celular. Indicador de calcio. Concentración 1:10.000 con una concentración final de 1% (v/v) de DMSO y 0,1% (p/v) de ácido plurónico</td></tr><tr><td>Complete Home Super Glue</td><td>Walgreens (Deerfield, IL)</td><td>N/A</td><td>Para fijar el soporte al pocillo de imágenes</td></tr><tr><td>Impresora 3D Ender 3 Pro&nbsp;</td><td>Creality (Shenzen, China)</td><td>N/A</td><td>Para imprimir el soporte</td></tr><tr><td>FIJI/</td><td>ImageJ ImageJ (Bethesda, MD)</td>Número de <td>licencia: GPL2</td><td>Software utilizado para confirmar la consistencia de la profundidad y el diámetro de la bobina entre globos independientes mediante el análisis de la región de interés</td></tr><tr><td>Fluo-4</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td><td>F14201</td><td>Indicador de calcio. Concentración 1:100 con una concentración final de 1% (v/v) de DMSO y 0,1% (p/v) de ácido plurónico</td></tr><tr>Medio <td>sin suero de queratinocitos</td><td>Gibco (Waltham, MA)</td><td>17005042</td><td>25 mg/mL de extracto pituitario bovino, 0,02 nM de EGF, 0,3 mM de CaCl2 y penicilina-estreptomicina (100 unidades/mL, 100 y micro; g/mL, respectivamente) añadidos al medio</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Corning, Medlabtech (Manassas, VA)</td><td>21-040-CV</td><td>Se utiliza para lavar el exceso de tinción de las córneas antes de obtener imágenes</td></tr><tr><td>Microscopio Zeiss Confocal 880 con AiryScan</td><td>Zeiss (Thornwood, NY)</td><td>N/A Se</td><td>utilizó un objetivo de aumento de 20x</td></tr></tbody></table>

imágenes de células vivas de globos intactos ex vivo utilizando un novedoso soporte impreso en 3d

Live-Cell Imaging of Intact Ex Vivo Globes Using a Novel 3D Printed Holder

La cicatrización de heridas epiteliales corneales es un proceso migratorio iniciado por la activación de receptores purinérgicos expresados en las células epiteliales. Esta activación da como resultado eventos de movilización de calcio que se propagan de célula a célula, que son esenciales para iniciar la motilidad celular en el lecho de la herida, promoviendo la cicatrización eficiente de la herida. El laboratorio de Trinkaus-Randall ha desarrollado una metodología para obtener imágenes de la respuesta de cicatrización de heridas corneales en globos murinos ex vivo en tiempo real. Este enfoque implica la enucleación de un globo intacto de un ratón que ha sido sacrificado según los protocolos establecidos e inmediatamente la incubación del globo con un tinte indicador de calcio. Una contratinción que tiñe otras características de la célula se puede aplicar en esta etapa para ayudar con las imágenes y mostrar puntos de referencia celulares. El protocolo funcionó bien con varios colorantes de células vivas diferentes utilizados para la contratinción, incluida la actina SiR para teñir la actina y la tinción de la membrana plasmática de color rojo intenso para teñir la membrana celular. Para examinar la respuesta a una herida, el epitelio corneal se lesiona con una aguja de 25 G, y los globos se colocan en un soporte impreso en 3D. Las dimensiones del soporte impreso en 3D están calibradas para garantizar la inmovilización del globo durante toda la duración del experimento y se pueden modificar para adaptarse a ojos de diferentes tamaños. Las imágenes de células vivas de la respuesta de la herida se realizan continuamente a varias profundidades en todo el tejido a lo largo del tiempo utilizando microscopía confocal. Este protocolo nos permite generar imágenes de alta resolución y calidad de publicación utilizando un objetivo de aire 20x en un microscopio confocal. Otros objetivos también se pueden utilizar para este protocolo. Representa una mejora significativa en la calidad de las imágenes de células vivas en globos murinos ex vivo y permite la identificación de nervios y epitelio.

Este protocolo se ha utilizado para producir consistentemente datos e imágenes con calidad de publicación10. Las imágenes obtenidas representan una mejora significativa en comparación con los enfoques anteriores (Figura 2). Usando el soporte impreso en 3D, las imágenes se pueden capturar a través de las capas de la córnea, y se puede observar la movilización de calcio en diferentes planos z (Figura 3). Este enfoque se ha utilizado para co...

El presente trabajo describe un novedoso protocolo experimental que utiliza un soporte impreso en 3D para permitir imágenes de células vivas de alta resolución de globos enucleados. A través de este protocolo, la actividad de señalización de calcio celular en el epitelio corneal herido de globos ex vivo se puede observar en tiempo real.

Imágenes de células vivas de globos intactos ex vivo utilizando un novedoso soporte impreso en 3D

Corneal epithelial wound healing is a migratory process initiated by the activation of purinergic receptors expressed on epithelial cells. This activation ...

El soporte impreso en 3D utilizado en este protocolo nos permite monitorear la señalización celular a corto plazo y los eventos de migración celular a largo plazo en córneas heridas en tiempo real. Al mantener el globo intacto, viable e inmóvil, este protocolo produce imágenes en vivo de alta calidad de las células corneales, incluidos el epitelio y los nervios. El soporte impreso en 3D podría modificarse fácilmente para globos terráqueos de varios tamaños y especies.También podemos orientar los ojos de manera diferente para obtener imágenes de otras regiones o realizar experimentos de nano indentación. Para empezar, después de retirar la cabeza de un ratón sacrificado, colóquelo inmediatamente sobre hielo para preservar la viabilidad del tejido. Luego enuclea los globos apoyándolos, usando pinzas.Y recorte el nervio óptico usando tijeras de disección justo debajo de donde lo sostienen las pinzas. Incubar los globos en dos mililitros del medio en una placa de cultivo celular P-35, incluyendo un indicador de calcio y/o tinción de membrana celular durante una hora en una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono con condiciones de poca luz, asegurando que los globos estén sumergidos en el medio de tinción para una tinción uniforme. Para adherir los soportes a un deslizamiento de cubierta inferior de vidrio limpio, lave el soporte en etanol al 70% y coloque pegamento en el soporte.Luego, adhiera el soporte al deslizamiento de la cubierta inferior de vidrio, asegurándose de que no haya pegamento dentro del área interna del soporte, ya que el pegamento puede fluorescer, lo que complica las imágenes. Después de que el pegamento se solidifique, confirme que el soporte esté seguro contra el cubreobjetos. Retire los globos de la solución de tinción utilizando los goteros estériles, teniendo cuidado de evitar daños tisulares en la región de interés.Lave los globos durante cinco minutos a temperatura ambiente, utilizando solución salina tamponada con fosfato estéril para eliminar el exceso de manchas y coloque los globos en el medio para transportarlos al microscopio. Para enrollar los globos con una aguja estéril de calibre 25 en la región de interés, levante y sostenga el globo de la parte posterior del ojo, usando un gotero estéril para mantener el globo estable y evitar que ruede. Para una herida por rasguño, mueva suavemente una aguja estéril de calibre 25 a través de la córnea expuesta o presione suavemente la aguja directamente en la córnea central para una herida punzante, asegurándose de que la herida no perfore la membrana basal corneal.Coloque la córnea o la región limbal sobre el cubreobjetos en el área interna del soporte, mientras confirma que el globo está colocado correctamente y que el sitio de interés está en contacto con el cubreobjetos de vidrio. Estabilizar utilizando la cubierta impresa en 3D adherida al soporte, utilizando pegamento. Y no intente extraer el globo, ya que esto puede causar daño tisular.Encienda el microscopio y ajuste la cámara ambiental a 35 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono y verifique la cámara humidificada. Coloque el soporte de la cubierta y el globo estabilizado en la etapa del microscopio dentro de la cámara ambiental y la imagen, utilizando técnicas de imágenes de células vivas. Mediante el veterinario, aplique medios de crecimiento adicionales en el cubreobjetos para evitar la deshidratación y mantener la viabilidad del tejido, asegurando que haya suficiente medio en el pozo para cubrir el globo en el soporte.Comience los experimentos utilizando técnicas de imágenes de células vivas, mientras usa configuraciones de láser de baja potencia para preservar el tejido y prevenir el daño tisular y los objetivos apropiados para experimentos de larga duración. Grabe y guarde datos en el formato de archivo preferido de archivos CZI para la grabación de datos. Se obtuvieron datos de imágenes de alta calidad de la estructura multicapa para la córnea X vivo, estabilizados con un soporte impreso en 3D, que demuestra eventos de señalización de calcio en las capas apical, basal y estromal de la córnea.Se obtuvieron imágenes Z-stack de una córnea, inmovilizada en el soporte impreso en 3D, en una herida por rasguño para visualizar las membranas celulares y la señalización de calcio a lo largo de las capas de la córnea y la movilización de calcio en diferentes planos Z. Se realizó un experimento de serie temporal de una córnea para estudiar la migración celular hacia el lecho de la herida durante la respuesta de curación, revelando poco movimiento del globo en las direcciones X, Y o Z. Se observó que al colocar el globo en el soporte, se pueden visualizar diferentes regiones de la córnea, tanto en la región limbal central como en la corneal.Este protocolo nos permite obtener imágenes de ojos de modelos de enfermedades que exhiben diferencias en la cicatrización de heridas. Podemos caracterizar aberraciones en la señalización celular y la motilidad en tejido vivo.

live-cell-imaging-intact-ex-vivo-globes-using-novel-3d-printed

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Preparación de desarrollo y de adultos Drosophila Los cerebros y retinas de imágenes en vivo

Xenopus epitelios embrionarios son un sistema modelo ideal para estudiar los comportamientos celulares, tales como el desarrollo de la polaridad y cambiar de forma durante la morfogénesis epitelial. Histología tradicional de muestras fijas cada vez se complementa con células vivas de imagen confocal. Aquí se demuestra métodos para aislar los tejidos de rana y visualizar en directo las células epiteliales y su citoesqueleto utilizando células vivas, la microscopía confocal.

Células vivas, imágenes y análisis cuantitativo de las células epiteliales embrionarias en Xenopus laevis</em

Procesos celulares, tales como la migración celular tradicionalmente han sido estudiados en dos dimensiones, las superficies de plástico rígido. Este informe describe una técnica para visualizar de manera directa la localización de proteínas y el análisis de la dinámica de proteínas en las células que migran de una manera más fisiológicamente relevantes, matriz tridimensional.

Células vivas imágenes de la migración de las células que expresan proteínas de fluorescencia etiquetado en una matriz tridimensional

Tisular embrionario en tiempo real es un reto durante largos períodos de tiempo. Aquí presentamos un ensayo para el seguimiento de los cambios celulares y subcelulares en la médula espinal de pollo durante largos periodos con alta resolución espacial y temporal. Esta técnica puede ser adaptado para otras regiones del sistema nervioso y embrión en desarrollo.

Imágenes de alta resolución en vivo del comportamiento de las células en el desarrollo de neuroepitelio

Se describe la disección y el cultivo ex vivo de la piel del ratón embrionario. El sistema de cultivo mantiene una interfase aire-líquido a través de la superficie del tejido y permite formación de imágenes en un microscopio invertido. Melanoblastos, un componente de la piel en desarrollo, están marcados con fluorescencia que permite su comportamiento que debe observarse mediante microscopía confocal.

Ex vivo Cultura de embriones de ratón con la piel y en vivo de imágenes de melanoblasto Migración

La naturaleza de las interacciones entre las células madre hematopoyéticas y progenitoras (hspCs) y nichos de la médula ósea es poco conocido. Modificaciones de hardware personalizados y un protocolo de adquisición de múltiples pasos permiten el uso de dos fotones y microscopía confocal a la imagen ex vivo HSPCs etiquetados alojados dentro de las áreas de la médula ósea, las interacciones de seguimiento y el movimiento.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Se presenta un dispositivo y un nuevo método para estudiar las células y embriones. Las células individuales se ordenan precisamente en matrices microcavidad. Su confinamiento en 3D es un paso hacia entornos 3D se encuentran en condiciones fisiológicas y permite la orientación orgánulo. Mediante el control de la forma celular, esta configuración reduce al mínimo la variabilidad reportado en ensayos estándar.

Ordenando las células individuales y solo los embriones en 3D Confinamiento: un nuevo dispositivo para la selección de alto contenido

Presentamos un procedimiento para el control de la forma de racimo de célula inicial en una matriz extracelular 3D para obtener una formación de patrón repetible. Un dispositivo cúbico que contiene dos diferentes hidrogeles se emplea para lograr la proyección de imagen multi-direccional para la formación de patrones de tejido.

Celular 3D inicial grupo Control en un dispositivo híbrido Gel cubo para formaciones de patrón repetible

Este protocolo describe el uso de un peróxido de hidrógeno genéticamente codificado (H2O2)-biosensoren neuronas de pez cebra cultivadas y larvas para evaluar las funciones fisiológicas de señalización de H 2 O2durante el desarrollo del sistema nervioso. Se puede aplicar a diferentes tipos de células y modificar con tratamientos experimentales para estudiar especies reactivas de oxígeno (ROS) en el desarrollo general.

Ros imágenes de células vivas durante el desarrollo neuronal

Presentamos un protocolo detallado para el cultivo de embriones de ratón y la obtención de imágenes que permite obtener imágenes 3D + tiempo de células progenitoras cardíacas. Este kit de herramientas de video aborda las habilidades clave requeridas para obtener imágenes en vivo exitosas que de otro modo serían difíciles de adquirir de publicaciones de solo texto.

Imágenes en vivo de progenitores cardíacos tempranos en el embrión de ratón

Los embriones de pollo se utilizan para estudiar tumores cerebrales de glioblastoma humano (GBM) in ovo y en cocultivos de cortes cerebrales ex vivo . El comportamiento de las células GBM se puede registrar mediante microscopía de lapso de tiempo en cocultivos ex vivo , y ambas preparaciones se pueden analizar en el punto final experimental mediante un análisis confocal 3D detallado.

Uso del cerebro del embrión de pollo como modelo para análisis in vivo y ex vivo del comportamiento de las células de glioblastoma humano

Aprende a obtener imágenes de células vivas en córneas heridas utilizando un soporte impreso en 3D. Este método permite monitorear señalización de calcio y migración celular en tiempo real manteniendo la viabilidad del tejido ocular.

Imágenes de células vivas de globos intactos ex vivo utilizando un novedoso soporte impreso en 3D

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