Name: Detección de transferencia horizontal de genes mediada por plásmidos conjugativos naturales en E. coli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T13:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Aprende a detectar la transferencia horizontal de genes mediada por plásmidos conjugativos en E. coli. Este método sensible utiliza marcadores selectivos para identificar eventos de transconjugación en poblaciones bacterianas grandes.

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LM-B, IMG, AT e IS fueron apoyados por la subvención GM055246 de los NIH otorgada a LM-B. GC-C recibió la beca postdoctoral UC MEXUS-CONACYT por dos años consecutivos: AY 2017-18 y 2018-19. Agradecemos enormemente a los estudiantes Sage Chavez y Pepper St. Clair del programa de mentores Academic Inspiration Network (GAIN) patrocinado por Genentech-Foundation por su apoyo técnico en experimentos.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los plásmidos conjugativos proporcionan acceso a un conjunto comunitario de genes dentro de un entorno ambiental particular a través de la recombinación y la transferencia horizontal de genes34. Así, los plásmidos conjugativos son entidades evolutivas capaces de adquirir y conferir funciones que permiten a las bacterias adaptarse a múltiples condiciones (incluyendo resistencia a antibióticos, resistencia a metales, adquisición de metales, formación de biopelículas y genes patógenos, entre otras) dentro de una escala temporal de horas.
Este trabajo presenta un protocolo para la identificación de plásmidos conjugativos en bacterias. Para que el protocolo funcione, los marcadores utilizados necesitan diferenciar las cepas donante y receptora, como lo demuestran los controles en los medios A y B. También necesitan seleccionar eficazmente las células que llevan el plásmido. La reacción de apareamiento es crítica. En esta reacción, los donantes y receptores necesitan hacer contacto prolongado (a través de pili) para que ocurra la conjugación. Cualquier cosa que pueda interrumpir el contacto de célula a célula, como un tiempo de incubación insuficiente o agitar o agitar el cultivo, disminuye la eficiencia de la conjugación. La elección del receptor también es crítica, ya que algunas cepas receptoras son refractarias a la conjugación35,36. LMB100 se propone como el receptor de elección, ya que es capaz de tomar plásmidos de múltiples tipos de incompatibilidad.
La tasa de conjugación es específica para cada par cromosómico plásmido-donante, receptor y condición ambiental. Se ha encontrado que la conjugación de plásmidos específicos es sensible a un gran número de variables, incluyendo la fase de crecimiento, la densidad celular, la relación donante-receptor, si la conjugación se realiza en medios líquidos o sólidos, carbono, oxígeno, sales biliares, concentraciones de metales, presencia de células de mamíferos, temperatura, pH y tiempo de apareamiento13,14,15 . El estudio de estas interacciones depende de la detección inicial de un plásmido conjugativo a estudiar en profundidad. Por lo tanto, el protocolo descrito aquí también se puede modificar para explorar el impacto de diferentes variables experimentales, aunque esto se produce a costa de restringir el número de donantes seleccionados. También puede identificar plásmidos movilizables en huéspedes que tienen plásmidos auxiliares (es decir, plásmidos que permiten la conjugación al proporcionar funciones que faltan en los plásmidos movilizables en trans6).
Se recomienda conocer la secuencia del plásmido conjugativo (pero no es necesario para detectar la conjugación, como se discutió anteriormente). Cuando los donantes son negativos para lactosa (produciendo colonias amarillas en agar MacConkey), se puede usar un receptor positivo para lactosa (produciendo colonias rosadas en agar MacConkey) para distinguir los transconjugantes verdaderos de las células donantes que pueden crecer en los medios para seleccionar transconjugantes. El protocolo descrito aquí está diseñado para detectar plásmidos conjugativos de miembros ambientales, comensales y patógenos de la familia Enterobacteriaceae; Sin embargo, se puede usar con cualquier especie bacteriana con un donante, receptor, antibiótico (s) y marcadores de color adecuados. La identificación de estos componentes críticos en otras bacterias requiere estudios sistemáticos utilizando múltiples donantes, receptores y marcadores (antibióticos y colores). Este protocolo no ha sido probado en bacterias Gram-positivas.
Varias variantes del método presentado aquí han sido reportadas en la literatura, recientemente revisada20. El resultado cualitativo también puede ser referido de diferentes maneras (por ejemplo, frecuencia exconjugada y frecuencia de transferencia génica), y las unidades adimensionales pueden ser utilizadas para informar la eficiencia de la conjugación (mL/UFC x h)20.
El protocolo descrito aquí resuelve varias limitaciones previamente no abordadas por los métodos existentes16,18,19,20. En primer lugar, se ha identificado un destinatario adecuado. En segundo lugar, el uso de dos antibióticos (rifampicina y estreptomicina) para seleccionar transconjugantes verdaderos minimiza la posibilidad de que los donantes desarrollen resistencia a uno de los antibióticos utilizados para seleccionar transconjugantes a través de mutagénesis espontánea. Los transconjugantes falsos también pueden ser el resultado de la protección del espectador por hidrólisis del antibiótico utilizado para seleccionar transconjugantes por enzimas (por ejemplo, betalactamasas) producidas en grandes cantidades por el donante. En tercer lugar, se incluyen varios controles experimentales para asegurar que el producto del apareamiento sea un verdadero transconjugado (es decir, una célula receptora que haya incorporado de manera estable el plásmido conjugativo del donante). Aquí, presentamos dos métodos independientes para probar la autenticidad de los transconjugantes, a saber, un marcador colorimétrico en agar MacConkey y la detección por PCR de los replicones y genes de resistencia a antibióticos del plásmido conjugativo en el receptor. Además, el protocolo descrito aquí está diseñado para aislar y caracterizar plásmidos conjugativos de miembros ambientales, comensales y patógenos de la familia Enterobacteriaceae (Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Salmonella, Shigella y otras especies).
Para comprender la mecánica de la conjugación, las observaciones experimentales se han modelado utilizando simulaciones por computadora. Estos modelos predictivos estiman la frecuencia de transferencia de plásmidos para densidades de crecimiento dadas de donantes, receptores y transconjugantes. Un modelo conocido como el modelo de punto final encontró umbrales por encima de los cuales la tasa de transferencia de plásmidos en cultivo líquido, y concluyó que la tasa de transferencia no se ve afectada por la densidad celular, la relación donante: receptor y el tiempo de apareamiento19. La hibridación fluorescente in situ (FISH) se ha utilizado como un método alternativo de detección de plásmidos transconjugados. FISH permite la visualización de plásmidos mediante microscopía de fluorescencia a través de la hibridación de una sonda de ADN y un ADN objetivo. Así, FISH permite la detección visual de flujos de plásmidos a través de diferentes poblaciones celulares37, aunque no tiene el mismo nivel de sensibilidad que el método presentado aquí si los transconjugantes son detectados por cribado visual en lugar de selección.
Existe una enorme necesidad de comprender la biología de los plásmidos conjugativos que dispersan genes de resistencia a antibióticos a través de diferentes componentes del ecosistema (clínica, agricultura, aguas residuales, vida silvestre, animales domésticos, suelos, ríos y lagos). En resumen, las condiciones experimentales simplificadas presentadas en los protocolos aquí descritos facilitan la selección de donantes a escala, y por lo tanto representan una herramienta clave para el estudio de la transferencia horizontal de genes originados en plásmidos conjugativos de una variedad de fuentes. Se pueden utilizar para investigar la prevalencia de genes de resistencia a antibióticos u otros genes clínicamente relevantes en plásmidos conjugativos de múltiples fuentes y bacterias. También se pueden adaptar para el estudio de la conjugación in vivo (por ejemplo, en el intestino de los vertebrados) y para estudiar las condiciones que modulan la eficiencia de la conjugación. Todos estos estudios contribuirán en gran medida a comprender cómo la movilización de plásmidos conjugativos resistentes a múltiples fármacos contribuye a la propagación de la resistencia a múltiples fármacos.

En 1946, Lederberg y Tatum1 describieron un proceso sexual en Escherichia coli K-12 que ahora se conoce como conjugación. La conjugación bacteriana es el proceso por el cual una célula bacteriana (el donante) transfiere material genético unidireccional a otra célula (el receptor) por contacto directo de célula a célula. La conjugación está ampliamente distribuida en las bacterias2,3, aunque la fracción de células donantes que expresan la maquinaria de conjugación es típicamente muy pequeña4.
Los plásmidos son elementos de ADN extracromosómico que se replican de forma autónoma. Además de los genes involucrados en la replicación y mantenimiento de plásmidos, los plásmidos con frecuencia llevan una carga de genes involucrados en la adaptación a desafíos ambientales, como metales pesados o exposición a antibióticos5. Los plásmidos conjugativos son una clase de plásmidos con un conjunto de genes especializados que permiten su transferencia a las células receptoras y apoyan su persistencia después de la transferencia6. Los plásmidos conjugativos varían en tamaño de 21,8 kb a 1,35 Mb en bacterias del filo Pseudomonadota (sinónimo de Proteobacteria), con una mediana de alrededor de 100 kb 5,7. También generalmente tienen un número bajo de copias, posiblemente para mantener la carga metabólica en el huésped baja 8,9.
El aparato conjugativo típico consta de cuatro componentes: un origen de transferencia (oriT), una relaxasa, una proteína de acoplamiento tipo IV y un sistema de secreción tipo IV (una estructura tubular llamada pilus que permite a los donantes contactar a los receptores)6. Sólo una fracción muy pequeña de células portadoras de plásmidos conjugativos expresan la maquinaria de conjugación4, pero si los plásmidos proporcionan una ventaja de aptitud, los transconjugantes pueden expandirse rápidamente en la población. Entre el 35% y más del 80% de los aislados de E. coli recolectados en diferentes hábitats tienen plásmidos conjugativos con genes que confieren resistencia a al menos un antibiótico10,11; Por lo tanto, la transferencia horizontal de genes mediada por plásmidos conjugativos es un mecanismo importante que impulsa la propagación global de genes de resistencia a antibióticos12.
Los experimentos de apareamiento realizados en cultivo de laboratorio han demostrado que la frecuencia de conjugación se ve afectada por múltiples factores, incluida la naturaleza de las células receptoras, la fase de crecimiento, la densidad celular, la relación donante-receptor, si la conjugación se realiza en medios líquidos o sólidos, carbono, oxígeno, sales biliares, concentraciones de metales, presencia de células de mamíferos, temperatura, pH y tiempo de apareamiento13,14, 15.
Este trabajo describe protocolos para detectar la presencia de plásmidos conjugativos en una cepa huésped dada, cuantificar las tasas de conjugación en cultivo sólido y verificar su transferencia a las células receptoras. Estos protocolos pueden ser utilizados como un primer paso para la identificación de plásmidos conjugativos naturales adecuados para la investigación. Utilizan un número mínimo de pasos simplificados porque están diseñados para detectar la presencia de plásmidos conjugativos en bacterias obtenidas de múltiples fuentes (ambientales, comensales y patógenas) a escala (docenas a cientos de donantes).
Además, se muestran pruebas para detectar si la movilización de un plásmido conjugativo dado es independiente del antibiótico utilizado para la detección (es decir, la relevancia del gen de resistencia a antibióticos bajo selección) y para comparar las tasas de conjugación de dos plásmidos conjugativos encontrados en diferentes aislados ambientales.
Sobre la base de la composición genética de los plásmidos conjugativos relevantes (replicón plásmido y composición génica de resistencia a antibióticos), cada paso del protocolo puede modificarse para estudiar el impacto de una variedad de factores que probablemente afecten la tasa de conjugación.
Diseño experimental general: Los componentes esenciales necesarios para establecer un experimento de apareamiento son células donantes, una cepa receptora y medios sólidos para seleccionar donantes (antibiótico A), receptores (antibiótico B) y transconjugantes (antibiótico A y B). Los transconjugantes son células receptoras que mantienen de manera estable el plásmido conjugativo del donante.
Las células del donante son resistentes a un antibiótico (antibiótico A) y son susceptibles al marcador o marcadores utilizados para seleccionar las células receptoras (antibiótico B). La ubicación genómica del gen de resistencia a antibióticos (es decir, si se encuentra en el cromosoma o en un plásmido de la célula donante) no tiene que conocerse a priori, porque la movilización de marcadores de resistencia a antibióticos al receptor (después de un contacto directo donante-receptor) implica que los marcadores proporcionados por el donante estaban en un plásmido.
Una cepa receptora (conocida por tomar plásmidos conjugativos) necesita tener un marcador seleccionable estable que no esté presente en el donante; Este marcador seleccionable es generalmente resistente a un antibiótico o biocida localizado en el cromosoma. La selección del receptor para ser utilizado en experimentos de apareamiento es crítica, ya que algunas cepas de E. coli varían en su capacidad para tomar plásmidos conjugativos16.
Una vez establecidos estos componentes, cualquier colonia que crezca en medios con ambos antibióticos (A y B) después de un contacto entre la pareja donante-receptor es un transconjugado putativo (Figura 1). Esto supone que los donantes pueden crecer en medios con antibiótico A pero no pueden crecer en medios con antibiótico B, y que los receptores pueden crecer en medios con antibiótico B, pero no pueden crecer con antibiótico A. La transconjugación se puede confirmar mediante dos pruebas diagnósticas. La primera prueba consiste en la detección (mediante la amplificación de genes por reacción en cadena de la polimerasa [PCR] u otros métodos) de genes encontrados en el plásmido conjugativo en colonias transconjugadas. La segunda prueba implica el uso de marcadores de color de colonias diferenciales basados en el metabolismo de la lactosa. El color diferencial de la colonia se revela por el uso de agar MacConkey; La lactosa en el agar puede ser utilizada como fuente de fermentación por microorganismos fermentadores de lactosa (LAC +). Estos microorganismos producen ácidos orgánicos, particularmente ácido láctico, que disminuyen el pH. El rojo neutro es un indicador de pH incluido en el medio que cambia de blanco roto a rojo / rosa brillante a medida que el pH cae por debajo de 6.817. Por lo tanto, las cepas positivas para lactosa de E. coli producen colonias rosadas más grandes en agar MacConkey, mientras que las cepas negativas para lactosa producen colonias de color amarillo pálido y más pequeñas en agar MacConkey.
<img alt="Diagrama de transferencia de plásmidos conjugativos; donante a receptor a través de la conjugación; resistencia a antibióticos, análisis de PCR." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64523/64523fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Diagrama de transferencia de plásmidos conjugativos; donante a receptor a través de la conjugación; resistencia a antibióticos, análisis de PCR."> Figura 1: Diseño experimental utilizado para detectar la presencia de plásmidos conjugativos en cepas de donantes. En este ejemplo, el donante lleva un plásmido conjugativo con un gen de resistencia a antibióticos que confiere resistencia al antibiótico A, pero son susceptibles al antibiótico B. Por el contrario, el receptor tiene un determinante de resistencia cromosómica que confiere protección contra el antibiótico B, pero es susceptible al antibiótico A. Los transconjugantes son resistentes a ambos antibióticos (A y B), porque tienen el plásmido conjugativo del donante que confiere resistencia al antibiótico A y el cromosoma del receptor que confiere protección contra el antibiótico B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64523/64523fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
La tasa de conjugación para un par donante-receptor (en determinadas condiciones experimentales) puede calcularse dividiendo el número de transconjugantes por el número de donantes o por el número de receptores; La primera tasa indica la fracción de células donantes que exhiben expresión funcional de la maquinaria de conjugación por el donante16,18, mientras que la segunda tasa indica la capacidad del receptor para tomar plásmidos conjugativos 19,20. En este estudio, a menos que se indique lo contrario, la tasa de conjugación representa la fracción de células receptoras que se vuelven transconjugantes (es decir, tasa por receptor).
Aquí, se reportan dos experimentos de apareamiento independientes, que involucran a un receptor de E. coli y dos donantes de E. coli. Además, se utilizaron diferentes antibióticos para seleccionar transconjugantes para uno de los donantes para confirmar que se puede seleccionar un solo plásmido multirresistente con cualquiera de los genes de resistencia a antibióticos encontrados en el plásmido conjugativo.
Las cepas donante y receptora utilizadas en este trabajo han sido secuenciadas completamente para comprender todos los componentes de este sistema experimental; Sin embargo, estos protocolos fueron diseñados para detectar la presencia de plásmidos conjugativos en huéspedes de secuencia desconocida, y también pueden usarse en este contexto experimental; Sin embargo, en este caso, los genes relevantes se secuencian primero.
Las cepas donante y receptora utilizadas en el protocolo son las siguientes:
Donante 1. E. coli SW4955 fue recolectado en un lago en Baton Rouge (LA, EUA). Tiene un plásmido conjugativo de 134.797 pb (p134797) con replicones IncFIC(FII) e IncFIB (AP001918). Este plásmido conjugativo tiene genes que confieren resistencia a cefalosporinas de tercera generación (blaCTX-M-55), aminoglucósidos (aac(3)-IIa y aadA1), fenicoles (catA2), tetraciclinas (tet(A)), trimetoprima (dfrA14) y sulfonamidas (sul3). Para obtener un mapa completo de p134797, consulte la Figura 2A. E. coli SW4955 es lactosa positiva, produciendo colonias rosadas en agar MacConkey.
Donante 2. E. coli SW7037 fue recolectado en Lake Erie (Ottawa County, OH, EUA). Lleva un plásmido conjugativo de 101.718 pb (p101718) con un replicón IncI1-I(Alfa). Este plásmido conjugativo tiene un gen que confiere resistencia a los betalactámicos (blaCMY-2). Para obtener un mapa completo de p101718, consulte la Figura 2B. E. coli SW7037 también es positivo para lactosa, produciendo colonias rosadas en agar MacConkey.
<img alt="Mapas circulares del genoma de los plásmidos de E. coli p134797 y p101718, destacando los genes de resistencia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64523/64523fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Mapas circulares del genoma de los plásmidos de E. coli p134797 y p101718, destacando los genes de resistencia."> Figura 2: Mapa genético de los plásmidos conjugativos utilizados en este estudio . (A) Plásmido p134797, el plásmido conjugativo encontrado en la cepa SW4955 de E. coli. (B) Plásmido p101718, el plásmido conjugativo encontrado en la cepa SW7037 de E. coli. Los genes de resistencia a los antibióticos se resaltan en azul, y los genes que pertenecen al aparato conjugativo se resaltan en rojo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64523/64523fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Destinatario. E. coli LMB100 se utiliza como receptor. Se trata de una cepa sin plásmidos resistente a la rifampicina (100 mg/L) y a la estreptomicina (100 mg/L). Tener resistencia a dos antibióticos reduce la posibilidad de que surjan mutaciones de resistencia en el donante que interfieran con la interpretación de los resultados. Además, E. coli LMB100 es lactosa negativa, y se puede distinguir de las dos cepas donantes porque produce colonias de color amarillo pálido y pequeñas (a diferencia de las colonias más grandes y rosadas) en agar MacConkey.
Cuando el donante es lactosa negativa, recomendamos el uso de un receptor con lactosa positiva (por ejemplo, E. coli J53). Las cepas LMB100 y J53 están disponibles para otros laboratorios para su uso. Envíe una solicitud al Dr. Gerardo Cortés-Cortés junto con una dirección y un número de FedEx.
El medio sólido necesario para seleccionar y contar donantes, receptores y transconjugantes es el agar MacConkey en placas de Petri de 100 mm de diámetro. Se necesita la adición de los siguientes antibióticos: (i) Media A: carbenicilina (100 mg / L) para contar donantes y garantizar que los receptores no puedan crecer con este antibiótico. (ii) Media B: rifampicina (100 mg/L) + estreptomicina (100 mg/L) para contar receptores y asegurar que los donantes no puedan crecer en estos dos antibióticos. (iii) Media AB: carbenicilina (100 mg/L) + rifampicina (100 mg/L) + estreptomicina (100 mg/L) para obtener y contar transconjugantes. (iv) Media C: no hay antibióticos para rayar todos los aislamientos estudiados.
Se comparan las tasas de conjugación de plásmidos conjugativos de E. coli SW4955 y E. coli SW7037 a E. coli LMB100. Además, en el caso del plásmido conjugativo p134797 (cepa SW4955), el antibiótico carbenicilina (100 mg/L) se sustituye por gentamicina (2 mg/L), cloranfenicol (25 mg/L), tetraciclina (10 mg/L), trimetoprima (20 mg/L) o sulfametoxazol (100 mg/L) en experimentos posteriores para establecer si el marcador de resistencia a antibióticos utilizado para la selección tiene algún impacto en los resultados.

<table><tbody><tr><td>Gradillas de tubos de 1,5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-313630</td><td>Se puede sustituir por otra marca</td></tr><tr><td>Viales criogénicos de 2,0 mL</td><td>Corning</td><td>430659</td><td>Se puede sustituir por</td></tr><tr><td>tubos cónicos de 14 mL</td><td>de</td> otra marca FALCON <td>149597</td><td>Se puede sustituir por</td></tr><tr><td>gradillas de tubos de 14 mL</td> de otra marca <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8850</td><td>Se puede sustituir por otra marca</td></tr><tr><td>Escalera de ADN de 1 kb</td><td>New England Biolabs</td><td>N0552G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Matraces estériles de 250 mL&nbsp;</td><td>PYREX</td><td>5320</td><td>Se puede sustituir por otro marcador permanente de la marca</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38SI-212</td><td>Se puede sustituir por otra marca</td></tr><tr><td>Agarosa (grado de biología molecular, multipropósito)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-500</td><td>Se puede sustituir por otra marca</td></tr><tr><td>Carbenicillina</td><td>GOLD BIOTECHNOLOGY</td><td>C-103-50</td><td>Se puede sustituir por otra marca</td></tr><tr><td>Asas de inoculación desechables: 1 y micro; L</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-595</td><td>Se puede reemplazar por otra marca</td></tr><tr><td>Tinte de carga de gel de ADN 6x &nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td>Se puede sustituir por otra marca</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP119-500</td><td>Se puede sustituir por otra marca</td></tr><tr><td>Báscula electrónica digital</td><td>Denver Instrument</td><td>APX-2001</td><td>Se puede sustituir por</td></tr><tr><td>tubos cónicos Eppendorf de otra marca: 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>14-282-302</td><td>Se puede sustituir por otra marca</td></tr><tr><td>Equipo para electroforesis en gel de agarosa</td><td>Fisher Scientific</td><td>FP300</td><td>Se puede reemplazar por otra marca</td></tr><tr><td>Marcadores resistentes al etanol</td><td>Sharpie</td><td>37001; 37002; 37003</td><td>Se puede reemplazar por</td></tr><tr><td>otros sistemas de documentación de gel de marca (UVP GelSolo)</td><td>Analytakjena</td><td>SP-1108; 849-97-0936-01; 95-0612-01</td><td>Se puede reemplazar por otra marca</td></tr><tr><td>Guantes</td><td>X-GEN</td><td>44-100M</td><td>Cualquier marca de guantes de nitrilo funciona</td></tr><tr><td>Cubitera</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>432128</td><td>Se puede sustituir por otra marca</td></tr><tr><td>de agar MacConkey&nbsp;</td><td>BD DIFCO</td><td>212123</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla Maestra&nbsp;</td><td>BioLabs</td><td>M0496S&nbsp;</td><td>Se puede sustituir por otra marca</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td>Puede ser reemplazado por otra marca</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga: 2.0 mL</td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-138</td><td>Puede ser reemplazado por otra marca</td></tr><tr><td>Mueller Hinton agar</td><td>BD DIFCO</td><td>DF0479-17-3</td><td></td></tr><tr><td>Mueller Caldo Hinton</td><td>BD DIFCO</td><td>275730</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Plasmidio, Mini kit para ADN</td> <td>plasmídicoTakara Bio USA, Inc., MACHEREY-NAGEL</td><td>740588. 250</td><td></td></tr><tr><td>Bastidores de tubos PCR</td><td>AXYGEN&nbsp;</td><td>&nbsp; R96PCRFSP</td><td>Se puede sustituir por</td></tr><tr><td>tubos de PCR de otra marca (0,2 mL)</td><td>AXYGEN&nbsp;</td><td>PCR-02-C</td><td>Puede ser sustituida por otra marca</td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-164-7517</td><td></td></tr><tr><td>Juego de micropipetas que dispensan entre 1 - 10 &mu; L (P10), 2&ndash; 20 &mu; L (P20), 20&ndash; 200 &mu; L (P200) y 200&ndash; 1000 &mu; L (P1000)</td><td>RAININ</td><td>17008648; 17008650; 17008652; 17008653</td><td>Las micropipetas deben calibrarse; se pueden reemplazar por otra marca</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td>Se puede reemplazar por otra marca</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td>Thermo Scientific</td><td>335905P</td><td>Se puede reemplazar por otra marca</td></tr><tr><td>Puntas esterilizadas para 10 &mu; L, 200 &mu; L y 1000 &mu; L&nbsp;</td><td>Eclipse</td><td>1011-260-000-9; 1018-260-000; 1019-260-000-9</td><td>Puede ser reemplazado por otra marca</td></tr><tr><td>Estreptomicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP910-50</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Tinción de gel de ADN seguro&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Taq ADN polimerasa</td><td>BioLabs</td><td>M0273S</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador C1000 Touch&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1851196</td><td>Puede ser reemplazado por otra marca</td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-500</td><td>Puede ser reemplazado por otra marca</td></tr></tbody></table>

detección de transferencia horizontal de genes mediada por plásmidos conjugativos naturales en e. coli

Detection of Horizontal Gene Transfer Mediated by Natural Conjugative Plasmids in E. coli

La conjugación representa uno de los principales mecanismos que facilitan la transferencia horizontal de genes en bacterias gramnegativas. Este trabajo describe métodos para el estudio de la movilización de plásmidos conjugativos naturales, utilizando dos plásmidos naturales como ejemplo. Estos protocolos se basan en la presencia diferencial de marcadores seleccionables en donante, receptor y plásmido conjugativo. Específicamente, los métodos descritos incluyen 1) la identificación de plásmidos conjugativos naturales, 2) la cuantificación de las tasas de conjugación en cultivo sólido, y 3) la detección diagnóstica de los genes de resistencia a antibióticos y los tipos de replicón plásmido en receptores transconjugados por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los protocolos descritos aquí se han desarrollado en el contexto del estudio de la ecología evolutiva de la transferencia horizontal de genes, para detectar la presencia de plásmidos conjugativos portadores de genes de resistencia a los antibióticos en bacterias que se encuentran en el medio ambiente. La transferencia eficiente de plásmidos conjugativos observada en estos experimentos en cultivo destaca la relevancia biológica de la conjugación como un mecanismo que promueve la transferencia horizontal de genes en general y la propagación de la resistencia a los antibióticos en particular.

Dado que los donantes SW4955 y SW7037 han sido secuenciados, se espera que estas dos cepas donantes tengan los fenotipos de resistencia correspondientes al perfil del gen de resistencia identificado en su secuencia genómica. El plásmido p134797 (de SW4955) tiene genes que confieren resistencia a cefalosporinas de tercera generación (blaCTX-M-55) y resistencia a aminoglucósidos (aac(3)-IIa y aadA1), fenicoles (catA2), tetraciclinas (tet(A)), trimetoprima (dfrA14) y sulfonamidas (sul3); no se encontraron genes de resistencia a antibióticos en el cromosoma SW4955. El plásmido p101718 (de SW7037) solo lleva un gen de resistencia a antibióticos (bla CMY-2), que se espera que confiera resistencia a las cefalosporinas de tercera generación (blaCTX-M-55). Una vez más, no se encontraron genes de resistencia a los antibióticos en el cromosoma SW7037.
Después del apareamiento, se esperaba la detección de la transferencia de los dos plásmidos conjugativos portadores de todos los genes de resistencia mencionados anteriormente. La detección de conjugación positiva implica que los receptores identificados como transconjugantes deben haber adquirido los plásmidos conjugativos. También se esperaba la presencia de los genes de resistencia diagnóstica para los plásmidos conjugativos en los transconjugantes (detectados por PCR).
Para ilustrar los métodos descritos aquí, se probó la capacidad de dos aislados ambientales de E. coli para transferir ADN plásmido por conjugación. En la figura 1 se muestra una representación esquemática de la configuración experimental. Dos donantes (E. coli SW4955 y SW7037) y un receptor (E. coli LMB100) se aparearon de forma independiente. El mapa genético de plásmidos conjugativos encontrados en E. coli SW4955 (p134797) y SW7037 (p101718) se muestra en la Figura 2.
Los plásmidos conjugativos fueron seleccionados con carbenicilina y contraseleccionados mediante rifampicina y estreptomicina, cuyos determinantes de resistencia se encuentran en el cromosoma del receptor. Se utilizó agar MacConkey para distinguir los donantes positivos para lactosa (que producen colonias grandes y rosadas) del receptor y los transconjugantes (que son lactosa negativos y producen colonias más pequeñas de color amarillo pálido) (Figura 3).
<img alt="Resultados de conjugación bacteriana; cultivos en placa de Petri con aumento de colonias; Estudio de transferencia genética." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64523/64523fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Resultados de conjugación bacteriana; cultivos en placa de Petri con aumento de colonias; Estudio de transferencia genética."> Figura 3: Ilustración de los marcadores de color diferenciales para colonias donantes y receptoras en agar MacConkey. Las colonias correspondientes a los donantes son rosadas en agar MacConkey porque son lactosa positiva. Esto distingue a las colonias donantes de las receptoras, que son de color amarillo pálido y más pequeñas (lactosa negativa). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64523/64523fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Se detectó la movilización del plásmido conjugativo p134797, correspondiendo cada uno de los cinco antibióticos a las cinco clases diferentes de genes de resistencia encontrados en el plásmido.
Se presenta un ejemplo de cómo calcular la eficiencia de conjugación (CE) para la cepa SW4955. Del ensayo con la cepa SW4955, se contaron 172 UFC de transconjugantes en la placa de dilución 10-2; el recuento del receptor de la dilución correspondiente (10-2) fue de 10.300.000 UFC/ml (Tabla 4).
El CE se calcula de la siguiente manera:
CE = (174 UFC/ml)/(10.300.000 UFC/ml)
CE= 1,67 x 10-5 transconjugantes/receptor
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td colspan="2">LMB100</td>
			<td>Transconjugantes de la cepa SW4955 seleccionada con carbelicilina</td>
			<td rowspan="2">Eficiencia de conjugación</td>
		</tr><tr><td>Dilución</td>
			<td>CFU (placa contable)</td>
			<td>Aprox. UFC/ml</td>
			<td>CFU (placa contable)</td>
		</tr><tr><td>100</td>
			<td>confluente</td>
			<td>1.03E+09</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10-1</td>
			<td>confluente</td>
			<td>1.03E+08</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10-2</td>
			<td>confluente</td>
			<td>10300000</td>
			<td>172</td>
			<td>1,67 x 10-5 transconjugantes/receptor</td>
		</tr><tr><td>10-3</td>
			<td>confluente</td>
			<td>1030000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10-4</td>
			<td>confluente</td>
			<td>103000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10-5</td>
			<td>confluente</td>
			<td>10300</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10-6</td>
			<td>confluente</td>
			<td>1030</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10-7</td>
			<td>103</td>
			<td>103</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="5">Los valores utilizados para calcular el CE se resaltan en negrita.</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 4: Un ejemplo de cómo calcular la eficiencia de conjugación (CE) para la cepa SW4955.
Los resultados se muestran en la Tabla 5, expresada como eficiencia de conjugación por receptor. Las cinco eficiencias de conjugación obtenidas utilizando la cepa SW4955 como donante estaban todas dentro del mismo orden de magnitud. Estos resultados indican que la movilización del plásmido conjugativo puede detectarse independientemente de la selección utilizada para la identificación transconjugante.
Utilizando la cepa SW7037 como donante, la eficiencia de conjugación obtenida fue tres órdenes de magnitud menor; Estos resultados permiten comparar las eficiencias de conjugación de diferentes donantes y tipos de plásmidos con los mismos receptores.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td colspan="5">Eficiencia de conjugación</td>
		</tr><tr><td>Colar</td>
			<td>Carbenicilina (100 mg/L)</td>
			<td>Gentamicina (2 mg/L)</td>
			<td>Cloranfenicol (25 mg/L)</td>
			<td>Tetraciclina (10 mg/L)</td>
			<td>Trimetoprima (20 mg/L)</td>
		</tr><tr><td>SW4955</td>
			<td>1,67 x 10-5</td>
			<td>5,67 x 10-5</td>
			<td>2,17 x 10-5</td>
			<td>7,62 x 10-5</td>
			<td>1,36 x 10-5</td>
		</tr><tr><td>SW7037</td>
			<td>2,14 x 10-6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabla 5: Eficiencias de conjugación de las cepas donantes de E. coli SW4955 y SW7037 dependiendo del antibiótico utilizado para la selección.
En los transconjugados, la presencia de replicones y todos los genes de resistencia codificados en dos plásmidos conjugativos probados, y sus correspondientes replicones, se verificó mediante PCR. Las condiciones utilizadas para estas reacciones de PCR diagnósticas se muestran en la Tabla 3.
Los geles de diagnóstico se muestran en la Figura 4. Estos geles confirman la presencia de los replicones esperados en transconjugantes (IncFIC e IncFIB en p1347975, e IncI1 en p101718). También confirman la presencia de los genes de resistencia a antibióticos esperados, a saber, el grupo bla CTX-M-55 (betalactámico), aac (3) -II y aadA (aminoglucósido), catA2 (fenicol), tet (A) (tetraciclina), dfrA14 (trimetoprima) y sul3 (sulfonamida) para p1347975, y blaCMY-2 para p101718 (Figura 4).
<img alt="Electroforesis en gel de agarosa que muestra patrones de escalera y banda de ADN para el análisis de genes de resistencia a antibióticos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64523/64523fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Electroforesis en gel de agarosa que muestra patrones de escalera y banda de ADN para el análisis de genes de resistencia a antibióticos."> Figura 4: Geles de electroforesis diagnóstica. Electroforesis en gel de productos de PCR de genes de resistencia a antibióticos y replicones plásmidos encontrados en plásmidos conjugativos p134797 y p101718 en las células donantes (cepas SW4955 y SW7037, respectivamente) y en los correspondientes transconjugantes LMB100. La carbenicilina se utilizó para la selección de plásmidos. Abreviaturas. -: control negativo (se utilizó ADN de la cepa LMB100 como control negativo); D: donante; T: transconjugante. Tamaños de amplicón esperados: blaCTX-M-55: 864 pb; aac(3)-IIa: 237 pb; aadA1: 283 pb; catA2 : 225 pb; tet(A): 957 pb; dfrA14: 302 pb; SUL3: 799 pb; IncFIC(FII): 262 pb; IncFIB: 683 pb; blaCMY-2: 1.855 pb; IncI1-I: 139 pb. El gel tiene un 1% de agarosa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64523/64523fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

La conjugación media la transferencia horizontal de genes mediante la movilización de ADN plásmido a través de dos células diferentes, facilitando la propagación de genes beneficiosos. Este trabajo describe un método ampliamente utilizado para la detección eficiente de la transferencia conjugativa de plásmidos, basado en el uso de marcadores diferenciales en el plásmido conjugativo, donante y receptor para detectar la transconjugación.

Detección de transferencia horizontal de genes mediada por plásmidos conjugativos naturales en E. coli

Conjugation represents one of the main mechanisms facilitating horizontal gene transfer in Gram-negative bacteria. This work describes methods for the ...

Las bacterias como E. coli portan genes resistentes a los antibióticos en plásmidos conjugativos. Esta bacteria se puede encontrar en hospitales, viviendo como comensales en animales y en ambientes acuáticos. Plásmidos conjugativos naturales de transferencia horizontal de genes entre diferentes linajes bacterianos.Presentamos metales para la detección de plásmidos conjugativos y eficiencia de conjugación de formación. Esta técnica es simple y sensible. Es sensible porque utiliza marcadores para el plásmido, el donante y el receptor.Estos marcadores son seleccionables, lo que significa que pueden identificar eventos individuales en poblaciones muy grandes. Los protocolos que presentamos son útiles para estudiar la evolución de la resistencia a los antibióticos y para la vigilancia epidemiológica, es decir, para monitorizar el flujo de genes farmacorresistentes. Demostrando el procedimiento estarán Caison Warner, un estudiante de doctorado de mi laboratorio, y Pepper St.Clair, un estudiante de pregrado del laboratorio CAMS.El primer día, raye por separado a los donantes y al receptor de las existencias de glicerol en el medio C, que es agar MacConkey sin antibióticos e incube durante la noche a 37 grados centígrados. En el segundo día, etiquete un tubo de cultivo de 14 mililitros para cada donante y receptor. Seleccione una sola colonia de cada donante y receptor y críelos en dos mililitros de caldo Mueller Hinton a 200 RPM durante 18 horas a 37 grados centígrados.En el tercer día, mida la densidad óptica de 10 veces el cultivo diluido de solución salina durante la noche a 600 nanómetros sin vórtice. Si es necesario, use solución salina esterilizada para ajustar la densidad óptica a dos. Etiquete un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros como tubo de acoplamiento, indicando las cepas donante y receptora.Transfiera 500 microlitros de la suspensión ajustada de cada donante y receptor en el tubo de acoplamiento y mezcle suavemente la suspensión por inversión. Centrifugar el tubo de acoplamiento a temperatura ambiente durante 10 minutos a 500 G.Pipetear 800 microlitros de sobrenadante del tubo de acoplamiento sin alterar el pellet, dejando 200 microlitros en el tubo. Incubar el tubo de apareamiento durante 18 horas a 37 grados centígrados.Además, como control negativo, raye la cultura nocturna de los donantes en los medios B y los receptores en los medios A e incube las placas durante la noche a 37 grados centígrados. Después de la incubación, en el cuarto día, agregue 800 microlitros de solución salina al tubo de acoplamiento y resuspenda por vórtice. Haga diluciones seriadas de la suspensión de acoplamiento y agregue 100 microlitros de cada dilución en placas de medios.Una vez que las placas estén secas, incubarlas durante 18 horas a 37 grados centígrados y calcular la frecuencia de conjugación por donante o por receptor como se describe en el manuscrito. Después de extraer el ADN de las paredes celulares bacterianas utilizando un método simple de extracción de preparación para hervir, etiquete un tubo de 1,5 mililitros como una piscina en los tubos de PCR requeridos con el nombre del gen y la muestra. En el tubo etiquetado como piscina, agregue agua estéril, mezcla maestra de PCR, cebadores y polimerasa.Mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos 10 veces en un ambiente frío. Agregue el ADN de la plantilla al tubo correspondiente y asegure los tubos de PCR con tapas. Coloque los tubos de PCR en el termociclador e inicie el programa para genes de resistencia y replicones como se describe en el manuscrito.Para la confirmación del amplicón, prepare un gel de agarosa al 1% agregando agarosa y tampón TAE en un matraz de 250 mililitros y derrita la agarosa con un microondas. Una vez que la solución de agarosa se haya enfriado a aproximadamente 55 grados centígrados, bajo una campana extractora, agregue seis microlitros de SYBR Green y mezcle. Vierta el gel en una bandeja sellada con cinta adhesiva para evitar derrames y deje que el gel se asiente durante 15 a 25 minutos hasta que aparezca la turbidez.Después de retirar la cinta adhesiva, coloque el gel en la cámara de electroforesis y agregue un tampón TAE para cubrir el gel. Mezcle cinco microlitros de seis veces el tinte de carga de gel de ADN con 25 microlitros de cada reacción pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos 10 veces. Luego cargue la mezcla en pozos evitando burbujas.Después de agregar cuatro microlitros de una escalera de ADN de un par de kilobases en el primer pozo, cierre la tapa de la cámara y ejecute el gel durante 60 minutos a 120 voltios y 400 miliamperios. Visualice el gel bajo luz UV y grabe la imagen. El agar MacConkey distinguió los donantes positivos de lactosa que produjeron grandes colonias rosadas del receptor y los transconjugantes, que eran lactosa negativos y produjeron colonias más pequeñas de color amarillo pálido.Las cinco eficiencias de conjugación de una cepa donante SSW4955 estaban todas dentro del mismo orden de magnitud, lo que indica que la movilización del plásmido conjugativo se puede detectar independientemente de la selección utilizada para la identificación transconjugante. Mientras que la cepa donante SSW7037 mostró una eficiencia de conjugación tres veces menor, lo que permite la comparación de eficiencias de conjugación de diferentes donantes y tipos de plásmidos con los mismos receptores. La electroforesis en gel de los productos de PCR confirmó la presencia de replicones esperados en transconjugantes.Este ensayo depende completamente de marcadores seleccionables. Los controles deben estar en su lugar para confirmar que cada selección está funcionando y los transconjugantes deben confirmarse colorimétricamente o por PCR. Los protocolos aquí presentados pueden ser adaptados para el estudio de modelos de conjugación in vivo o biofilm, y para un estudio de variables moduladoras de eficiencia de conjugación.Este protocolo para detectar plásmidos movilizables a escala contribuirá en gran medida a nuestra comprensión del flujo de genes a través del medio ambiente y para estudiar las variables que afectan la eficiencia de la conjugación.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

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A continuación, presentamos los protocolos para la crianza de un escarabajo intermedia de gérmenes, Dermestes maculatus (D. maculatus) en el laboratorio. También compartimos protocolos para RNAi embrionario y de los padres y los métodos para el análisis de los fenotipos de embriones para estudiar la función de genes en esta especie.

La cría y el doble-stranded RNA mediada gen desmontables en el Hide Escarabajo, Dermestes maculatus

Los mutantes de deleción genética generados a través de la recombinación homóloga son el patrón oro para estudios de la función génica. Se describe el método OSCAR (construcción de un solo paso de Agrobacterium-recombinación-listo-plásmidos) para la generación rápida de construcciones de deleción. Sigue la transformación de hongos mediada por Agrobacterium. Finalmente, se presenta un método de confirmación basado en PCR de deleciones de genes en transformantes fúngicos.

Producción de eliminación rápida en hongos vía<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs

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Generación dependiente de la selección y independiente de CRISPR / Cas9-mediada Gene Knockouts en células de mamíferos

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