Name: Aislamiento de gotitas lipídicas de plastoglobulo del tejido foliar de plantas y cianobacterias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Aprende a aislar gotitas lipídicas de plastoglobulo de tejido foliar de plantas y cianobacterias mediante ultracentrifugación. Este método rápido y adaptable facilita análisis bioquímicos y estudios proteómicos posteriores.

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La investigación en el grupo de laboratorio de Lundquist está respaldada por subvenciones de la NSF (MCB-2034631) y USDA (MICL08607) a P.K.L. Los autores agradecen a la Dra. Carrie Hiser (MSU) por su apoyo en el desarrollo del método de aislamiento de plastoglóbulos cianobacterianos.

1. Aislamiento de plastoglóbulos crudos
<ol><li>Extracción cruda de plastoglóbulo del tejido foliar de maíz no estresado<ol><li>Adquiera seis plántulas de maíz sanas de aproximadamente 3 semanas de edad y casi en la etapa de crecimiento V5, con un peso aproximado de 120 g.</li>
		<li>Recorte todas las hojas en la base del tallo, sumérjalas rápidamente en un baño de hielo y transpógrelas a la cámara frigorífica.</li>
		<li>Trabajando bajo una lámpara de seguridad verde, retire las hojas de maíz del baño de hielo y córtelas en trozos más pequeños (alrededor de 5 cm x 5 cm) con tijeras.</li>
		<li>Moler suavemente pero a fondo la mitad del tejido de la hoja recortada en una licuadora comercial en 350 ml de tampón de molienda (Tabla 1). Arranque-detenga la licuadora 5x-6x para asegurarse de que todas las hojas estén cortadas. No use más alto que el nivel 7 en la licuadora.</li>
		<li>Filtre el homogeneizado a través de una capa de tela de nylon de 25 μm en un embudo grande en cuatro botellas de centrífuga de 250 ml. A continuación, repita el paso 1.1.4 con la segunda mitad del tejido foliar recortado.</li>
		<li>Dividir uniformemente el filtrado entre las cuatro botellas y centrifugar durante 6 min a 1.840 x g a 4 °C. Retirar una alícuota del filtrado foliar y reservarla antes de la centrifugación para almacenarla como muestra representativa de la hoja total.</li>
		<li>Vierta el sobrenadante resultante y resuspenda suavemente el pellet en 12 ml de medio R 0.2 que contenga 0.2 M de sacarosa (Tabla 1) girando y resuspendiendo con movimientos suaves del cepillo. Después de resuspender cada pellet, lleve la suspensión a la siguiente botella y repita la resuspensión. Agrupe las suspensiones en una botella.</li>
		<li>Distribuir la suspensión agrupada entre seis tubos de ultracentrífuga de 3 mL, alcanzando un volumen máximo de 2,5 mL en cada tubo.</li>
		<li>Sonicar cada tubo 4x, durante 10 s cada vez, utilizando un sonicador de punta a una amplitud del 100%. Tenga cuidado de mantener la bocina del sonicador sumergida y lejos de la superficie del líquido para evitar la espuma.</li>
		<li>Mueva lentamente la bocina del sonicador hacia arriba y hacia abajo dentro de la suspensión durante cada ronda. Alterne entre los cuatro tubos, devolviendo cada tubo a un cubo de hielo después de cada sonicación para permitir que la muestra se enfríe.</li>
		<li>Centrifugar la suspensión tilacoide cruda sonicada a 150.000 x g durante 30 min a 4 °C. Recolecte la almohadilla flotante resultante de plastoglóbulos crudos de la superficie del cojín de sacarosa (fácilmente visto como una almohadilla amarilla y aceitosa) usando una jeringa y una aguja de 22 G rozando la superficie del cojín con la abertura de la aguja, recuperando aproximadamente 500 μL de cada tubo. Depositar en un tubo de 2.0 mL.</li>
		<li>Recolectar alícuotas del tilacoide crudo antes y después de la sonicación y liberación de plastoglobulos. Continúe con el paso 2.1. Alternativamente, almacenar los plastoglóbulos crudos a -80 °C y purificar en un momento posterior.</li>
	</ol></li>
	<li>Extracción cruda de plastoglóbulo del tejido foliar desecado de E. nindensis<ol><li>Adquiera una maceta (compuesta por tres plantas individuales por maceta) de E. nindensis completamente desecada, de 8-9 semanas de edad (casi 40 g de tejido).</li>
		<li>Recorte todo el tejido de la hoja de la base de la planta, justo por encima del suelo, con tijeras e inmediatamente sumerja el tejido en un baño de hielo. Transporte el pañuelo a la cámara frigorífica.</li>
		<li>Trabajando bajo una lámpara de seguridad verde, corte la E. Nindensis hojas en trozos más pequeños (alrededor de 5 cm x 5 cm) usando tijeras.</li>
		<li>Moler suavemente pero bien las hojas con 100 ml de tampón de molienda (Tabla 1) en una licuadora comercial. Comience a detener la licuadora varias veces para asegurarse de que se corten todas las hojas. No use más alto que el nivel 7 en la licuadora.</li>
		<li>Filtrar el homogeneizado a través de una capa de tela de nylon de 25 μm en un embudo grande en un matraz cónico de 250 ml. Retirar una alícuota del filtrado foliar y reservarla antes de la centrifugación para almacenarla como muestra representativa de la hoja total.</li>
		<li>Añadir la cantidad adecuada de sacarosa para llegar a una concentración final de 0,5 M y distribuir la solución en tubos de centrífuga de 250 ml. NOTA: Se utiliza una mayor concentración de sacarosa en comparación con la preparación de Z. mays para asegurar la flotación de las gotas de lípidos citosólicos antes de la posterior sonicación/liberación de los plastoglóbulos unidos al tilacoide.</li>
		<li>Centrifugar los tubos a 45.000 x g durante 30 min a 4 °C. Una mezcla de plastoglóbulos y gotitas de lípidos citosólicos se verá fácilmente como una almohadilla amarilla y aceitosa en o cerca de la superficie del cojín de sacarosa (Figura 1B). Recoja el material flotante usando una jeringa con una aguja de 22 G rozando la superficie del cojín con la abertura de la aguja y deposite en un tubo.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante restante después de recoger la mezcla de plastoglobulo/gota de lípidos que flota libremente.</li>
		<li>Para aislar los plastoglóbulos conectados al tilacoide residual, resuspender el pellet en 12 mL de medio R 0.2 girando y resuspendiendo con movimientos suaves del cepillo. Agrupe las suspensiones en una botella. Continúe con el paso 1.1.8.</li>
	</ol></li>
	<li>Extracción cruda de plastoglóbulos de cianobacterias<ol><li>Cultivar un cultivo de 50 mL de Synechocystis sp. PCC 6803 a la fase estacionaria (aproximadamente 7-10 días) y ajustar la densidad celular a un OD750 de 2.0 usando un espectrofotómetro. Para condiciones de cultivo, utilizar medios BG-11 y cultivar en una incubadora a una intensidad de luz de fotones de 150 μmol/m 2/s,2% de CO2,32 °C, y con agitación continua a 150 rpm.</li>
		<li>Para eliminar los polisacáridos, lavar las células centrifugando el cultivo de 50 ml a 6.000 x g durante 45 min a 4 °C y posteriormente retirar el sobrenadante. Continuar lavando las células dos veces en 50 mL de tampón A (Tabla 1). Extraer una alícuota del homogeneizado celular y reservarla antes de la centrifugación para almacenarla como una muestra celular total representativa.</li>
		<li>Resuspenda el pellet lavado en 25 ml de tampón A y rompa las celdas usando una celda de presión francesa a 1,100 psi, repitiendo el proceso 3 veces (poner la muestra en hielo entre cada ciclo para evitar la desnaturalización de proteínas) hasta que el color lisado cambie de verde a rojo-azul-verde bajo luz blanca. Utilice una celda preenfriada y realice este paso en la cámara frigorífica.</li>
		<li>Distribuir el homogeneizado resultante entre ocho tubos de ultracentrífuga de 3 ml llenos hasta un máximo de 2,5 ml en cada tubo y luego superponer cuidadosamente con 400 μL de medio R, produciendo un gradiente escalonado. NOTA: Consulte Yang, et al. y Kelekar, et al. para descripciones detalladas de la preparación de gradiente de sacarosa25,26.</li>
		<li>Equilibrar cuidadosamente los tubos añadiendo medio adicional R, según sea necesario, y centrifugar durante 30 min a 150.000 x g a 4 °C. El tilacoide y otros orgánulos más pesados (incluyendo cualquier cuerpo de polihidroxialcanoato) se granularán, mientras que los plastoglóbulos se verán fácilmente como una almohadilla amarilla y aceitosa en o cerca de la parte superior del gradiente de sacarosa (Figura 1C).</li>
		<li>Recolecte la almohadilla flotante resultante de plastoglóbulos crudos con una jeringa y una aguja 22G y deposite en un tubo de 2 ml. Raspe los plastoglóbulos del lado de la pared del tubo de la ultracentrífuga con la punta de la aguja si es necesario.</li>
		<li>Continúe con el paso 2.2. Alternativamente, almacenar plastoglóbulos crudos a -80 °C y purificar más tarde.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Recolección de plastoglóbulos puros
<ol><li>Procesamiento de tejidos vegetales<ol><li>Producir gradientes de sacarosa en tubos de ultracentrífuga de 2,5 ml colocando primero capas con 500 μL de plastoglóbulos crudos del paso 1.1 o del paso 1.2 mezclados con 500 μL de medio R 0,7, para llevar a un volumen total de 1 ml, luego superponer con 400 μL de medio R 0,2, seguido de superposición con 400 μL de medio R. NOTA: Consulte Yang et al. y Kelekar et al. para descripciones detalladas de la preparación de gradiente de sacarosa25,26.</li>
		<li>Equilibre cuidadosamente los tubos agregando un exceso de R medio a la capa superior, según sea necesario. A continuación, centrifugar a 150.000 x g durante 1,5 h a 4 °C.</li>
		<li>Recolectar la almohadilla flotante resultante de plastoglóbulos puros (Figura 1A) con una jeringa y una aguja 22G y depositarla en un tubo de 2 ml. Raspe los plastoglóbulos de la parte superior de la pared del tubo de centrífuga con la punta de la aguja si es necesario.</li>
		<li>Alícuota los plastoglóbulos puros y congelar rápidamente en nitrógeno líquido. Conservar directamente a -80 °C o liofilizar hasta obtener un polvo seco.</li>
	</ol></li>
	<li>Procesamiento de cianobacterias<ol><li>Producir un gradiente de sacarosa en cuatro tubos de ultracentrífuga de 2,5 ml superpuestos primero con 500 μL de plastoglóbulos crudos del paso 1.3 mezclados con 750 μL de medio R 0,7, luego superpuestos con 750 μL de medio R 0,2. NOTA: Consulte Yang et al. y Kelekar et al. para descripciones detalladas de la preparación de gradiente de sacarosa25,26.</li>
		<li>Centrifugar el gradiente de sacarosa a 150.000 x g durante 90 min a 4 °C. Recoger los plastoglóbulos puros (Figura 1C) con una jeringa y una aguja de 22 G de la fase superior del gradiente de sacarosa y transferirlos a un tubo de 1,5 ml.</li>
		<li>Alícuota los plastoglóbulos puros y congelar rápidamente en nitrógeno líquido. Conservar directamente a -80 °C o liofilizar hasta obtener un polvo seco.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+throughout+the+evolutionary+tree%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets throughout the evolutionary tree.</a> Progress in Lipid Research. 78, 101029(2020).</li>
<li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+network+of+the+Arabidopsis+plastoglobule+proteome+based+on+quantitative+proteomics+and+genome-wide+coexpression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis.</a> Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).</li>
<li>Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+profiling+of+plastoglobules+in+chloroplasts+and+chromoplasts.+A+surprising+site+for+differential+accumulation+of+metabolic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes.</a> Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).</li>
<li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+plastoglobule+kinases+ABC1K1+and+ABC1K3+causes+conditional+degreening%2C+modified+prenyl-lipids%2C+and+recruitment+of+the+jasmonic+acid+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway.</a> The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).</li>
<li>Vidi, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tocopherol+cyclase+%28VTE1%29+localization+and+vitamin+E+accumulation+in+chloroplast+plastoglobule+lipoprotein+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).</li>
<li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastoglobuli+and+the+fine+structure+of+plastids%5BTitle%5D)+AND+%22Endeavour%22%5BJournal%5D)">Plastoglobuli and the fine structure of plastids.</a> Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).</li>
<li>Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastoglobuli+in+different+types+of+plastids+from+Allium+cepa+L%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L.</a> Planta. 72 (1), 1-13 (1966).</li>
<li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Die+Plastoglobuli+von+Spinat%2C+ihre+Gr%C3%B6%CE%B2e%2C+Isolierung+und+Lipochinonzusammensetzung%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gröβe, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung.</a> Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).</li>
<li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastoglobuli+and+lipoquinone+content+of+chloroplasts+from+Cereus+peruvianus+%28L%29+Mill%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill.</a> Planta. 87 (4), 304-310 (1969).</li>
<li>Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromoplast+ultrastructure+of+Capsicum+carotenoid+mutants+I.+Ultrastructure+and+carotenoid+composition+of+a+new+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+Pflanzenphysiologie%22%5BJournal%5D)">Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant.</a> Zeitschrift für Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).</li>
<li>Hansmann, P., Sitte, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+molecular+structure+of+chromoplast+globules+of+Viola+tricolor%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor.</a> Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).</li>
<li>Steinmuller, D., Tevini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+function+of+plastoglobuli+%3A+I.+Isolation+and+purification+from+chloroplasts+and+chromoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts.</a> Planta. 163 (2), 201-207 (1985).</li>
<li>Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+proteins+associated+with+plastoglobules+isolated+from+pea+%28Pisum+sativum+L.%29+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts.</a> Planta. 208 (1), 107-113 (1999).</li>
<li>Grennan, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastoglobule+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Plastoglobule proteome.</a> Plant Physiology. 147 (2), 443-445 (2008).</li>
<li>Peramuna, A., Summers, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+occurrence+of+lipid+droplets+in+the+cyanobacterium+Nostoc+punctiforme%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme.</a> Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).</li>
<li>Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastoglobules+are+lipoprotein+subcompartments+of+the+chloroplast+that+are+permanently+coupled+to+thylakoid+membranes+and+contain+biosynthetic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes.</a> The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).</li>
<li>Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastid+lipid+droplets+at+the+crossroads+of+prenylquinone+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).</li>
<li>Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+plastoglobules+in+metabolite+repair+in+the+tocopherol+redox+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 298(2014).</li>
<li>Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+and+functional+connections+between+cytoplasmic+and+chloroplast+triacylglycerol+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage.</a> Progress in Lipid Research. 80, 101069(2020).</li>
<li>Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet+isolation+from+Arabidopsis+thaliana+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocols%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves.</a> Bio-Protocols. 10 (24), 3867(2020).</li>
<li>Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+changes+of+Arabidopsis+thaliana+plastoglobules+facilitate+thylakoid+membrane+remodeling+under+high+light+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress.</a> Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).</li>
<li>Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plastoglobule-localized+protein+AtABC1K6+is+a+Mn2%2B-dependent+kinase+necessary+for+timely+transition+to+reproductive+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth.</a> Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762(2022).</li>
<li>Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+topology+and+membrane+interaction+characteristics+of+plastoglobule-localized+AtFBN1a+and+AtLOX2%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signalling+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2.</a> Plant Signalling & Behavior. 16 (10), 1945213(2021).</li>
<li>Besagni, C., Piller, L. E., Bréhélin, C. Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBesagni%2C+C+%22Chloroplast+Research+in+Arabidopsis%22">Chloroplast Research in Arabidopsis</a>. Jarvis, R. P. , Humana Press. Totowa, NJ. Chapter 12 223-239 (2011).</li>
<li>Yang, H., Murphy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+preparation%2C+sucrose+density+gradients+and+two-phase+separation+fractionation+from+five-day-old+Arabidopsis+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocols%22%5BJournal%5D)">Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings.</a> Bio-Protocols. 3 (24), 1014(2022).</li>
<li>Kelekar, P., Wei, M., Yang, P. Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKelekar%2C+P+%22Cilia%3A+Motors+and+Regulation.+Methods+in+Cell+Biology%22">Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology</a>. Pazour, G. J., King, S. M. 92, Academic Press. Cambridge, MA. Chapter 12 181-196 (2009).</li>
<li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear-encoded+synthesis+of+the+D1+subunit+of+photosystem+II+increases+photosynthetic+efficiency+and+crop+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield.</a> Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).</li>
<li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy+reveals+that+senescence+induces+in-situ+and+vacuolar+degradation+of+plastoglobules+in+aging+watermelon+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves.</a> Micron. 80, 135-144 (2016).</li>
<li>Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+FIBRILLIN4+gene+expression+in+apple+decreases+plastoglobule+plastoquinone+content%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content.</a> PLoS One. 7 (10), 47547(2012).</li>
<li>Singh, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FIBRILLIN4+is+required+for+plastoglobule+development+and+stress+resistance+in+apple+and+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gardenia+carotenoid+cleavage+dioxygenase+4a+is+an+efficient+tool+for+biotechnological+production+of+crocins+in+green+and+non-green+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues.</a> Plant Biotechnology Journal. , (2022).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Biochemistry+%26+Physiology%22%5BJournal%5D)">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Canadian Journal of Biochemistry & Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).</li>
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No hay conflictos de intereses que declarar.

Para minimizar los cambios fisiológicos/bioquímicos en el material y proteger ciertos pigmentos fotolípidos y termolábiles que son un componente rico en plastoglobulos, es fundamental realizar el aislamiento a 4 °C y protegido de la luz. Como se indicó anteriormente, los pasos iniciales se realizan en la cámara frigorífica bajo una lámpara de seguridad utilizando una bombilla emisora de color verde. Los pasos posteriores realizados en el laboratorio son bajo luces tenues y utilizan hielo o centrifugación refrigerada. Por...

La comprensión actual de la composición y función de los plastoglobullos ha surgido a través de estudios proteómicos y lipidómicos detallados 1,2,3,4,5. Tales estudios han sido ayudados en gran medida por un método rápido y efectivo de aislamiento que se basa en su muy baja densidad para una separación eficiente utilizando gradientes de sacarosa. Los métodos iniciales de aislamiento de plastoglobullos se lograron a partir de especies como el haya (Fagus sylvatica), la escoba (Sarothamnus scoparius), la cebolla (Allium cepa), la espinaca (Spinacia oleracea), el pensamiento (Viola tricolor), la pimienta (Capsicum annuum) y el guisante (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,12,13. Un método actualizado para aislar plastoglóbulos de cloroplastos de una manera más eficiente y de mejor rendimiento fue presentado posteriormente por Ytterberg et al.3,14. Aunque inicialmente se empleó para el estudio de los plastoglóbulos de los cloroplastos de hojas de Arabidopsis thaliana, hemos empleado con éxito este método actualizado para el tejido foliar sano de otras especies de plantas, tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas, incluyendo maíz (Zea mays), tomate (Solanum lycopersicum), hierba del amor (Eragrostis nindensis), bromo falso púrpura (Brachypodium distachyon) y tabaco silvestre (Nicotiana benthamiana) ; resultados no publicados). Además, el método de aislamiento se ha adaptado con éxito a los plastoglóbulos de cianobacterias, incluyendo Synechocystis sp. PCC 6803 y Anabaena sp. PCC 712015, y el tejido foliar desecado de la planta de resurrección, E. nindensis.
Los plastoglóbulos de cloroplasto del tejido foliar sano están conectados físicamente a las membranas tilacoides16. A pesar de esta continuidad física, los dos subcompartimentos del cloroplasto mantienen distintas composiciones de lípidos y proteínas, aunque se ha propuesto el intercambio regulado de lípidos y proteínas entre los dos compartimentos 2,4,17,18,19. De hecho, recientemente se ha propuesto un interesante modelo de hemifusión para el tráfico de lípidos neutros entre cloroplastos y citosol19. Debido a la continuidad física de plastoglóbulos y tilacoides, el método de aislamiento con tejido foliar sano comienza con la recolección de una preparación de tilacoide crudo granulado, que posteriormente se sonica, para separar los plastoglóbulos de los tilacoides, lo que contrasta con los métodos utilizados para aislar gotas lipídicas citosólicas20 . La ultracentrifugación en un cojín de sacarosa hace flotar los plastoglóbulos de baja densidad a través de la sacarosa, separándolos efectivamente de los tilacoides, núcleos y otros materiales de alta densidad. En contraste, los plastoglóbulos en cianobacterias, así como los de tejido foliar desecado, evidentemente existen in vivo en forma flotante. Por lo tanto, su aislamiento implica flotar directamente en un gradiente de sacarosa. Este artículo demuestra el método de aislamiento del tejido foliar sano y además demuestra dos variaciones que se pueden utilizar para aislar plastoglóbulos de tejido foliar desecado o cultivos de cianobacterias, ampliando en gran medida la amplitud fisiológica y el contexto evolutivo en el que se pueden estudiar los plastoglobulos.
Los plastoglóbulos aislados se pueden utilizar posteriormente para cualquier número de análisis posteriores para investigar las características moleculares. Se han utilizado los plastoglobullos aislados del tejido foliar de A. thaliana para un extenso análisis proteómico y lipidómico bajo diferentes condiciones ambientales o genotipos, demostrando la modificación selectiva de la composición proteica y lipídica en adaptación al estrés 2,4,21,22. Además, se han realizado ensayos de quinasa in vitro que demuestran actividad transfosforilación asociada a plastoglóbulos aislados 22, se han investigado los estados oligoméricos de los componentes proteicos mediante electroforesis en gel nativo 21 y se han realizado ensayos de afeitado de proteasa23.
El principal beneficio de este método es la velocidad relativa del procedimiento. En nuestra experiencia, los protocolos descritos a continuación se pueden completar completamente en aproximadamente 4 horas. Se ha descrito un método alternativo para aislar plastoglóbulos del tejido foliar, que permite el aislamiento simultáneo de otros subcompartimentos de cloroplastos24. Este método alternativo ofrece algunas ventajas claras cuando es necesaria o deseada una comparación cuantitativa con los otros subcompartimentos del cloroplasto. Sin embargo, este método alternativo también es más tedioso y proporcionará un rendimiento significativamente menor de plastoglóbulos aislados a partir de cantidades comparables de tejido foliar. Cuando el objetivo es un estudio centrado en los plastoglóbulos, la metodología descrita aquí es la opción óptima. No obstante, se pueden recolectar alícuotas totales de hoja y tilacoide crudo durante la preparación de la muestra, y se recomienda encarecidamente hacerlo, para tener muestras de referencia para su posterior comparación.

<table><tbody><tr><td>AEBSF</td><td>Milipore Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Antipain.2HCl</td><td>Bachem</td><td>H-1765.0050BA</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Milipore Sigma</td><td>A6106</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbato</td><td>BDH</td><td>BDH9242</td><td></td></tr><tr><td>Bestatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B8385</td><td></td></tr><tr><td>Beta-Glicerofosfato. 2Na5H2O</td><td>EMD Millipore</td><td>35675</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Proliant Biológico</td><td>68700</td><td></td></tr><tr><td>Quimostatina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7268</td><td></td></tr><tr><td>Eragrostis nindensis</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>E-64</td><td>Milipore Sigma</td><td>E3132</td><td></td></tr><tr><td>Francés Célula de presión (modelo FA-079)</td><td>SLM/Aminco</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de agitación Multitron</td><td>Infors HT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-ramidon.2 Na</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R7385</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio</td><td>Fisher Chemicals</td><td>M16050</td><td></td></tr><tr><td>Cisteína reducida</td><td>MP Biochemicals</td><td>101444</td><td></td></tr><tr><td>fluoruro de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7920</td><td></td></tr><tr><td>Ortovanadato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>pirofosfato de sodio &middot; 10H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3850</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3889</td><td></td></tr><tr><td>sacarosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Sylvania 15 W fluorescente Gro-Lux bombilla de tubo, 18"</td> <td>Walmart</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Synechocystis sp. PCC 6803</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX-TL Ultracentrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>A95761</td><td></td></tr><tr><td>Waring Blender (1.2 L)</td><td>VWR</td><td>58977-227</td><td>Licuadora comercial</td></tr><tr><td>Zea mays</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de gotitas lipídicas de plastoglobulo del tejido foliar de plantas y cianobacterias

Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria

Las gotitas lipídicas de plastoglobulo son un subcompartimento dinámico de cloroplastos vegetales y cianobacterias. Se encuentran ubicuamente entre las especies fotosintéticas, se cree que desempeñan un papel central en la adaptación y remodelación de la membrana tilacoide en condiciones ambientales que cambian rápidamente. La capacidad de aislar plastoglóbulos de alta pureza ha facilitado enormemente su estudio a través de metodologías proteómicas, lipidómicas y otras. Con plastoglóbulos de alta pureza y rendimiento, es posible investigar su composición lipídica y proteica, actividad enzimática y topología proteica, entre otras posibles características moleculares. Este artículo presenta un protocolo rápido y eficaz para el aislamiento de plastoglóbulos de cloroplastos de tejido foliar vegetal y presenta variaciones metodológicas para el aislamiento de plastoglóbulos y estructuras de gotitas lipídicas relacionadas de hojas de maíz, el tejido foliar desecado de la planta de resurrección, Eragrostis nindensis, y la cianobacteria, Synechocystis PCC 6803. El aislamiento se basa en la baja densidad de estas partículas ricas en lípidos, lo que facilita su purificación por flotación por densidad de sacarosa. Esta metodología resultará valiosa en el estudio de plastoglóbulos de diversas especies.

Al finalizar el paso 1 del protocolo, uno debería poder ver fácilmente una cantidad considerable de material de plastoglóbulo/gota de lípidos flotando sobre (o cerca) de la capa superior del cojín de sacarosa (Figura 1B-C). Otras fracciones también podrían ser recogidas en esta etapa. Por ejemplo, los tilacoides se granularán y se pueden volver a suspender con el medio R 0,2 para análisis posteriores. Después de la centrifugación posterior, se obtendrán plas...

Se presenta un protocolo rápido y eficaz para el aislamiento de gotitas lipídicas de plastoglobullos asociadas a diversos organismos fotosintéticos. La preparación exitosa de plastoglóbulos aislados es un primer paso crucial que precede a las investigaciones moleculares detalladas, como los análisis proteómicos y lipidómicos.

Aislamiento de gotitas lipídicas de plastoglobulo del tejido foliar de plantas y cianobacterias

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they ...

El aislamiento de plastoglóbulos de alta pureza es fundamental para su estudio. Aquí se presenta un protocolo rápido y efectivo para su aislamiento que facilita su investigación bioquímica posterior. El principal beneficio de este método es la velocidad relativa del procedimiento y su adaptabilidad a numerosas especies de plantas y condiciones ambientales.Se debe tener especial cuidado al sonicar las resuspensiones de tilacoides para garantizar una fuerza suficiente para eliminar los plastoglóbulos de los tilacoides y con la posterior extracción de plastoglóbulos del gradiente de sacarosa. Demostrando este procedimiento estarán el Dr. Elsinraju Devadasu, investigador postdoctoral en mi laboratorio, y Febri Susanto, estudiante de doctorado en mi laboratorio. Comience adquiriendo plántulas de tres semanas de edad de seis maíz sanos, con etapa de crecimiento V5 y un peso aproximado de 120 gramos.Recorte todas las hojas en la base del tallo y sumérjalas rápidamente en un baño de hielo antes de transportarlas a la cámara frigorífica. Trabajando bajo una lámpara de seguridad verde, retire las hojas de maíz del baño de hielo y córtelas en pedazos más pequeños de cinco por cinco centímetros con tijeras. Moler suave y completamente la mitad del tejido de la hoja recortado en 350 mililitros del tampón de molienda a un nivel inferior a siete en una licuadora comercial.Comience y detenga la licuadora de cinco a seis veces para asegurarse de que todas las hojas estén cortadas. Filtre el homogeneizado a través de una capa de tela de nylon de 25 micras en un embudo grande a cuatro botellas de centrífuga de 250 mililitros. Después de repetir el paso de mezcla con el tejido de hoja recortado restante, divida uniformemente el filtrado entre las cuatro botellas.Retirar una alícuota del filtrado foliar y reservarla para almacenarla como muestra representativa de la hoja total. A continuación, centrifugar el filtrado durante seis minutos a 1, 840 G y cuatro grados centígrados. Vierta el sobrenadante resultante y, con suaves movimientos de remolino del cepillo, vuelva a suspender el pellet en 12 mililitros de medio R 0.2, que contiene 0.2 molar sacarosa.Después de resuspender el pellet en una botella, agregue la suspensión a la siguiente botella y repita la resuspensión para agrupar las suspensiones en una botella. Distribuir la suspensión agrupada entre seis tubos de ultracentrífuga de tres mililitros, alcanzando un volumen máximo de 2,5 mililitros en cada tubo. Luego use el sonicador de punta a una amplitud del 100% para sonicar cada tubo cuatro veces durante 10 segundos cada una.Asegúrese de mantener la bocina del sonicador sumergida y lejos de la superficie del líquido para evitar la espuma. Mueva lentamente la bocina del sonicador hacia arriba y hacia abajo dentro de la suspensión durante cada ronda. Mientras alterna los cuatro tubos, devuelva cada tubo a un cubo de hielo después de cada sonicación para permitir que la muestra se enfríe.Una vez hecho esto, centrifugar la suspensión tilacoide cruda sonicada a 150, 000 G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Roze la superficie del cojín con una jeringa y una aguja de calibre 22 y recoja la almohadilla flotante amarilla y aceitosa resultante de plastoglóbulos crudos del cojín de sacarosa. Recuperar aproximadamente 500 microlitros de cada tubo y depositarlos en un tubo de 2,0 mililitros.Recolectar alícuotas tilacoides crudas antes y después de la sonicación y liberación de plastoglobulos. Una vez hecho esto, continúe el procesamiento del tejido vegetal o almacene los plastoglóbulos crudos a menos 80 grados centígrados y purifíquelos más tarde. Cultivar 50 mililitros de la especie PCC 6802 de synechocystis en medios BG11 durante 7 a 10 días para alcanzar la fase estacionaria.Usando un espectrofotómetro, ajuste la densidad celular a una densidad óptica de 2.0 a 750 nanómetros. Para eliminar los polisacáridos, centrifugar 50 mililitros de cultivo y eliminar el sobrenadante. Repita el lavado de las células en 50 mililitros de tampón A dos veces.Resuspenda el pellet lavado en 25 mililitros de tampón A y rompa las celdas usando una celda de presión francesa a 1, 100 libras de pulgadas cuadradas. Repita el proceso tres veces en condiciones frías hasta que el color lisado cambie de verde a rojo, azul, verde bajo luz blanca. Retirar la alícuota del homogeneizado celular y reservarla para almacenarla como muestra celular total representativa.Distribuir el homogeneizado resultante en ocho tubos de ultracentrífuga de tres mililitros llenos hasta un máximo de 2,5 mililitros en cada tubo. Superponga este homogeneizado con 400 microlitros de medio R, produciendo un gradiente de paso. Equilibre cuidadosamente los tubos agregando medio R adicional según sea necesario antes de centrifugar los tubos.El tilacoide y otros orgánulos más pesados, incluyendo cualquier cuerpo de polihidroxialcanoato, muestran formación de pellets, mientras que los plastoglobullos forman una almohadilla aceitosa amarilla en o cerca de la parte superior del gradiente de sacarosa. Coseche la almohadilla flotante resultante de plastoglóbulos crudos con una jeringa, como se demostró anteriormente, y deposite la cosecha en un tubo de dos mililitros. Raspe los plastoglóbulos del lado de la pared del tubo de la centrífuga con una punta de aguja si es necesario.Continúe con el procesamiento de cianobacterias o almacene plastoglóbulos crudos a menos 80 grados centígrados y purifique más tarde. Para cosechar los plastoglóbulos puros utilizando el método de procesamiento de tejido vegetal, prepare el gradiente de sacarosa descrito anteriormente utilizando 500 microlitros de plastoglóbulos crudos, 400 microlitros de R medio 0.2 y 400 microlitros de R medio. Después de alícuota los plastoglóbulos puros y congelar rápidamente las alícuotas en nitrógeno líquido, almacénelos a menos 80 grados centígrados o liofilícelos en polvo seco.Para cosechar plastoglóbulos puros de cianobacterias, cree un gradiente de sacarosa, como se mencionó anteriormente, utilizando 500 microlitros de plastoglóbulos crudos, 750 microlitros de medio R 0.7 y 750 microlitros de medio R 0.2. Después de la centrifugación, recoger los plastoglóbulos puros en un tubo de 1,5 mililitros y alícuota los plastoglóbulos puros. Una vez hecho esto, congele rápidamente las alícuotas de plastoglóbulos puros en nitrógeno líquido y guárdelas directamente a menos 80 grados centígrados o liofilícelas hasta obtener un polvo seco.En este método, se observó una cantidad significativa de plastoglóbulo o material de gota de lípidos flotando en la capa superior del cojín de sacarosa. Después de la centrifugación posterior, se obtuvieron plastoglóbulos purificados en o cerca de la superficie del gradiente de sacarosa. Después del aislamiento exitoso de plastoglobulos, los inmunoblots desarrollados para la evaluación de la pureza utilizando anticuerpos generados contra la fibrilina 1a de Arabidopsis thaliana y la subunidad D1 del fotosistema II de Arabidopsis thaliana mostraron que los homólogos de fibrilina se asociaron principalmente con tilacoides que con los plastoglobulos.Para garantizar la extracción eficiente y concentrada de la almohadilla flotante, coloque el orificio de la aguja de la jeringa justo debajo de la superficie líquida del tampón mientras está completamente sumergido, luego tire suavemente hacia arriba. Las muestras aisladas de plastoglóbulos son susceptibles de estudios proteómicos o lipidómicos posteriores y se han utilizado para demostrar los cambios en la composición proteína-lípido objetivo en diferentes condiciones ambientales. Esta técnica ha facilitado nuevos estudios del plastoglobulo, incluyendo el descubrimiento de la actividad asociada a la proteína quinasa y la presencia de complejos proteicos oligoméricos a través de la investigación bioquímica posterior.

plastoglobule-lipid-droplet-isolation-from-plant-leaf-tissue

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Composición de los extractos de lípidos polares y la composición de ácidos grasos de glicerolípidos individuales están determinados en un experimento de lípidos perfil simple y robusto. Para ello, glicerolípidos están aislados por cromatografía en capa fina y se somete a transmetilación de sus grupos acilo. Grasos methylesters acilo son cuantificados por cromatografía de gases.

Perfiles de Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid por cromatografía en capa fina (TLC), junto con cromatografía de gases (GLC)

Fuente: Shivaiah, K., et al. Aislamiento de gotas de lípidos de plastoglóbulos del tejido foliar de la planta y cianobacterias. J. Vis. Exp. (2022)El video demuestra el aislamiento de plastoglóbulos de cianobacterias. Comienza con un cultivo de cianobacterias y continúa a través de la disrupción celular utilizando fuerza mecánica. La liberación de pigmentos fotosintéticos indica una lisis exitosa. Luego se usa un gradiente escalonado de sacarosa para separar los componentes celulares por...

Extracción y purificación de plastoglóbulos de bacterias fotosintéticas

Fuente: Shivaiah, K., et al. Aislamiento de gotas de lípidos de plastoglóbulos del tejido foliar de la planta y cianobacterias. J. Vis. Exp. (2022).Este video demuestra el aislamiento de plastoglóbulos de cianobacterias mediante centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa, destacando su naturaleza rica en lípidos y baja densidad y asegurando su preservación estructural para el análisis posterior.

Purificación por gradiente de densidad de plastoglóbulos cianobacterianos

Dos técnicas para aislar las gotas de lípidos celulares de 1) las células de levadura y 2) se presentan placentas humanas. La pieza central de ambos procedimientos es la centrifugación en gradiente de densidad, donde la capa flotante resultante que contiene las gotas puede ser visualizado fácilmente por el ojo, se extrae, y se cuantifica por análisis de Western Blot para la pureza.

El aislamiento de gotas de lípidos celulares: dos técnicas de purificación partir de células de levadura y placentas humanas

Los poliésteres lipídicos constituyen los componentes estructurales de dos modificaciones de la pared celular, la cutícula de la planta y las barreras de difusión que contienen suberina. En este video, describimos un método para despolimerizar la cutina de hojas enteras desfiladas. El método se puede aplicar a la investigación de mutantes comprometidos en la biosíntesis de cutina o suberina.

Aislamiento y composicional Análisis de Planta cutícula lípidos poliéster Monómeros

Una metodología de alto rendimiento, la producción de protoplastos de tabaco automatizado y se describe la transformación. El sistema robótico permite la expresión de genes masivamente paralelo y el descubrimiento en el sistema modelo BY-2 que debe ser traducible a los cultivos no modelo.

Una plataforma robótica para de alto rendimiento de protoplastos aislamiento y Transformación

Aquí, presentamos un protocolo para aislar fucoxantina clorofila/c proteínas de unión (FCP) de diatomeas y los incorpore a liposomas con composiciones de lípidos naturales para el estudio de transferencia de energía de excitación a cambios en la composición de iones.

Aislamiento y la incorporación de recolección de luz las antenas de la diatomea Cyclotella Meneghiniana en liposomas con lípidos de tilacoides

Aquí, describimos un método para purificar cloroplastos intactos de hojas de Arabidopsis y de sus tres principales compartimentos sub (envoltura, estroma y tilacoides), usando una combinación de diferencial centrifugados, gradientes de Percoll continuados, y gradientes de sacarosa discontinuas. El método es útil para subplastidial y localización subcelular de las proteínas por immunoblotting y proteómica.

Preparación de compartimientos los cloroplasto de Arabidopsis para el análisis de la localización de la proteína por Immunoblotting o proteómica

Este Protocolo establece un método novedoso de aislamiento de gotas de lípido y purificación de hígado de ratón, usando un kit de aislamiento de retículo endoplásmico bien establecida.

Lipídico rápido gota protocolo de aislamiento utilizando un Kit de aislamiento de organelas bien establecidas

El protocolo actual detalla el aislamiento de los ficobilisomas de las cianobacterias por centrifugación a través de un gradiente de densidad de sacarosa discontinuo. Las fracciones de ficobilisomas intactos se confirman mediante el espectro de emisión fluorescente de 77K y el análisis SDS-PAGE. Las fracciones de ficobilisoma resultantes son adecuadas para la tinción negativa de TEM y el análisis de espectrometría de masas.

Aislamiento y caracterización del ficobilisoma intacto en cianobacterias

Aprende a aislar gotitas lipídicas de plastoglobulo de tejido foliar de plantas y cianobacterias mediante ultracentrifugación. Este método rápido y adaptable facilita análisis bioquímicos y estudios proteómicos posteriores.

Aislamiento de gotitas lipídicas de plastoglobulo del tejido foliar de plantas y cianobacterias

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