Recolección dinámica en tiempo real de líquido extracelular del hipocampo de ratas conscientes utilizando un sistema de microdiálisis
21 de octubre de 2022
El protocolo aquí proporciona un muestreo dinámico detallado en tiempo real del líquido extracelular del hipocampo de ratas despiertas utilizando un sistema de microdiálisis.
El líquido extracelular del hipocampo y la multitud mediante la técnica de microdiálisis cerebral contribuyen a monitorear la enfermedad micro específica de las enfermedades nerviosas centrales. La técnica de microdiálisis cerebral logra la inquisición dinámica y continua de líquido cerebral intersticial en regiones cerebrales específicas de ratas no anestesiadas. Comience fijando la rata anestesiada en un localizador cerebral estereotáxico y limpie el área quirúrgica afeitada con un hisopo de povidona yodada y etanol tres veces antes de la operación.
Luego haga una incisión facial craneal de 1,5 centímetros por el medio con tijeras quirúrgicas y retire el periostio con tijeras quirúrgicas y fórceps oftálmicos. Considerando el bregma como la posición basal, usando un taladro craneal perforar el endocráneo para perforar una abertura de dos milímetros en la región CA1 del hipocampo. Ahora fije la aguija del catéter en la pinza de un localizador cerebral estereotáxico y ajuste la posición de la carcasa de microdiálisis en las posiciones ventral anteroposterior, mediolateral y dorsal.
Ajuste la válvula dorsoventral del localizador estéreo cerebral e implante la carcasa de microdiálisis en la región CA1 a una profundidad de 3,5 milímetros. Perfore tres aberturas más con un diámetro de dos milímetros de tal manera que las tres aberturas formen un triángulo en el que la abertura de la sonda esté ubicada centralmente. El implante atornilla en las aberturas a una profundidad de un milímetro y fije el catéter de la sonda con cemento dental.
Luego use una sutura quirúrgica 4-O para cerrar la piel. Conecte la microjeringa de la bomba de microdiálisis con el dispositivo de actividad despierta ACSF y el colector de muestras criogénicas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego, para descargar el aire en la tubería, configure la bomba de microdiálisis a una velocidad de un microlitro por minuto.
Luego conecte la tubería y la sonda de microdiálisis cerebral y opere la bomba de microdiálisis a una velocidad de un microlitro por minuto para inyectar ACSF en la sonda hasta que la superficie de la sonda esté ligeramente húmeda. Sumerja la sonda en una solución inyectable de heparina sódica para su uso posterior. Para recoger el HECF de la rata despierta, inserte la sonda de microdiálisis cerebral en el catéter de la sonda y coloque la rata en una cámara con relleno para asegurarse de que las ratas sean libres de moverse.
Encienda el controlador giratorio multicanal para evitar entrelazar las tuberías de microdiálisis durante el movimiento libre de la rata. Luego encienda la bomba de microjeringa y bombee el ACSF a una velocidad de un microlitro por minuto. Después de un equilibrio de 60 minutos del sistema de recolección de HECF de microdiálisis, recolecte HECF periódicamente.
Después de la terminación del muestreo, saque la sonda de microdiálisis cerebral del catéter de la sonda. Sumerja la sonda en agua desionizada y lave con agua desionizada durante 12 horas para eliminar las deposiciones de sal varadas de la tubería y la sonda. Retire la sonda y colóquela en una solución de tripinas al 0,05% a cuatro grados centígrados.
El líquido extracelular del hipocampo adquirido por la técnica de microdiálisis cerebral es similar al agua, incoloro y transparente a la frecuencia de muestreo establecida. Los procedimientos más importantes son implantar la microdiálisis cuidadosamente en la región CA1 e insertar la sonda en el catéter pop. La técnica de microdiálisis simplemente permite ayudar al cambio dinámico de los marcadores de la enfermedad en regiones específicas del cerebro, la sustancia de la eficacia del fármaco y el catabolismo tisular de los componentes del fármaco.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para el muestreo dinámico en tiempo real del líquido extracelular del hipocampo (HECF) en ratas despiertas, utilizando una técnica de microdiálisis cerebral. El proceso permite a los investigadores monitorear marcadores específicos de enfermedades en trastornos del sistema nervioso central mediante la obtención de muestras continuas de regiones cerebrales específicas sin anestesiar a los sujetos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Enfermedades neurodegenerativas
- Técnicas de microdiálisis
Antecedentes
- Comprender la dinámica del fluido extracelular es fundamental para estudiar los mecanismos neuronales y la plasticidad.
- Los métodos actuales suelen implicar técnicas invasivas que podrían influir en el contexto biológico.
- La microdiálisis permite la recolección de líquido intersticial mientras el sujeto está despierto, proporcionando datos más relevantes.
- Este protocolo aborda la necesidad de monitorear continuamente la composición del líquido cerebral en modelos vivos.
Objetivo del estudio
- Mejorar el monitoreo de marcadores de enfermedad en el hipocampo mediante la implementación de un enfoque de muestreo no invasivo.
- Proporcionar un marco metodológico detallado para que los investigadores puedan replicar el procedimiento.
- Establecer un sistema confiable para observar los efectos de fármacos y los cambios metabólicos a lo largo del tiempo.
Métodos Utilizados
- El estudio utiliza un sistema de microdiálisis implantado en la región CA1 del hipocampo.
- Ratas despiertas y no anestesiadas sirven como modelo biológico para el muestreo de HECF.
- La técnica de microdiálisis mide el fluido a una velocidad de un microlitro por minuto.
- Los pasos críticos incluyen la implantación precisa del catéter, la equilibración y los intervalos regulares de muestreo.
- Se realiza la limpieza del catéter de microdiálisis tras el muestreo para garantizar la integridad de los datos.
Resultados principales
- El HECF recolectado es claro e incoloro, lo que permite el análisis de marcadores de enfermedad.
- La metodología detallada posibilita experimentación sobre los cambios dinámicos en los entornos neuronales.
- La información obtenida mediante este método puede ayudar a evaluar la eficacia de fármacos y a comprender el catabolismo tisular.
Conclusiones
- Este estudio demuestra el potencial de la microdiálisis para avanzar en nuestra comprensión de la dinámica de los fluidos cerebrales y de los procesos de enfermedad.
- La capacidad de monitoreo continuo permite evaluar cambios en tiempo real en la acción de fármacos y en estados metabólicos.
- Estas observaciones son cruciales para mejorar las estrategias dirigidas a abordar enfermedades neurológicas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La recolección dinámica en tiempo real del líquido extracelular del hipocampo (HECF) en ratas conscientes permite el monitoreo directo de los cambios neuroquímicos relacionados con la progresión de enfermedades del sistema nervioso central y la eficacia de fármacos. Esta capacidad aumenta la confianza predictiva en neurociencia traslacional al proporcionar datos cuantitativos y resueltos en el tiempo de biomarcadores procedentes de regiones cerebrales relevantes para la enfermedad. Este enfoque apoya el descubrimiento temprano y la reducción del riesgo mecanicista en carteras de neuroterapéuticos dirigidos a las vías del hipocampo.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar las dinámicas neuroquímicas subyacentes a los mecanismos de enfermedades del SNC in vivo.
- Apoya la validación funcional de dianas al cuantificar los efectos de fármacos y metabolitos en el hipocampo.
- Facilita la reducción de riesgos mecanicistas mediante la medición directa de marcadores extracelulares relevantes para la enfermedad.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona un muestreo cuantitativo validado del líquido extracelular cerebral para el cribado de compuestos posteriores.
- Permite la recolección reproducible y estandarizada de datos neuroquímicos en modelos animales despiertos.
- Apoya el desarrollo de ensayos para evaluar las respuestas farmacodinámicas a compuestos activos sobre el SNC.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Alinea la medición de biomarcadores preclínicos con puntos finales relevantes para la enfermedad en neurociencia traslacional.
- Permite la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante el seguimiento de efectos farmacológicos dinámicos in vivo.
- Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo basadas en lecturas neuroquímicas en tiempo real.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método de microdiálisis se integra en el continuo de descubrimiento a preclínico al permitir el análisis cuantitativo en tiempo real del líquido extracelular del hipocampo en ratas conscientes.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías para dianas del SNC mediante el monitoreo de cambios dinámicos en biomarcadores.
- Tamizaje: Proporciona datos neuroquímicos reproducibles y listos para ensayos para la evaluación de compuestos.
- Análisis: Ofrece resultados cuantitativos para comparar los efectos de fármacos y estados patológicos en diferentes condiciones experimentales.
- Investigación Translacional: Conecta estudios preclínicos y traslacionales al alinear la medición de biomarcadores con puntos finales clínicos.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para flujos de trabajo en el descubrimiento de fármacos para el SNC y la validación de biomarcadores.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos del SNC.
- Valor operativo: Estandariza el muestreo neuroquímico y mejora la reproducibilidad entre estudios.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al proporcionar datos accionables de biomarcadores.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos neuroterapéuticos basada en evidencia dinámica in vivo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cirugía estereotáxica e implantación de sondas de microdiálisis.
- Necesita instrumentación especializada para el muestreo por microdiálisis y el análisis cuantitativo.
- Exige estandarización entre equipos en las tasas de muestreo y los protocolos analíticos.
- La adaptación a diferentes regiones cerebrales o modelos de enfermedad puede requerir optimización del protocolo.
- El muestreo está limitado a analitos menores de 20 kDa debido a las especificaciones de corte del filtro de la sonda.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:44
Brain Microdialysis Probe Implantation Surgery
2:24
Microdialysis System Connection and Probe Check
3:15
Collection of Hippocampal Extracellular Fluid (HECF) from the Awake Rat
4:02
Maintenance of the Microdialysis System and Devices After Sampling
4:36
Results: Analysis of HECF Collected Using the Microdialysis Sampling Equipment
4:54
Conclusion
