Name: Análisis poblacional y unicelular de la persistencia antibiótica en Escherichia coli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T13:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Aprende a analizar la persistencia antibiótica en Escherichia coli mediante ensayos microbiológicos clásicos combinados con imagen en vivo de células individuales. Este método permite caracterizar fenotipos persistentes a nivel poblacional y unicelular.

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El trabajo en el laboratorio de Van Melderen está respaldado por las acciones ARC 2018-2023, el Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS CDR J.0182.21F). T.O. es apoyado por una beca ULB. T.S. cuenta con el apoyo de una beca FRIA (FNRS). J.C. cuenta con el apoyo de una beca postdoctoral "chargé de recherches" (FNRS).

<ol><li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitions+and+guidelines+for+research+on+antibiotic+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Definitions and guidelines for research on antibiotic persistence.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (7), 441-448 (2019).</li>
<li>Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinguishing+between+resistance%2C+tolerance+and+persistence+to+antibiotic+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 320-330 (2016).</li>
<li>Pribis, J. P., Zhai, Y., Hastings, P. J., Rosenberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress-induced+mutagenesis%2C+gambler+cells%2C+and+stealth+targeting+antibiotic-induced+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Stress-induced mutagenesis, gambler cells, and stealth targeting antibiotic-induced evolution.</a> mBio. 13 (3), 01074(2022).</li>
<li>Molina-Quiroz, R. C., Lazinski, D. W., Camilli, A., Levy, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-sequencing+analysis+unveils+novel+genes+involved+in+the+generation+of+persister+cells+in+uropathogenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Transposon-sequencing analysis unveils novel genes involved in the generation of persister cells in uropathogenic Escherichia coli.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (11), 6907-6910 (2016).</li>
<li>Cameron, D. R., Shan, Y., Zalis, E. A., Isabella, V., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+determinant+of+persister+cell+formation+in+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">A genetic determinant of persister cell formation in bacterial pathogens.</a> Journal of Bacteriology. 200 (17), 00303-00318 (2018).</li>
<li>Cui, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+involved+in+bacteriostatic+antibiotic-induced+persister+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of genes involved in bacteriostatic antibiotic-induced persister formation.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 413(2018).</li>
<li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+genes+involved+in+Escherichia+coli+persistence+to+tosufloxacin%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of novel genes involved in Escherichia coli persistence to tosufloxacin.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 581986(2020).</li>
<li>Verstraeten, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obg+and+membrane+depolarization+are+part+of+a+microbial+bet-hedging+strategy+that+leads+to+antibiotic+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Obg and membrane depolarization are part of a microbial bet-hedging strategy that leads to antibiotic tolerance.</a> Molecular Cell. 59 (1), 9-21 (2015).</li>
<li>Hofsteenge, N., van Nimwegen, E., Silander, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+persister+fractions+suggests+different+mechanisms+of+formation+among+environmental+isolates+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of persister fractions suggests different mechanisms of formation among environmental isolates of E. coli.</a> BMC Microbiology. 13 (1), 25(2013).</li>
<li>Huemer, M., Mairpady Shambat, S., Brugger, S. D., Zinkernagel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+and+persistence-Implications+for+human+health+and+treatment+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance and persistence-Implications for human health and treatment perspectives.</a> EMBO Reports. 21 (12), 51034(2020).</li>
<li>Wilmaerts, D., Windels, E. M., Verstraeten, N., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+mechanisms+leading+to+persister+formation+and+awakening%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">General mechanisms leading to persister formation and awakening.</a> Trends in Genetics. 35 (6), 401-411 (2019).</li>
<li>Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ploidy+is+an+important+determinant+of+fluoroquinolone+persister+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Ploidy is an important determinant of fluoroquinolone persister survival.</a> Current Biology. 31 (10), 2039-2050 (2021).</li>
<li>Lemma, A. S., Soto-Echevarria, N., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoroquinolone+persistence+in+Escherichia+coli+requires+DNA+repair+despite+differing+between+starving+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Fluoroquinolone persistence in Escherichia coli requires DNA repair despite differing between starving populations.</a> Microorganisms. 10 (2), 286(2022).</li>
<li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).</li>
<li>Morawska, L. P., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+tolerance+in+environmentally+stressed+Bacillus+subtilis%3A+Physical+barriers+and+induction+of+a+viable+but+nonculturable+state%5BTitle%5D)+AND+%22microLife%22%5BJournal%5D)">Antibiotic tolerance in environmentally stressed Bacillus subtilis: Physical barriers and induction of a viable but nonculturable state.</a> microLife. 3, (2022).</li>
<li>Windels, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+persisters+enabled+by+a+%C3%9F-lactam-induced+filamentation+method+reveals+their+stochastic+single-cell+awakening%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Enrichment of persisters enabled by a ß-lactam-induced filamentation method reveals their stochastic single-cell awakening.</a> Communications Biology. 2 (1), 426(2019).</li>
<li>Leygeber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+microbial+population+heterogeneity-Expanding+the+toolbox+of+microfluidic+single-cell+cultivations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analyzing microbial population heterogeneity-Expanding the toolbox of microfluidic single-cell cultivations.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (23), 4569-4588 (2019).</li>
<li>Rojas, E., Theriot, J. A., Huang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+Escherichia+coli+growth+rate+to+osmotic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Response of Escherichia coli growth rate to osmotic shock.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7807-7812 (2014).</li>
<li>Shi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starvation+induces+shrinkage+of+the+bacterial+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Starvation induces shrinkage of the bacterial cytoplasm.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (24), 2104686118(2021).</li>
<li>Goode, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persister+Escherichia+coli+cells+have+a+lower+intracellular+pH+than+susceptible+cells+but+maintain+their+pH+in+response+to+antibiotic+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Persister Escherichia coli cells have a lower intracellular pH than susceptible cells but maintain their pH in response to antibiotic treatment.</a> mBio. 12 (4), 00909-00921 (2021).</li>
<li>Manuse, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+persisters+are+a+stochastically+formed+subpopulation+of+low-energy+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Bacterial persisters are a stochastically formed subpopulation of low-energy cells.</a> PLoS Biology. 19 (4), 3001194(2021).</li>
<li>Fisher, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-dimensional+imaging+of+E.+coli+nucleoid+organization+and+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Four-dimensional imaging of E. coli nucleoid organization and dynamics in living cells.</a> Cell. 153 (4), 882-895 (2013).</li>
<li>Cabral, D., Wurster, J., Belenky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+persistence+as+a+metabolic+adaptation%3A+Stress%2C+metabolism%2C+the+host%2C+and+new+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals%22%5BJournal%5D)">Antibiotic persistence as a metabolic adaptation: Stress, metabolism, the host, and new directions.</a> Pharmaceuticals. 11 (1), 14(2018).</li>
<li>Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agar+and+broth+dilution+methods+to+determine+the+minimal+inhibitory+concentration+%28MIC%29+of+antimicrobial+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances.</a> Nature Protocols. 3 (2), 163-175 (2008).</li>
<li>Goormaghtigh, F., Van Melderen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+imaging+and+characterization+of+Escherichia+coli+persister+cells+to+ofloxacin+in+exponential+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Single-cell imaging and characterization of Escherichia coli persister cells to ofloxacin in exponential cultures.</a> Science Advances. 5 (6), (2019).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicrobeJ%2C+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nature Microbiology. 1 (7), 16077(2016).</li>
<li>Odsbu, I., Skarstad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+compaction+in+the+early+part+of+the+SOS+response+is+dependent+on+RecN+and+RecA%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">DNA compaction in the early part of the SOS response is dependent on RecN and RecA.</a> Microbiology. 160 (5), 872-882 (2014).</li>
<li>Pham, T. D. M., Ziora, Z. M., Blaskovich, M. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quinolone+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22MedChemComm%22%5BJournal%5D)">Quinolone antibiotics.</a> MedChemComm. 10 (10), 1719-1739 (2019).</li>
<li>Drlica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quinolones%3A+Action+and+resistance+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quinolones: Action and resistance updated.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 9 (11), 981-998 (2009).</li>
<li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+antibiotics+kill+bacteria%3A+From+targets+to+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">How antibiotics kill bacteria: From targets to networks.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (6), 423-435 (2010).</li>
<li>Reyes-Lamothe, R., Sherratt, D. J., Leake, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+and+architecture+of+active+DNA+replication+machinery+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry and architecture of active DNA replication machinery in Escherichia coli.</a> Science. 328 (5977), 498-501 (2010).</li>
<li>Lesterlin, C., Ball, G., Schermelleh, L., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecA+bundles+mediate+homology+pairing+between+distant+sisters+during+DNA+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RecA bundles mediate homology pairing between distant sisters during DNA break repair.</a> Nature. 506 (7487), 249-253 (2014).</li>
<li>Alexeeva, S., Gadella, T. W. J., Verheul, J., Verhoeven, G. S., Den Blaauwen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+interactions+of+early+and+late+assembling+division+proteins+in+Escherichia+coli+cells+resolved+by+FRET%3A+Bacterial+division+studied+by+spectral+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Direct interactions of early and late assembling division proteins in Escherichia coli cells resolved by FRET: Bacterial division studied by spectral FRET.</a> Molecular Microbiology. 77 (2), 384-398 (2010).</li>
<li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Yaginuma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+in+ATP+concentrations+in+a+single+bacterial+cell+population+revealed+by+quantitative+single-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Diversity in ATP concentrations in a single bacterial cell population revealed by quantitative single-cell imaging.</a> Scientific Reports. 4, 6522(2014).</li>
<li>Ermakova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+fluorescent+genetically+encoded+indicator+for+intracellular+hydrogen+peroxide%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide.</a> Nature Communications. 5, 5222(2014).</li>
<li>Kapuscinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAPI%3A+A+DNA-specific+fluorescent+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">DAPI: A DNA-specific fluorescent probe.</a> Biotechnic & Histochemistry. 70 (5), 220-233 (1995).</li>
</ol>

Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos.

El protocolo presentado en este trabajo permite analizar el fenotipo de persistencia observado en respuesta al tratamiento antibiótico a nivel poblacional y unicelular. Los experimentos se realizaron con la cepa MG1655 de E. coli, que se cultivó en un medio químicamente definido (glicerol MOPS 0,4%). Se llevaron a cabo ensayos de muerte temporal y experimentos de microscopía en cultivos de fase exponencial. Utilizamos OFX, una fluoroquinolona, a una concentración de 5 μg·mL−1 para revelar las células persistentes. Los enfoques aquí descritos pueden ser aplicados a otros antibióticos bactericidas, como β-lactámicos, aminoglucósidos o compuestos antimicrobianos31. En consecuencia, se pueden usar otras cepas bacterianas, medios o condiciones de crecimiento. El monitoreo de diferentes fusiones fluorescentes en una configuración similar a la descrita aquí puede ser útil para seguir procesos celulares como la replicación del ADN32, la reparación del ADN25,33 y la división celular34 antes, durante y después del tratamiento con antibióticos. Del mismo modo, los reporteros fluorescentes pueden ser explotados para investigar distintos aspectos de la fisiología celular, como los niveles intracelularesde pH 35, ATP 36 o ROS37. Alternativamente a las fusiones fluorescentes, también se podrían aplicar tintes químicos. Por ejemplo, la fusión hupA-mCherry podría ser reemplazada por 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), un colorante fluorescente que tiñe el ADN38. Sin embargo, se debe evitar la realización de microscopía de lapso de tiempo junto con tales tintes fluorescentes, ya que estas técnicas de tinción pueden perturbar la dinámica del ciclo celular durante los experimentos de lapso de tiempo. Alternativamente, tales experimentos pueden ser reemplazados por análisis de curso temporal de imágenes instantáneas en puntos de tiempo relevantes.
Si bien estos reporteros fluorescentes son útiles, no se debe descuidar la cantidad de información que se puede extraer a través del análisis de imágenes de contraste de fase. Aquí, monitoreamos la evolución de la longitud celular a lo largo del crecimiento, el tratamiento OFX y las etapas de recuperación. Otros parámetros basados en imágenes de contraste de fase, como el ancho de la célula, la intensidad del contraste de fase y las curvaturas de las células bacterianas, también se pueden extraer con facilidad utilizando un software adecuado, como MicrobeJ27.
En resumen, el procedimiento descrito aquí puede ser aplicado a otras condiciones y especies bacterianas para monitorear las respuestas celulares a ambientes cambiantes o factores estresantes18,19. Mediante el uso de otros reporteros fluorescentes (reporteros transcripcionales y traslacionales, colorantes químicos) en combinación con un análisis de población, como citometría de flujo / FACS, se pueden abordar preguntas interesantes en un marco multiescala.

Este protocolo tiene como objetivo analizar el fenotipo de persistencia bacteriana en respuesta al tratamiento antibiótico específico a nivel unicelular y poblacional. La persistencia describe la capacidad de pequeñas subpoblaciones dentro de una población isogénica para soportar altas dosis de antibióticos bactericidas (fluoroquinolonas, aminoglucósidos, β-lactámicos, etc.), siendo la concentración inhibitoria mínima (CMI) de las llamadas células persistentes idéntica a la del grueso de la población. La dinámica de muerte bifásica, al medir la supervivencia bacteriana a lo largo del tiempo en presencia de un antibiótico, revela la presencia de células transitoriamente tolerantes a los medicamentos, con una rápida erradicación inicial de las células no persistentes, seguida de una tasa de eliminación mucho más lenta de las células persistentes. Tras la eliminación de antibióticos, estas células dan lugar a una población genéticamente idéntica que muestra una dinámica de muerte similar cuando se trata con el mismo antibiótico 1,2. A diferencia de la persistencia, la resistencia a los antibióticos se define a nivel poblacional y generalmente es una consecuencia de mutaciones de novo o de la transferencia horizontal de genes de un plásmido que confiere resistencia3. Si bien las mutaciones responsables de la resistencia se localizan principalmente en el objetivo del fármaco o en las regiones promotoras de las bombas de eflujo del fármaco, los genes que alteran la frecuencia de persistencia identificados por los enfoques de análisis mutante dirigido y de todo el genoma han demostrado ser numerosos y diversos 2,3,4,5,6,7,8 . Por lo tanto, es probable que las células bacterianas puedan entrar en el estado persistente a través de múltiples vías 9,10,11, y se necesitan enfoques para investigar el fenómeno de persistencia a nivel unicelular para caracterizar la fisiología de estas células persistentes.
El reciente desarrollo de herramientas microfluídicas utilizadas en combinación con microscopía de fluorescencia ha allanado el camino para la caracterización del fenotipo de persistencia y ha destacado el papel de los procesos celulares clave, como la replicación cromosómica12, la reparación del ADN 13 y la división celular14, en la formación de células persistentes. En este artículo, describimos un enfoque integrado que combina ensayos microbiológicos clásicos con imágenes vivas de una sola célula para caracterizar las células persistentes generadas en cultivos de Escherichia coli de crecimiento exponencial tratados con una alta dosis de ofloxacina. El protocolo descrito aquí se puede aplicar para estudiar el fenómeno de persistencia antibiótica en otras especies bacterianas, como Bacillus subtilis15, o condiciones (por ejemplo, persistencia de antibióticos después del tratamiento con β-lactámicos 16) y puede modificarse fácilmente para investigar los muchos fenómenos que involucran heterogeneidad fenotípica17,18,19 . Además, la configuración descrita en este documento se puede combinar con otros reporteros fluorescentes para investigar distintos parámetros celulares de interés, como los niveles intracelulares de pH20 o ATP21 a nivel de una sola célula, que potencialmente pueden producir nuevos conocimientos sobre el fenómeno de persistencia de antibióticos.

<table><tbody><tr><td>Microscopio de fluorescencia invertida</td> <td>Axio Observer</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2.2H2O&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.02382.0250</td><td>Para MOPS glucosa 0,4% y MOPS glicerol 0,4%</td></tr><tr><td>medio de crecimiento Sistema microfluídico CellASIC ONIX&nbsp;</td><td>Merck</td><td>CAX2-S0000&nbsp;</td><td>Sistema microfluídico</td></tr><tr><td>CellASIC ONIX2 FG</td><td>Merck</td><td>ONIX2 1.0.1&nbsp;</td><td>Software microfluídico</td></tr><tr><td>CellASIC ONIX2 Colector Básico&nbsp;</td><td>Merck</td><td>CAX2-MBC20</td><td>Sistema de colectores</td></tr><tr><td>CoCl2.6H2O</td><td>Merck</td><td>1.02539.0100</td><td>Para MOPS glucosa 0.4% y MOPS glicerol 0.4% medio de crecimiento</td></tr><tr><td>CuSO4.5H2O</td><td>Merck</td><td>1.02790.0250</td><td>Para MOPS glucosa 0.4% y MOPS glicerol 0.4%</td></tr> medio <tr><td>de crecimiento D-(+)-glucosa Sigma</td><td>Aldrich</td><td>G7021-1KG</td><td>Fuente de carbono para la glucosa MOPS 0.4% de crecimiento medio</td></tr><tr><td>E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+)</td><td></td><td>BE10</td><td>cepa de referencia en peso, cepa de laboratorio</td></tr><tr><td>E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) hupA-mCherry::FRT-kan-FRT</td><td></td><td>BE16</td><td>HU-mFusión de cereza integrada a través de la transducción P1 en el locus nativo, cepa de laboratorio</td></tr><tr><td>FeSO4.7H2O&nbsp;</td><td>VWR Chemicals</td><td>24244.232</td><td>Para MOPS glucosa 0,4% y MOPS glicerol 0,4%</td></tr> medio de crecimiento <tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td>https://fiji.sc/&nbsp;</td><td>Software de imagen; Schindelin et al. si se utilizan en la publicación</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Merck</td><td>56815</td><td>Fuente de carbono para MOPS medio de crecimiento de glicerol al 0,4%</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR&reg; placa de cultivo multipocillo</td><td>Merck</td><td>M8812-100EA</td><td>Placa de cultivo de 2 ml de fondo plano transparente de 2 pocillos para lector de placas automatizado</td></tr><tr><td>H3BO3&nbsp; </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-1KG</td><td>Para MOPS glucosa 0.4% y MOPS glicerol 0.4%</td>medio de crecimiento</tr><tr><td>Cámara digital Hamamatsu ORCA Flash 4.0 Hamamatsu</td><td></td><td>C13440-20CU Adquisición de</td><td>imagen digital</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Merck</td><td>1.05099.1000</td><td>Para MOPS glucosa 0.4% y MOPS glicerol 0.4%</td></tr><tr><td>medio de crecimiento KOH</td><td>Merck</td><td>1.05029.1000</td><td>Para MOPS glucosa 0.4% y MOPS glicerol 0.4% medio</td></tr><tr><td>de crecimiento K2SO4&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.05153.0500</td><td>Para MOPS medio de crecimiento de glucosa al 0,4% y glicerol MOPS al 0,4%</td></tr> Medio <tr><td>de agar Luria-Broth</td><td>Invitrogen</td><td>22700041</td><td>Medio de crecimiento para el ensayo</td></tr><tr><td>de recubrimiento Medio de caldo Luria</td><td>12780029 Invitrogen</td><td></td><td>Medio de crecimiento para la determinación de CMI</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.05832.1000</td><td>Para MOPS glucosa al 0,4% y MOPS glicerol al 0,4%</td></tr><tr><td>medio de crecimiento MgSO4</td><td>Merck</td><td>7487-88-9 Solución de</td><td>dilución para el ensayo de supervivencia bacteriana utilizado a 10mM</td></tr><tr><td>MicrobeJ&nbsp;</td><td>Plugin Imagej/Fiji</td><td>https://www.microbej.com/</td> <td>Plugin de análisis de imágenes de microscopía. Ducret et al.for en publicación; Ajustes de detección: Para bacterias: Área (&mu; m2): 0,1-máx.; Longitud (&mu; m): 0,5-máx.; Anchura (&mu; m): 0,6-máx.; Rango (&mu; m): 0,5-máx.; Angularidad (rad): 0-0,3; 0-max para todos los demás parámetros.</td></tr><tr><td>placas microfluídicas CellASIC ONIX</td><td>Merck</td><td>B04A-03-5PK&nbsp;</td><td>Placa para sistema microfluídico</td></tr><tr><td>MnCl2.4H2O</td><td>Merck</td><td>1.05927.0100</td><td>Para MOPS glucosa 0.4% y MOPS glicerol 0.4%</td></tr><tr><td>medio de crecimiento MOPS, ácido libre ULTROL&reg; Grado</td><td>Merck</td><td>475898-500GM</td><td>Para MOPS glucosa 0.4% y MOPS glicerol 0.4%</td></tr><tr>medio de crecimiento<td>NaCl</td><td>SIgma-Aldrich</td><td>S5886-1KG</td><td>Para MOPS glucosa 0.4% y MOPS glicerol 0.4%</td> medio de crecimiento</tr> <tr><td>(NH4)6Mo7O24.4H2O</td><td>Merck</td><td>1.01180.0250</td><td>Para MOPS glucosa 0.4% y MOPS glicerol 0.4%</td></tr> medio de crecimiento <tr><td>NH4Cl&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.01145.0500</td><td>Para el medio de crecimiento MOPS glucosa al 0,4% y glicerol MOPS al 0,4%</td></tr><tr><td>Ofloxacina</td><td>Merck</td><td>82419-36-1</td><td>Antibiótico fluoroquinolona utilizado para tratar las células bacterianas</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,4, 1x</td><td>Merck</td><td>P3813</td><td>Tampón de dilución</td></tr><tr><td>GENESYS 10S Espectrofotómetro UV-Visible</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>&nbsp; 840-208200</td><td>Espectrofotómetro UV-Visible, soporte de una o seis celdas con impresoraMedición de la densidad óptica OD600nm</td></tr><tr><td>SoftMax Pro</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Software de lectura de microplacas</td></tr><tr><td>SpectraMax i3x</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Lector de microplacas</td></tr><tr><td>N-[Tris(hydroxym&eacute; thyl)-m&eacute; til]-glicina</td><td>Merck</td><td>1.08602.0250</td><td>Para MOPS glucosa 0,4% y MOPS glicerol 0,4%</td></tr> medio <tr><td>de inmersión Zeiss&reg; Aceite de inmersión 518F</td><td>Zeiss</td><td>Aceite de inmersión para aumentar la</td><td></td> resolución del microscopio</tr><tr><td>Zen3.2 Pro</td><td>Zeiss Software de</td><td></td><td>adquisición y procesamiento de imágenes microscópicas</td></tr><tr><td>ZnSO4.7H2O&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.08883.0500</td><td>Para el medio de crecimiento MOPS glucosa 0,4% y MOPS glicerol 0,4%</td></tr></tbody></table>

análisis poblacional y unicelular de la persistencia antibiótica en escherichia coli

Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

La persistencia de antibióticos se refiere a la capacidad de pequeñas subpoblaciones bacterianas para tolerar transitoriamente altas dosis de antibióticos bactericidas. Tras el tratamiento con antibióticos bactericidas, la mayor parte de la población bacteriana muere rápidamente. Esta primera fase rápida de matanza es seguida por una disminución sustancial en la tasa de muerte a medida que las células persistentes permanecen viables. Clásicamente, la persistencia se determina a nivel poblacional mediante ensayos de tiempo/muerte realizados con altas dosis de antibióticos y para tiempos de exposición definidos. Si bien este método proporciona información sobre el nivel de células persistentes y la cinética de muerte, no refleja la heterogeneidad intrínseca de célula a célula subyacente al fenómeno de persistencia. El protocolo descrito aquí combina ensayos clásicos de tiempo/muerte con análisis de células individuales utilizando microscopía de fluorescencia en tiempo real. Mediante el uso de reporteros fluorescentes apropiados, las imágenes de microscopía de células vivas pueden proporcionar información sobre los efectos del antibiótico en los procesos celulares, como la replicación y segregación cromosómica, el alargamiento celular y la división celular. La combinación de análisis poblacional y unicelular permite la caracterización molecular y celular del fenotipo de persistencia.

La persistencia de antibióticos describe la capacidad de pequeñas subpoblaciones dentro de una población isogénica sensible para tolerar transitoriamente altas dosis de antibióticos bactericidas. El presente protocolo combina enfoques para caracterizar el fenotipo de persistencia antibiótica a nivel molecular y celular después de exponer a Escherichia coli a dosis letales de ofloxacino.

Análisis poblacional y unicelular de la persistencia antibiótica en Escherichia coli

Antibiotic persistence refers to the capacity of small bacterial subpopulations to transiently tolerate high doses of bactericidal antibiotics. Upon ...

El protocolo descrito aquí proporciona un método integrador que combina ensayos microbiológicos clásicos con imágenes en vivo de una sola célula para caracterizar las células persistentes de Escherichia coli después de un tratamiento con alto contenido de ofloxacina. La principal ventaja de esta técnica es analizar el fenómeno de persistencia a nivel poblacional y unicelular. La combinación de análisis poblacional y unicelular permite la caracterización molecular y celular del fenotipo de persistencia.Para comenzar, raye la cepa bacteriana de interés de un stock de glicerol congelado en una placa de agar LB e incube a 37 grados centígrados durante la noche durante un período de 15 a 19 horas para obtener colonias individuales. Inocular una colonia aislada en un tubo de vidrio que contenga cinco mililitros de medio de crecimiento MOPS suplementado con 0,4% de glucosa y, si es necesario, agregue un antibiótico selectivo al medio. Coloque el tubo en una incubadora agitadora a 37 grados centígrados y 180 rpm durante la noche.Al día siguiente, centrifugar un mililitro de cultivo a 2, 300 g durante tres minutos para granular las células, y resuspender suavemente el pellet con el mismo volumen de PBS. Mida el OD a 600 nanómetros, y calcule el volumen necesario para un OD600 inicial de 0,01 en un volumen final de dos mililitros. A continuación, agregue dos mililitros de glicerol MOPS 0.4% medio en un pocillo de una placa de fondo transparente de 24 pocillos e inocule con el volumen de cultivo calculado durante la noche.Coloque la placa de 24 pocillos en un lector automático de microplacas para monitorear el OD600 durante 24 horas. Configure el lector de microplacas para medir el OD600 cada 15 minutos a una temperatura de 37 grados centígrados y con una alta rotación orbital de 140 rpm. Derrita 100 mililitros de agar LB y almacene el matraz a 55 grados centígrados para evitar la solidificación.Preparar seis matraces de vidrio pequeños y pipetear cinco mililitros de agar medio líquido LB en cada matraz con una pipeta estéril. Tome 10 microlitros de los cinco miligramos por mililitro de solución madre de loxacina y diluya en 90 microlitros de agua ultrapura. Agregue volúmenes crecientes de ofloxacino diluido a cada uno de los seis matraces de vidrio que contienen medio de agar LB para obtener una concentración final de cero a 0.1 microgramos por mililitro de ofloxacina.Mezcle la solución girando los matraces varias veces y vierta los medios de agar LB agregados con antibióticos en una placa de cultivo de seis pocillos. Deje que el agar se enfríe hasta que se solidifique y seque la placa antes de usarla. Diluir un cultivo bacteriano durante la noche a una densidad celular final de una vez 10 a la séptima UFC por mililitro con PBS.Coloque dos microlitros de cultivo diluido en cada pocillo de la placa seca de seis pocillos. Deje que las manchas se sequen antes de colocar la placa en una incubadora a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, compruebe en qué concentración de ofloxacino se inhibe el crecimiento de colonias de bacterias.Vierta aproximadamente 25 mililitros del agar LB preparado en una placa de Petri. Luego agregue de cinco a ocho perlas de vidrio estériles a cada plato solidificado y seco. Invierta y etiquete las placas.A continuación, prepare diez veces tubos de vidrio de dilución en serie que contengan 900 microlitros de solución de sulfato de magnesio 0.01-molar. En un tubo de vidrio, diluir un cultivo nocturno en medio fresco y ajustado a la temperatura hasta un OD600 final de aproximadamente 0.001, y permitir que el cultivo crezca durante la noche en una incubadora. Al día siguiente, cuando el OD600 alcance 0.3, transfiera 100 microlitros del cultivo para su dilución de acuerdo con los datos del ensayo puntual.Realizar una dilución en serie diez veces mayor del cultivo bacteriano. Luego coloque 100 microlitros del cultivo diluido en las placas de agar LB preparadas. Agregue la concentración deseada de ofloxacino en el cultivo bacteriano y continúe incubando a 37 grados centígrados mientras agita.En los puntos de tiempo relevantes, retire 100 microlitros del cultivo y diluya el cultivo de acuerdo con los datos del ensayo puntual. Placa 100 microlitros del cultivo diluido en las placas de agar LB. Al día siguiente, cuente las colonias de las placas incubadas durante la noche en las dos diluciones más altas para las cuales se pueden detectar colonias.Calcule la relación de supervivencia normalizando la UFC por mililitro en cada punto de tiempo en la UFC por mililitro en T0, y trace el valor normalizado de la base logarítmica 10 en función del tiempo. Retire la solución de conservación de cada pocillo de la placa microfluídica y reemplácela con un medio de cultivo fresco. Selle la placa microfluídica con el sistema de colector haciendo clic en el botón Sello o a través del software microfluídico.A continuación, en la interfaz del software microfluídico, realice una primera secuencia de cebado haciendo clic en Ejecutar secuencia de cebado líquido. Incubar la placa en un gabinete controlado termostáticamente del microscopio a 37 grados centígrados durante un mínimo de dos horas antes de comenzar la toma de imágenes de microscopía. Luego comience una segunda secuencia de cebado líquido de ejecución antes de comenzar el experimento.Selle la placa microfluídica haciendo clic en Dessellar placa en la interfaz del software microfluídico. Reemplace el medio en los pocillos con 200 microlitros de medio fresco, medio fresco que contenga antibióticos, y 0.01 OD de muestra de cultivo diluido en el medio fresco. Después de sellar la placa microfluídica como se demostró anteriormente, coloque la placa en el objetivo del microscopio dentro del gabinete del microscopio.En el software microfluídico, haga clic en Ejecutar secuencia de carga de células para permitir la carga de las células en la placa microfluídica. Establezca un enfoque óptimo utilizando el modo de luz transmitida y seleccione varias regiones de interés donde se pueda observar un número de celda apropiado de hasta 300 celdas por campo. En el software microfluídico, edite la secuencia Ejecutar una secuencia personalizada para programar la inyección de medio fresco a 6,9 kilopascales durante seis horas a los pozos uno y dos, seguido por el medio que contiene antibiótico a 6,9 kilopascales o seis horas al pozo tres, y finalmente el medio fresco a 6,9 kilopascales durante 24 horas a los pozos cuatro y cinco.Realice imágenes de microscopía en modo de lapso de tiempo con un fotograma cada 15 minutos utilizando luz transmitida y la fuente de luz de excitación para el reportero fluorescente, e inicie el programa microfluídico. Abra el software ImageJ o Fiji en el equipo y arrastre las imágenes de microscopía de lapso de tiempo hyperstack a la barra de carga de Fiji. Utilice Imagen, seguido de Color y, a continuación, Crear compuesto para fusionar los diferentes canales de la hiperpila.Utilice Imagen, Color y, a continuación, Organizar canales si los canales no corresponden al color deseado. Abra el complemento MicrobeJ y detecte las células bacterianas utilizando la interfaz de edición manual. Elimine las celdas detectadas automáticamente y describa manualmente las celdas persistentes de interés fotograma a fotograma.Después de la detección, utilice el icono Resultado en la interfaz de edición manual de MicrobeJ para generar una tabla ResultJ. Utilice la tabla ResultJ para obtener información sobre los diferentes parámetros de interés del análisis de celda única y guarde el archivo ResultJ. Se determinó que la CMI de ofloxacino para ambas cepas era de 0,06 microgramos por mililitro, lo que indica que la fusión hupA-mCherry no afectó la sensibilidad de la ofloxacina en comparación con la cepa isogénica de tipo salvaje.El ensayo puntual mostró clones aislados en diluciones apropiadas a lo largo del tiempo, por ejemplo, de 10 a la quinta dilución negativa en el tiempo cero. En el ensayo de tiempo de muerte, se observó una curva bifásica típica donde la primera pendiente refleja la rápida matanza de la población no persistente. La segunda fase mostró una tasa de mortalidad más lenta, revelando la presencia de células persistentes tolerantes a los medicamentos.En particular, la curva de tiempo de muerte muestra que la proteína de fusión hupA-mCherry no afectó la cinética de muerte de tiempo. En el experimento microfluídico, la primera fase de crecimiento indica que las células eran viables y se dividían antes del tratamiento con ofloxacino. Después de esta primera fase de crecimiento, la división celular se bloqueó tan pronto como el antibiótico llegó a las células.Después del tratamiento con ofloxacino, en perfusión con medio fresco, la gran mayoría de las células no pudieron reanudar el crecimiento. En contraste, una pequeña subpoblación podría alargarse y generar células filamentosas, que se definen como las células persistentes. El filamento persistente en división generó múltiples células hijas, la mayoría de las cuales comenzaron a crecer y dividirse de manera similar a las células no tratadas.El aumento en la longitud celular se correlacionó con un aumento en la intensidad total de fluorescencia mCherry, lo que refleja el reinicio de la replicación y un aumento en la abundancia de nucleoides. Cuando se usa una cepa que contiene un reportero intracelular para estudiar la persistencia, es imperial que la presencia del reportero no interfiera con el crecimiento, la CMI y la muerte en comparación con una cepa de tipo salvaje. El procedimiento descrito aquí se puede aplicar a otras condiciones y especies de bacterias para monitorear las respuestas celulares a entornos cambiantes o tensiones.Mediante el uso de otros reporteros fluorescentes en una configuración idéntica, se pueden probar nuevos conocimientos sobre la fisiología de las células persistentes.

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Investigación

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Biology

Biología

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ScanLag es un método de alto rendimiento para medir el retraso en el crecimiento, es decir, el tiempo de retraso, así como la tasa de crecimiento de las colonias para miles de células en paralelo. El cribado con ScanLag permite discriminar entre un retraso prolongado y un crecimiento lento a nivel de una sola variante.

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