Name: Evaluación de las propiedades anticriptocócicas putativas de extractos crudos y clarificados de moluscos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-02T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Aprende a evaluar extractos de moluscos Cipangopaludina chinensis con propiedades anticriptocócicas contra Cryptococcus neoformans. Este método permite identificar compuestos naturales con potencial antifúngico.

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Los autores agradecen a los miembros del Laboratorio Geddes-McAlister por su valioso apoyo a lo largo de esta investigación y sus comentarios sobre el manuscrito. Los autores reconocen el apoyo financiero de la Ontario Graduate Scholarship and International Graduate Research Award - University of Guelph a D. G.-G y de la Fundación Canadiense de Innovación (JELF 38798) y Ontario Ministry of Colleges and Universities - Early Researcher Award para J. G.-M.

1. Extracción de proteínas de moluscos
<ol><li>Recolectar moluscos de un área natural designada y aprobada (por ejemplo, Speed River, Guelph, Ontario). Para este estudio, se seleccionaron especies nativas e invasoras para evaluar una amplia gama de posibles efectos antifúngicos.</li>
	<li>Rompa suavemente la cáscara de los moluscos (por ejemplo, Cepaea nemoralis, Planorbella pilsbryi y Cipangopaludina chinensis) con un mortero, y retire las piezas sólidas con un par de pinzas. Generalmente, 10 moluscos se agrupan para su uso en todo el protocolo.</li>
	<li>Recoger y pesar los órganos. Aproximadamente 15-20 g de muestra es óptimo. Use tijeras para cortar los órganos en trozos pequeños de aproximadamente 0.5-1 cm de tamaño.</li>
	<li>Congele rápidamente las muestras de órganos diseccionadas y cortadas con nitrógeno líquido. Luego, muele las muestras de órganos en un polvo fino usando un mortero.</li>
	<li>Añadir el polvo de la muestra de órgano (aproximadamente 15 g) en 30 ml de agua destilada fría (4 °C) para lograr una proporción de 1:2 (p/v).</li>
	<li>Vierta 2 ml de la muestra en tubos de 2 ml de alto impacto. Añadir una cucharada de perlas de acero inoxidable de 3 mm (aproximadamente 500 μg) a cada tubo, y homogeneizar con una batidora (véase la tabla de materiales) durante 3 min a 1.200 rpm y 4 °C.</li>
	<li>Centrifugar a 12.000 × g durante 20 min a 4 °C. Recoger todos los sobrenadantes con una pipeta en un tubo fresco de 50 ml, desechando el pellet.</li>
	<li>Filtrar-esterilizar el sobrenadante utilizando una membrana de 0,22 μm. Almacene las muestras en hielo y proceda al protocolo de aclaración (sección 2), según corresponda. NOTA: Las muestras pueden congelarse rápidamente en nitrógeno líquido y almacenarse a -20 °C para ser utilizadas como extractos crudos.</li>
</ol>2. Aclaración del extracto de molusco
<ol><li>Colocar la muestra sobrenadante del paso 1.8 en un baño térmico a 60 °C durante 30 min. Luego, enfríe las muestras rápidamente transfiriéndolas a un cubo con hielo durante 20 minutos.</li>
	<li>Centrifugar las muestras a 15.000 × g durante 45 min a 4 °C. Recoja el sobrenadante en un tubo fresco de 50 ml y deseche el pellet. Esterilice con filtro las muestras con un filtro de membrana de 0,22 μm y luego guárdelas en hielo.</li>
	<li>Determinar la concentración de proteína en las muestras a partir del paso 1.8 (es decir, el extracto crudo) y el paso 2.2 (es decir, el extracto clarificado) utilizando un ensayo de cuantificación (por ejemplo, ensayo de ácido bicinchonínico17). El rango óptimo de concentración de proteínas es de 4-8 mg/ml.</li>
	<li>Almacene las muestras en hielo durante un máximo de 1 h o congele rápidamente en nitrógeno líquido, y guárdelas a -20 °C hasta que sea necesario.</li>
</ol>3. Ensayo de actividad inhibitoria
<ol><li>Medir la actividad inhibitoria de los extractos crudos y clarificados utilizando ensayos enzimáticos en triplicado técnico. NOTA: Cada ensayo enzimático consiste en una enzima (por ejemplo, subtilisina A, que está involucrada en la virulencia fúngica 16,17,18; generalmente alrededor de 1 x 10-9 mol / L para ensayos basados en cromogenia), un tampón y un sustrato. La reacción comienza cuando el sustrato se encuentra con la enzima. La actividad enzimática es proporcional a la tasa de conversión del sustrato en el producto.</li>
	<li>Evaluar el efecto de la concentración enzimática (CE) sobre la actividad enzimática (EA) hasta obtener una dependencia lineal entre ambos parámetros. Para los siguientes pasos, utilice una concentración de enzimas dentro del rango lineal medido. NOTA: El ensayo enzimático para la peptidasa subtilisina A se detalla en los siguientes pasos.</li>
	<li>Incubar los extractos de proteína de moluscos crudos (paso 1.11) o clarificados (paso 2.5) (por ejemplo, 10 μL que contengan 4 mg/ml de proteína) con 10 μL de subtilisina A (concentración determinada a partir de la etapa 3.2) y 220 μL de Tris-HCl de 100 mM a pH 8,6 (para el control, añadir 230 μL de tampón Tris sin añadir el extracto) durante 10 min a 25 °C en una placa de fondo plano de 96 pocillos.</li>
	<li>Añadir 10 μL de N-Succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilida, el sustrato de la subtilisina A, a una concentración final de 1 K m (constante de Michaelis-Menten; 0,2mM para este sustrato con subtilisina A) para un volumen de reacción final de 250 μL.</li>
	<li>Mida la actividad enzimática monitoreando la apariencia del producto a lo largo del tiempo leyendo la densidad óptica (OD) a 405 nm cada 15 s durante 3 min.</li>
	<li>Determinar la actividad enzimática residual calculando la relación entre la actividad enzimática en presencia del extracto de molusco y la actividad en ausencia del extracto.</li>
	<li>Si se observa actividad inhibitoria (es decir, actividad residual por debajo de 1), medir el valor de concentración inhibitoria 50 (IC50) utilizando un rango de concentraciones de los extractos (por ejemplo, una serie de dilución doble de 200 μg/ml a 1 μg/ml) siguiendo los métodos estándar19.</li>
</ol>4. Efecto de los extractos de moluscos en el crecimiento de C. neoformans
<ol><li>Utilizar una punta de pipeta de 10 μL para introducir una sola colonia de C. neoformans var. grubii H99 de tipo salvaje (WT) en 5 ml de extracto de levadura-peptona-dextrosa (YPD) medio (10 g/L de extracto de levadura, 20 g/L de peptona y 20 g/L de dextrosa, pH 6,5), e incubar durante 16-18 h a 30 °C y 200 rpm. Realizar el experimento en triplicado biológico y duplicado técnico.</li>
	<li>Recolectar 500 μL del cultivo en una cubeta y medir el crecimiento leyendo el OD a 600 nm. Diluir el cultivo con levadura base de nitrógeno (YNB) medio a un ODfinal 600 de 0,02.</li>
	<li>Cocultivo de células de C. neoformans con diferentes concentraciones (por ejemplo, una serie de dilución triple de 440 μg/ml a 15 μg/ml de proteína) de los extractos (es decir, crudos y clarificados). Para ello, mezclar 10 μL de los extractos con 190 μL del cultivo diluido de C. neoformans (paso 4.2) en una placa de 96 pocillos.</li>
	<li>Mida el crecimiento leyendo el OD 600 utilizando un lector de placas cada 15 min a 1 h durante 72 h a200 rpm y 37 °C.</li>
</ol>5. Efecto de los extractos de moluscos en la producción de melanina de C. neoformans
<ol><li>Preparar placas de L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA).<ol><li>Autoclave 230 mL de agar 14 g/L, y dejar enfriar hasta que alcance los 50-60 °C.</li>
		<li>Agregue 3.25 mL de 1 M de glicina, 7.35 mL de 1 M KH 2 PO 4, 2.5 mL de 1 M MgSO4.7H 2 O, 0.6 mL de 40% de glucosa, 70 μL de 10 mM de tiamina y2.5mL de 100 mM L-DOPA (esterilizada por filtro) al agar líquido.</li>
		<li>Vierta 15 ml de la mezcla en placas de Petri, déjelas secar durante aproximadamente 1 h en la oscuridad y guárdelas a 2-4 °C durante un máximo de 1 semana. Asegúrese de que las tapas estén parcialmente levantadas para que el agar se seque correctamente.</li>
	</ol></li>
	<li>Inocular 5 mL de medio YNB con 50 μL de cultivo de C. neoformans a partir del paso 4.1. Incubar durante 16-18 h a 30 °C y 200 rpm.</li>
	<li>Girar las células a 1.000 × g durante 5 min a 4 °C. Lave las células 2 veces con solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) a pH 7.4.</li>
	<li>Contar las células con un hemocitómetro. Resuspender las células en 1 mL de PBS para alcanzar una concentración final de 106 células/mL.</li>
	<li>Prepare una serie de dilución (por ejemplo, doble) de los extractos de moluscos crudos y clarificados. Del mismo modo, prepare una serie de dilución de 10 veces de células de C. neoformans (paso 5.4) de 1 x 106 células/ml a 1 x 101 células/ml utilizando PBS estéril en placas de 96 pocillos.</li>
	<li>Extienda 200 μL de los extractos sobre placas de Petri que contengan agar L-DOPA con un hisopo y déjelos secar durante 15 minutos.</li>
	<li>Coloque 5 μL de cultivo de cada pocillo en la placa L-DOPA, dejando 1 cm entre gotas. Dejar secar en la oscuridad durante 15 min.</li>
	<li>Incubar las placas a 30 °C y 37 °C en una incubadora estática durante 3-5 días, capturando imágenes cada 24 h con una cámara o generador de imágenes de placas (por ejemplo, escáner). NOTA: Aquí se utilizan dos condiciones de temperatura para explorar la influencia de la temperatura en los efectos inhibidores del crecimiento de los extractos de moluscos, con 30 °C representando temperaturas ambientales y 37 °C representando temperaturas fisiológicas humanas.</li>
</ol>6. Efecto de los extractos de moluscos en la producción de cápsulas polisacáridas de C. neoformans
<ol><li>Prepare un medio bajo en hierro (LIM) como se describe a continuación.<ol><li>Disuelva 5 g de resina quelante (consulte la Tabla de materiales) en 60 ml de agua ultrapura y empaquétela en una columna de vidrio (2 cm de diámetro x 25 cm de largo). Lave la columna con 100 ml de agua y deseche el agua recolectada.</li>
		<li>Prepare agua baja en hierro (LI-water) pasando 2 L de agua ultrapura estéril a través de la columna quelante. Conservar el LI-water a 4 °C durante un máximo de 3 meses.</li>
		<li>Disuelva 5 g de glucosa en 100 ml de LI-agua. Disuelva 5 g de L-asparagina en 200 ml de LI-agua en un vaso de precipitados separado.</li>
		<li>Agregue lo siguiente a 500 ml de LI-agua en orden: 4.78 g de HEPES, 0.4 g de K 2 HPO 4,0.08 g de MgSO4.7H 2 O, 1.85 g de NaHCO3 y 0.25 g de CaCl 2.2H 2 O.</li>
		<li>Combine las soluciones del paso 6.1.3 y del paso 6.1.4. Añadir 1 ml de sal sódica (BPS) de ácido batofenofenontrolina disulfónico a una concentración final de 100 μM.</li>
		<li>Ajuste el pH a 7,2 con 1 M LI-MOPS. Agregue LI-agua a un volumen final de 1 L, y filtre y esterilice el medio pasándolo a través de una membrana de 0,22 μm. Añadir 100 μL de tiamina estéril (4 mg/ml) al medio.</li>
	</ol></li>
	<li>Inocular 5 mL de medio YNB con 50 μL del cultivo de C. neoformans a partir de la etapa 4.1. Incubar durante 16-18 h a 30 °C y 200 rpm. Utilice este cultivo para inocular 5 ml de LIM a una concentración final de 105 células/ml.</li>
	<li>Añadir volúmenes apropiados de los extractos de moluscos (por ejemplo, una dilución doble o el volumen determinado a partir de ensayos de virulencia anteriores) para alcanzar las concentraciones deseadas. Incubar durante 72 h a 37 °C y 200 rpm con tapas aflojadas. Después de la incubación, recoger 1 ml de células, y lavar 2x con PBS estéril, pH 7,4, a 1.500 × g durante 2 min a 4 °C.</li>
	<li>Resuspenda suavemente las células en 1 ml de PBS. Mezcle las celdas con tinta china en una proporción de 1:1 (por ejemplo, 4 μL de tinta china con 4 μL de suspensión celular) sobre un portaobjetos de microscopio de vidrio. Coloque un cubreobjetos en la parte superior de la diapositiva.</li>
	<li>Visualice las muestras utilizando un microscopio de contraste de interferencia diferencial (DIC) con un objetivo de aceite de 63x (consulte la Tabla de materiales). Ajuste el contraste a automático y enfoque manualmente con el dial del microscopio. Seleccione todas las imágenes y expórtelas en formato TIFF. No es necesario aplicar filtros.</li>
	<li>Usando la herramienta de regla en ImageJ20, cuantifique la relación entre el tamaño total de la célula (incluida la cápsula) y el tamaño del cuerpo de la célula.</li>
</ol>7. Efecto de los extractos de moluscos en la producción de biofilm de C. neoformans
<ol><li>Inocular 5 mL de medio YNB con 50 μL de cultivo de C. neoformans a partir del paso 4.1. Incubar durante 16-18 h a 30 °C y 200 rpm.</li>
	<li>Recolectar células del cultivo de 5 ml. Lavar las celdas con PBS estéril, pH 7,4, a 1.500 × g durante 2 min a 4 °C.</li>
	<li>Contar las células con un hemocitómetro. Resuspender las células en 3 ml del medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco a una concentración final de 107 células/ml.</li>
	<li>Transfiera 300 μL de la suspensión celular a los pocillos individuales de una placa estéril, de poliestireno, de fondo plano de 24 pocillos. Utilice pozos con medios sólo como control.</li>
	<li>Añadir volúmenes apropiados de los extractos de moluscos (por ejemplo, una dilución doble o el volumen determinado a partir de ensayos de virulencia anteriores) para alcanzar una concentración final de 10-20 μg/ml de proteína. Asegúrese de que el volumen del extracto no sea superior al 10% del volumen total.</li>
	<li>Envolver las placas con papel de aluminio (para evitar la evaporación del medio) e incubar durante 48 h utilizando una incubadora estática a 30 °C y 37 °C.</li>
	<li>Usando una botella o dispensador, lave los pocillos 2 veces con agua estéril y déjelos secar al aire durante 10-15 minutos a temperatura ambiente. Luego, agregue 100 μL de solución de cristal violeta al 0,3% a cada pocillo (incluidos los pocillos de control de solo medio) e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos.</li>
	<li>Lave bien los pozos 3 veces con agua estéril (las biopelículas no se interrumpirán durante el lavado). Añadir 200 μL de etanol al 100% e incubar durante 10 min a RT.</li>
	<li>Transfiera 75 μL a una nueva placa de fondo plano de 96 pocillos y lea el OD550. Cuantificar la formación de biofilm como (OD 550nm de muestra - OD550nm de blanco). </li>
</ol>

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<li>Costa, H. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JcTI-I%3A+A+novel+trypsin+inhibitor+from+Jatropha+curcas+seed+cake+with+potential+for+bacterial+infection+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">JcTI-I: A novel trypsin inhibitor from Jatropha curcas seed cake with potential for bacterial infection treatment.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 5(2014).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

El protocolo de extracción descrito aquí describe el aislamiento de compuestos de moluscos recolectados en Ontario, Canadá, y demuestra una investigación novedosa del uso de extractos de moluscos contra el patógeno fúngico humano, C. neoformans. Este protocolo se suma a un creciente cuerpo de investigación que investiga la actividad de los inhibidores de peptidasa de los invertebrados13. Durante la extracción, algunas muestras de extracto fueron difíciles de filtrar-esterilizar, posibleme...

Cryptococcus neoformans es un patógeno fúngico humano que produce enfermedad grave en huéspedes inmunocomprometidos, como las personas que viven con VIH / SIDA1, y conduce a aproximadamente el 19% de las muertes relacionadas con el SIDA2. El hongo es susceptible a varias clases de antifúngicos, incluyendo azoles, polienos y flucitosina, que ejercen actividad fungicida y fungistática utilizando mecanismos distintos 3,4. Sin embargo, el uso extensivo de antifúngicos en entornos clínicos y agrícolas combinado con la hibridación de cepas ha amplificado la evolución de la resistencia en múltiples especies de hongos, incluyendo C. neoformans5.
Para superar los desafíos de la resistencia a los antifúngicos y reducir la prevalencia de infecciones fúngicas a escala global, un enfoque prometedor es utilizar los factores de virulencia de Cryptococcus spp. (por ejemplo, adaptabilidad a la temperatura, cápsula de polisacáridos, melanina y enzimas extracelulares) como posibles objetivos terapéuticos 4,6 . Este enfoque tiene varias ventajas, ya que estos factores de virulencia están bien caracterizados en la literatura, y dirigirse a estos factores podría reducir potencialmente las tasas de resistencia a los antifúngicos al imponer una presión selectiva más débil al perjudicar la virulencia en lugar de apuntar al crecimiento celular6. En este contexto, numerosos estudios han evaluado la posibilidad de dirigirse a enzimas extracelulares (por ejemplo, proteasas, peptidasas) para reducir o inhibir la virulencia de Cryptococcus spp.7,8,9. 
Los organismos como los invertebrados y las plantas no poseen un sistema inmune adaptativo para protegerse de los patógenos. Sin embargo, dependen de un fuerte sistema inmune innato con una inmensa variedad de compuestos químicos para hacer frente a microorganismos y depredadores10. Estas moléculas incluyen inhibidores de peptidasa, que juegan un papel importante en muchos sistemas biológicos, incluyendo los procesos celulares de inmunidad de invertebrados, como la coagulación de la hemolinfa, la síntesis de citoquinas y péptidos antimicrobianos, y la protección de los huéspedes mediante la inactivación directa de las proteasas de los patógenos11. Por lo tanto, los inhibidores de peptidasa de invertebrados como los moluscos poseen aplicaciones biomédicas potenciales, pero muchos permanecen sin caracterizar10,12,13. En este contexto, hay aproximadamente 34 especies de moluscos terrestres en Ontario y 180 moluscos de agua dulce en Canadá14. Sin embargo, su perfil y caracterización en profundidad aún son limitados15. Estos organismos presentan una oportunidad para la identificación de nuevos compuestos con potencial actividad antifúngica10.
En este protocolo, se describen métodos para aislar y aclarar extractos de invertebrados (por ejemplo, moluscos) (Figura 1) seguidos de medir la supuesta actividad inhibidora de la peptidasa. Las propiedades antifúngicas de estos extractos se evalúan midiendo su impacto en la producción del factor de virulencia de C. neoformans utilizando ensayos fenotípicos (Figura 2). Es importante tener en cuenta que las diferencias en las propiedades antifúngicas entre los extractos crudos y clarificados pueden ser indicativas de factores microbianos (por ejemplo, metabolitos secundarios o toxinas producidas por el microbioma huésped) del molusco, que pueden influir en las observaciones experimentales. Tales hallazgos respaldan la necesidad de que este protocolo evalúe extractos crudos y aclarados de forma independiente para desentrañar los modos de acción. Además, el proceso de extracción es imparcial y puede permitir la detección de propiedades antimicrobianas contra una gran cantidad de patógenos fúngicos y bacterianos. Por lo tanto, este protocolo proporciona un punto de partida para la priorización de especies de moluscos con propiedades antifúngicas contra C. neoformans y una oportunidad para evaluar las conexiones entre la actividad enzimática y la producción de factores de virulencia a través de supuestos mecanismos inhibitorios.

<table><tbody><tr><td>0.2 &mu; m Filtros</td><td>VWR</td><td>28145-477 (Norteamérica)</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 1,5 mL (Safe-Lock)</td><td>Tubos Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>2 mL (Safe-Lock)</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>3,4-Dihidroxi-L-fenilalanina (L-DOPA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9628-5G</td><td>CAS #: 59-92-7</td></tr><tr><td>Placas de 96 pocillos</td><td>Costar (Corning)</td><td>3370</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Mezcladora Storm 24</td><td>NEXT ADVANCE</td><td>BBY24M</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5430R</td><td>Eppendorf</td><td>5428000010</td><td></td></tr><tr><td>Chelex 100 Resina</td><td>BioRad</td><td>142-1253</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubadora (Estática)</td><td>SANYO</td><td>No disponible</td><td></td></tr><tr><td>Cryptococcus neoformans H99</td><td>ATCC</td><td>208821</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio DIC</td><td>Software</td> de microscopio Olympus <td></td><td></td></tr><tr><td>DIC</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa (D-glucosa, anhidra, grado reactivo)</td><td>BioShop</td><td>GLU501</td><td>CAS #: 50-99-7</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Chemical</td><td>G46-1</td><td>CAS #: 56-40-6</td></tr><tr><td>GraphPad Prisma 9</td><td>Dotmatics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>VWR</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7 H2O)</td><td>Honeywell</td><td>M1880-500G</td><td>CAS #: 10034-99-8&nbsp;</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>BioShop</td><td>PEP403</td><td></td></tr><tr><td>Sal tampón de fososato pH 7.4</td><td>BioShop</td><td>PBS408</td><td>SKU: PBS408.500</td></tr><tr><td>Lector de placas (Synergy-H1)</td><td>BioTek (Agilent)</td><td>No disponible</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4)</td><td>Fisher Chemical</td><td>P285-500</td><td>CAS #: 7778-77-0</td></tr><tr><td>Subtilisina A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4860</td><td>CAS #: 9014-01-01</td></tr><tr><td>Succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>573462</td><td>CAS #: 70967-97-4</td></tr><tr><td>Baño termal</td><td>VWR</td><td>76308-834</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de tiamina</td><td>Fisher-Bioreactivos</td><td>BP892-100</td><td>CAS #: 67-03-8</td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>BioShop</td><td>YEX401</td><td>CAS #: 8013-01-2</td></tr><tr><td>Levadura base de nitrógeno (con aminoácidos)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1250-250G</td><td>YNB&nbsp;</td></tr></tbody></table>

evaluación de las propiedades anticriptocócicas putativas de extractos crudos y clarificados de moluscos

Assessing the Putative Anticryptococcal Properties of Crude and Clarified Extracts from Mollusks

Cryptococcus neoformans es un patógeno fúngico humano encapsulado con una distribución global que infecta principalmente a individuos inmunocomprometidos. El uso generalizado de antifúngicos en entornos clínicos, su uso en la agricultura y la hibridación de cepas han llevado a una mayor evolución de la resistencia. Esta creciente tasa de resistencia contra los antifúngicos es una preocupación creciente entre los médicos y científicos de todo el mundo, y existe una mayor urgencia para desarrollar nuevas terapias antimicóticas. Por ejemplo, C. neoformans produce varios factores de virulencia, incluyendo enzimas intra y extracelulares (por ejemplo, peptidasas) con roles en la degradación de tejidos, regulación celular y adquisición de nutrientes. La interrupción de dicha actividad peptidasa por inhibidores perturba el crecimiento y la proliferación de hongos, lo que sugiere que esta puede ser una estrategia importante para combatir el patógeno. Es importante destacar que los invertebrados como los moluscos producen inhibidores de la peptidasa con aplicaciones biomédicas y actividad antimicrobiana, pero están poco explorados en términos de su uso contra patógenos fúngicos. En este protocolo, se realizó una extracción global de moluscos para aislar posibles inhibidores de peptidasa en extractos crudos y clarificados, y se evaluaron sus efectos contra los factores clásicos de virulencia criptocócica. Este método apoya la priorización de moluscos con propiedades antifúngicas y brinda oportunidades para el descubrimiento de agentes antivirulentes al aprovechar los inhibidores naturales que se encuentran en los moluscos.

El flujo de trabajo descrito en este documento permite el aislamiento de proteínas y péptidos de moluscos con posibles propiedades antivirulencia contra C. neoformans. Del mismo modo, la evaluación de diferentes formas de extractos (es decir, crudos y clarificados) permite la semipurificación de los compuestos activos potenciales y apoya la evaluación posterior (por ejemplo, proteómica basada en espectrometría de masas). Típicamente, el flujo de trabajo de extracción de proteínas produce soluciones homogeneizada...

El patógeno fúngico humano Cryptococcus neoformans produce una variedad de factores de virulencia (por ejemplo, peptidasas) para promover su supervivencia dentro del huésped. Los nichos ambientales representan una fuente prometedora de nuevos inhibidores naturales de la peptidasa. Este protocolo describe la preparación de extractos de moluscos y la evaluación de su efecto sobre la producción de factores de virulencia fúngica.

Evaluación de las propiedades anticriptocócicas putativas de extractos crudos y clarificados de moluscos

Cryptococcus neoformans is an encapsulated human fungal pathogen with a global distribution that primarily infects immunocompromised individuals. The ...

Este protocolo permite el aislamiento de compuestos de moluscos con propiedades anticriptocócicas. Esta técnica ofrece un enfoque imparcial para identificar y aislar compuestos de moluscos con propiedades potenciales, incluida la eliminación de patógenos fúngicos humanos. Hay otros compuestos, como los inhibidores de la proteasa del VIH, que se utilizan para tratar a los pacientes con VIH.Sin embargo, la expansión a otros patógenos, así como la investigación de fuentes naturales, representa nuevas vías de descubrimiento. El último paso es el más difícil ya que las muestras pueden no filtrarse. Como resultado, es posible que sea necesario diluir las muestras para filtrar.Comience recolectando moluscos como Cipangopaludina chinensis de un área natural designada y aprobada. Seleccione especies nativas e invasoras para evaluar una amplia gama de posibles efectos antifúngicos. Rompa suavemente la cáscara de la C.chinensis con un mortero y retire las piezas sólidas con un par de pinzas.Generalmente, 10 moluscos se agrupan para el protocolo. Recoja y pese aproximadamente de 15 a 20 gramos de la muestra y use tijeras para cortar los órganos en trozos pequeños de aproximadamente 0.5 a un centímetro de tamaño. Congele rápidamente las muestras de órganos diseccionadas y cortadas con nitrógeno líquido antes de moler las muestras de órganos en un polvo fino con un mortero.Una vez hecho esto, agregue aproximadamente 15 gramos del polvo de muestra de órgano a 30 mililitros de agua destilada fría para lograr una proporción de uno a dos. Vierta dos mililitros de la muestra en tubos de dos mililitros de alto impacto y agregue aproximadamente 500 microgramos de perlas de acero inoxidable de tres milímetros a cada tubo. Homogeneice durante tres minutos a 1, 200 RPM en cuatro grados centígrados usando una licuadora de balas o un batidor de cuentas.Centrifugar el tubo a 12, 000 G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Recoja el sobrenadante en un tubo fresco de 50 mililitros y deseche el pellet. Esterilice el sobrenadante con filtro con una membrana de 0,22 micrómetros y almacene las muestras en hielo antes de aclarar el extracto.Coloque la muestra sobrenadante en un baño térmico a 60 grados centígrados durante 30 minutos e inmediatamente enfríela transfiriendo la muestra a un cubo lleno de hielo durante 20 minutos. Centrifugar las muestras frías a 15, 000 G durante 45 minutos a cuatro grados centígrados. Recoja el sobrenadante en un tubo fresco de 50 mililitros y deseche el pellet.Esterilice las muestras con un filtro de membrana de 0,22 micras y luego guárdelas en hielo. Una vez hecho esto, determine la concentración de proteína en el crudo y los extractos clarificados utilizando un ensayo de cuantificación. El rango óptimo de concentración de proteínas es de cuatro a ocho microgramos por mililitro.Incubar las muestras en hielo durante un máximo de una hora o congelar rápidamente en nitrógeno líquido antes de almacenarlas a menos 20 grados centígrados hasta que sea necesario. En una placa de fondo plano de 96 pocillos, incubar 10 microlitros de cuatro miligramos por mililitro de extracto de proteína de molusco crudo o clarificado, 10 microlitros de subtilisina A, con una concentración dentro del rango lineal medido, y 220 microlitros de clorhidrato de tris 100 milimolares de pH de 8.6 durante 10 minutos a 25 grados centígrados. Luego agregue 10 microlitros de N-succinil-alanina, alanina, prolina, fenolalanina, p-nitroanilina, el sustrato para subtilisina A, a una concentración final de un KM para un volumen de reacción final de 250 microlitros.Una vez hecho esto, mida la actividad enzimática monitoreando la densidad óptica a 405 nanómetros cada 15 segundos durante tres minutos. Asegúrese de que los pocillos sin extractos produzcan una curva recta durante la lectura. Para determinar la actividad enzimática residual, calcule la relación entre la actividad enzimática en presencia de extracto de molusco y la que existe en ausencia del extracto.Si se observa actividad inhibitoria, medir el valor de concentración inhibitoria 50 o IC50 utilizando un rango de concentraciones de los extractos. Introducir una sola colonia de C.neoformans H99 tipo salvaje en cinco mililitros de extracto de levadura peptona dextrosa o medio YEPD utilizando una punta de pipeta de 10 microlitros e incubar durante 16 a 18 horas a 30 grados centígrados y 200 RPM. Recolectar 500 microlitros del cultivo en una cubeta y medir el crecimiento leyendo la densidad óptica a 600 nanómetros.Diluir el cultivo con levadura base de nitrógeno o medio YNB a una densidad óptica final de 0,02. Cocultivo de células de C.neoformans con diferentes concentraciones de extractos crudos y clarificados mezclando 10 microlitros de los extractos con 190 microlitros del cultivo diluido de C.neoformans en una placa de 96 pocillos. Mida el crecimiento leyendo la densidad óptica a 600 nanómetros usando un lector de placas cada 15 minutos a una hora durante 72 horas a 200 RPM y 37 grados centígrados.Los extractos de C.chinensis fueron capaces de inhibir la actividad proteolítica de la subtilisina A, que está relacionada con la virulencia en Cryptococcus neoformans con un valor IC50 de 5,3 microgramos por mililitro en extractos crudos y 4,53 microgramos por mililitro en extractos clarificados. La evaluación de los extractos de C.chinensis contra los procesos asociados con la producción del factor de virulencia de C.Neoformens, incluido el crecimiento fúngico, mostró que hubo una reducción significativa en el crecimiento de hongos a 37 grados centígrados en presencia de los extractos crudos y clarificados de C.chinensis. La evaluación de los extractos contra la cápsula, la producción de melanina y la formación de biopelículas mostró que no hubo cambios en la producción de cápsulas o melanina en presencia de extractos crudos o clarificados de C. chinensis.Sin embargo, se observó una reducción significativa del 70 al 80% en la formación de biopelículas a altas concentraciones de extractos crudos y clarificados en relación con el control no tratado. El éxito del protocolo depende del procedimiento de extracción adecuado, incluida la molienda, la adición de la cantidad adecuada de enzima y la lectura después de la adición del sustrato. La técnica se centra en la tolerancia térmica como un importante factor de virulencia criptocócica.Sin embargo, se pueden evaluar otros factores de virulencia como la producción de melanina y cápsulas, así como la formación de biopelículas. Estos resultados abren nuevas vías que constituyen nuevos enfoques sobre estrategias antifúngicas utilizando compuestos naturales que ofrecen más estabilidad, especificidad y son menos propensos a la resistencia. El objetivo a largo plazo es encontrar nuevos métodos contra estos patógenos fúngicos y minimizar los mecanismos de resistencia.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video muestra un ensayo in vitro para detectar compuestos antifúngicos utilizando un ensayo de microdilución de caldo. Los compuestos de prueba se diluyen en serie en una placa de microtitulación y se incuban con un inóculo fúngico. Después de la incubación, se examina la placa en busca de pocillos sin crecimiento fúngico visible para evaluar el potencial antifúngico de los compuestos de prueba y su concentración inhibitoria mínima (CMI).

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Microdilución en Vitro proyección de caldo: un método fácil y rápido para detectar nuevos compuestos antimicóticos

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Evaluación de las propiedades anticriptocócicas putativas de extractos crudos y clarificados de moluscos

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