Name: Control de la fracción de partículas en andamios microporosos de partículas recocidas para cultivo celular 3D (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-28T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Aprende a controlar la fracción de partículas en andamios MAP para ingeniería de tejidos. Este método permite definir porosidades específicas y estudiar respuestas celulares en cultivos 3D con aplicaciones en medicina regenerativa.

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Los autores desean agradecer a los Institutos Nacionales de Salud, los Institutos Nacionales de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (1R01NS112940, 1R01NS079691, R01NS094599) y el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (1R01AI152568). Este trabajo se realizó en parte en la Instalación de Instrumentación de Materiales Compartidos de la Universidad de Duke (SMIF), miembro de la Red de Nanotecnología del Triángulo de Investigación de Carolina del Norte (RTNN), que cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias (número de premio ECCS-2025064) como parte de la Infraestructura Nacional Coordinada de Nanotecnología (NNCI). Los autores desean agradecer al ex postdoctorado del laboratorio, el Dr. Lucas Schirmer, así como a Ethan Nicklow por su ayuda en la generación del dispositivo impreso en 3D para experimentos de cultivo celular.

<ol><li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li>
<li>Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+microparticles+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Hydrogel microparticles for biomedical applications.</a> Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).</li>
<li>Darling, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+by+click+Microporous+Annealed+Particle+%28MAP%29+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Click by click Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391(2020).</li>
<li>Truong, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microporous+annealed+particle+hydrogel+stiffness%2C+void+space+size%2C+and+adhesion+properties+impact+cell+proliferation%2C+cell+spreading%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer.</a> Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2020).</li>
<li>Pfaff, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+improved+photoannealing+of+Microporous+Annealed+Particle+%28MAP%29+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Selective and improved photoannealing of Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).</li>
<li>Sideris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+hydrogels+based+on+hyaluronic+acid+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).</li>
<li>Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clickable+microgel+scaffolds+as+platforms+for+3D+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254(2017).</li>
<li>Qazi, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+rod-shaped+particles+influence+injectable+granular+hydrogel+properties+and+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion.</a> Advanced Materials. 34 (12), 2109194(2022).</li>
<li>Wilson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometric+post+modification+of+hydrogel+microparticles+dictates+neural+stem+cell+fate+in+microporous+annealed+particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Stoichiometric post modification of hydrogel microparticles dictates neural stem cell fate in microporous annealed particle scaffolds.</a> Advanced Materials. 34 (33), 2201921(2022).</li>
<li>Muir, V. G., Qazi, T. H., Shan, J., Groll, J., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+microgel+fabrication+technique+on+granular+hydrogel+properties%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).</li>
<li>Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jammed+microgel+inks+for+3D+printing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Jammed microgel inks for 3D printing applications.</a> Advanced Science. 6 (1), 1801076(2018).</li>
<li>Anderson, A. R., Nicklow, E., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+fraction+as+a+bioactive+cue+in+granular+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Particle fraction as a bioactive cue in granular scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 150, 111-127 (2022).</li>
<li>Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+heterogeneous+epidermal+growth+factor+release+from+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+hydrogel+for+improved+wound+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure.</a> Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).</li>
<li>Sheikhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microengineered+emulsion-to-powder+technology+for+the+high-fidelity+preservation+of+molecular%2C+colloidal%2C+and+bulk+properties+of+hydrogel+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Polymer+Materials%22%5BJournal%5D)">Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions.</a> ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).</li>
<li>Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-step+variable+height+photolithography+for+valved+multilayer+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55276(2017).</li>
<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Magnetic+Resonance+%28NMR%29+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database.+Organic+Chemistry.+JoVE%22%5BJournal%5D)">Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy.</a> JoVE Science Education Database. Organic Chemistry. JoVE. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Roosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+synthesis+of+microgel+building+blocks+for+microporous+annealed+particle+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microfluidic synthesis of microgel building blocks for microporous annealed particle scaffold.</a> Journal of Visualized Experiments. (184), e64119(2022).</li>
<li>Zhang, H., Dicker, K. T., Xu, X., Jia, X., Fox, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfacial+bioorthogonal+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Macro+Letters%22%5BJournal%5D)">Interfacial bioorthogonal crosslinking.</a> ACS Macro Letters. 3 (8), 727-731 (2014).</li>
<li>Welzel, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryogel+micromechanics+unraveled+by+atomic+force+microscopy-based+nanoindentation%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Cryogel micromechanics unraveled by atomic force microscopy-based nanoindentation.</a> Advanced Healthcare Materials. 3 (11), 1849-1853 (2014).</li>
<li>Plieva, F., Huiting, X., Galaev, I. Y., Bergenståhl, B., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroporous+elastic+polyacrylamide+gels+prepared+at+subzero+temperatures%3A+control+of+porous+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Macroporous elastic polyacrylamide gels prepared at subzero temperatures: control of porous structure.</a> Journal of Materials Chemistry. 16 (41), 4065-4073 (2006).</li>
<li>Rommel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalized+microgel+rods+interlinked+into+soft+macroporous+structures+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture.</a> Advanced Science. 9 (10), 2103554(2022).</li>
<li>Kurt, E., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+delivery+from+granular+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid delivery from granular hydrogels.</a> Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867(2021).</li>
<li>Isaac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microporous+bio-orthogonally+annealed+particle+hydrogels+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).</li>
<li>Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+governing+polyethylenimine+polyplex+transfection+in+Microporous+Annealed+Particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in Microporous Annealed Particle scaffolds.</a> Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).</li>
<li>Koh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+in+vivo+delivery+of+stem+cells+using+microporous+annealed+particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds.</a> Small. 15 (39), 1903147(2019).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+tissue+formation+through+assembly+of+microgels+containing+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Cartilage tissue formation through assembly of microgels containing mesenchymal stem cells.</a> Acta Biomaterialia. 77, 48-62 (2018).</li>
</ol>

ARA y TS han presentado una patente provisional sobre esta tecnología.

Se ha demostrado que la producción microfluídica de microgeles HA-NB genera microgeles con un rango de distribución de tamaño más estrecho que la producción por lotes de emulsiones 3,9. Los microgeles descritos en este protocolo se formularon utilizando un reticulante MMP (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) para apoyar la degradación del material. Sin embargo, los microgeles HA-NB también pueden ser reticulados utilizando un enlazador de di-tiol alternativo como...

Los andamios de partículas recocidas microporosas (MAP) son una subclase de materiales granulares en los que los bloques de construcción de microgel (μgel) están interconectados para formar un andamio poroso a granel. Con la microarquitectura única de estos andamios granulares, la porosidad innata generada por el espacio vacío entre el microgel esférico interconectado admite la infiltración celular acelerada y la migración1. Los bloques de construcción de microgel de los andamios MAP se pueden fabricar a partir de polímeros sintéticos y naturales con modificaciones químicas2. Los métodos descritos aquí destacan específicamente el uso de microgeles compuestos por una columna vertebral de ácido hialurónico (AH) modificada con mangos funcionales de norborneno (NB). El mango funcional NB en el polímero HA admite reacciones químicas de clic para formar microgeles y unirlos para generar andamios MAP 3,4. Se han empleado numerosos esquemas para unir los microgeles (es decir, recocido), como las reacciones enzimáticas1, 5,6 basadas en luz y química de clic sin aditivos 3,7. La química de clic sin aditivos se describe en este trabajo, utilizando la conjugación de demanda inversa de electrones de tetrazina-norborneno Diels-Alder para interconectar los microgeles HA-NB.
Para fabricar andamios MAP, los usuarios primero generan los bloques de construcción de microgel utilizando emulsiones inversas, ya sea en sistemas por lotes o dentro de dispositivos microfluídicos, así como con pulverización electrohidrodinámica, litografía o fragmentación mecánica2. La producción de microgeles esféricos HA-NB ha sido bien descrita y previamente reportada utilizando tanto la emulsión por lotes2 como las técnicas de generación de gotas microfluídicas 8,9,10,11. En este trabajo, se generaron microgeles esféricos HA-NB en una plataforma microfluídica de enfoque de flujo para un tamaño y forma controlados, como se describió anteriormente 8,9,10. Después de la purificación, los microgeles existen en una suspensión acuosa y deben concentrarse para inducir un estado de atascamiento. Cuando se atascan, los microgeles exhiben propiedades de adelgazamiento por cizallamiento, que les permiten funcionar como materiales inyectables que llenan el espacio1. Un método para inducir un estado atascado es secar los microgeles mediante liofilización, o liofilización, y luego rehidratar el producto seco en un volumen controlado12. Alternativamente, el exceso de tampón se puede eliminar de la suspensión de microgel mediante centrifugación sobre un colador o con la extracción manual del tampón del gránulo de microgel, ya sea por aspiración o utilizando un material absorbente. Sin embargo, el uso de la centrifugación para secar los microgeles puede generar un rango muy variable de fracciones de partículas y fracciones vacías al hacer andamios granulares12. Se han descrito técnicas para liofilizar microgeles utilizando 70% IPA para microgeles de polietilenglicol (PEG)13, aceites fluorados para microgeles de gelatina metacriloyl (GelMa) 14 y etanol al 70% para microgeles HA12. Este protocolo destaca los métodos para liofilizar microgeles esféricos de HA utilizando etanol al 70%, un reactivo de laboratorio estándar, para conservar las propiedades originales del microgel durante el proceso de secado. Los microgeles HA liofilizados se pueden pesar y rehidratar en porcentajes de peso definidos por el usuario para controlar las fracciones de partículas finales en andamios MAP12.
El paso final en la formación de andamios MAP se basa en el recocido de los microgeles para crear un andamio voluminoso y poroso1. Al utilizar componentes nativos de la matriz extracelular y emplear esquemas de recocido bioortogonal, los andamios MAP sirven como una plataforma biocompatible tanto para el cultivo celular in vitro como para la reparación de tejidos in vivo 3. A través de estos enfoques, los andamios MAP pueden fabricarse a partir de bloques de construcción HA-NB con fracciones de partículas definidas por el usuario para su empleo en aplicaciones de ingeniería de tejidos12. El siguiente protocolo describe la producción microfluídica de microgeles HA-NB seguida de liofilización y rehidratación para controlar la fracción de partículas en andamios MAP. Por último, los pasos para el recocido de los microgeles se describen utilizando química bio-ortogonal para experimentos de cultivo celular 3D in vitro .

<table><tbody><tr><td>1 mL Jeringa Luer-Lok estéril, de un solo uso, policarbonato</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Jeringa Luer-Lok estéril, de un solo uso, de policarbonato</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 C5 maleimida</td><td>Invitrogen</td><td>A10254</td><td>Para la síntesis de tetrazina marcada con fluorescencia</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>Para la tinción de muestras de cultivos celulares</td></tr><tr><td>Papel de aluminio</td><td>VWR</td><td>89107-726</td><td></td></tr><tr><td>Punzón de biopsia con émbolo, 1,0 mm</td><td>Integra Miltex</td><td>69031-01</td><td></td></tr><tr><td>Punzón de biopsia, 4 mm</td><td>Integra Miltex</td><td>33-34</td><td></td></tr><tr><td>Aguja roma, 23 g 0,5", no estéril, tapado</td><td>SAI Infusion Technologies</td><td>B23-50</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de vacío con tapa de botella, 0,22 &mu; m</td><td>Corning</td><td>CLS430521</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>VWR</td><td>1B1110</td><td>Para tampón de lavado de microgel</td></tr><tr><td>Conjuntos de pistones capilares para pipetas de desplazamiento positivo, 1000 &mu; L Volumen máx.</td><td>Rainin</td><td>17008609</td><td></td></tr><tr><td>Conjuntos de pistones capilares para pipetas de desplazamiento positivo, 25 &mu; L Volumen máx.</td><td>Rainin</td><td>17008605</td><td></td></tr><tr><td>Conjuntos de pistones capilares para pipetas de desplazamiento positivo, 250 &mu; L Volumen máx.</td><td>Rainin</td><td>17008608</td><td></td></tr><tr><td>Countess Cámara de recuento de células Portaobjetos</td><td>Invitrogen</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL Contador de células automatizado</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga, 15 mL</td><td>CELLTREAT</td><td>667015B</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga, 50 mL</td><td>CELLTREAT</td><td></td> 229421 <td></td></tr><tr><td>Cloroformo, grado ACS, Botella de vidrio</td><td>Stellar Scientific</td><td>CP-C7304</td><td>Para la síntesis de tetrazina marcada con fluorescencia</td></tr><tr><td>Pistola de plasma Corona, BD-10A Generador de Alta Frecuencia</td><td>ETP</td><td>11011</td><td></td></tr><tr><td>Viales de CryoTube, Polipropileno, Rosca interna con tapón de rosca</td><td>Nunc</td><td>368632</td><td></td></tr><tr><td>células mesenquimales de ratón D1</td><td>ATCC</td><td>CRL-12424 Ejemplo de</td><td>línea celular para cultivo en geles MAP</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Para la tinción de muestras de cultivos</td></tr><tr><td>celulares Óxido de deuterio, 99,9 átomo % D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>151882 Para espectroscopia de RMN</td></tr><tr><td>Tubo de diálisis, membrana de celulosa regenerada, corte de peso molecular de 12-14 kDa</td><td>Spectra/Por</td><td>132703</td><td>Para la purificación de HA-NB y HA-Tet</td></tr><tr><td>Éter dietílico</td><td>VWR</td><td>BDH1121-4LPC</td><td>Para la síntesis de tetrazina marcada con fluorescencia</td></tr><tr><td>Dimetilformamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>277056</td><td>Para la síntesis de cloruro de tetrazina</td></tr><tr><td>4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina-2-il)-4-metilmorfolinio marcado con fluorescencia (DMTMM)&nbsp;</td><td>TCI-Chemicals</td><td>D2919</td><td>Para modificar el</td></tr><tr><td>HA Dithiothreitol (DTT)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0861</td><td>Enlazador de ditiol no degradable (sustituto del péptido escindible MMP)</td></tr>Medio de águila <tr><td>modificado de Dulbecco (DMEM), alto contenido de glucosa, con 4500 mg/L de glucosa, L-glutamina, piruvato de sodio y bicarbonato de sodio, líquido, filtrado estéril, apto para el cultivo celular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429-500ML</td><td>para D1 </td></tr><tr><td>cultivo celular EMS Paraformaldehído, granular</td><td>VWR</td><td>100504-162</td> Para hacer etanol absoluto de <td>PFA al 4%</td></tr><tr><td>(200 pruebas)</td><td>KOPTEC</td><td>89234-850</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td>Para cultivo celular D1</td></tr><tr><td>Placa calefactora</td><td>Kopf Instruments</td><td>HP-4M</td><td></td></tr><tr><td>Hemacitómetro con cubreobjetos</td><td>Daigger Scientific</td><td></td><td></td>EF16034F</tr><tr><td>Ácido 2-[4-(2-hidroxietil)piperazina-1-il]etanosulfónico (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronato de sodio, peso molecular medio de 79 kDa, producido en bacterias Streptococcus zooepidemicus, grado farmacéutico, contaminación microbiana < 100 UFC/g, endotoxinas bacterianas < 0,050 UI/mg</td><td>Contipro</td><td>N/A</td><td>79 kDa de peso molecular medio se utilizó para la síntesis de HA-Tet, pero estos métodos podrían adaptarse a otros pesos moleculares.</td></tr><tr><td>Paquete de software IMARIS Essentials</td><td>Oxford Instruments N</td><td>/A</td><td>Software de análisis de imágenes para microscopía</td></tr><tr><td>Bomba de infusión, jeringa doble</td><td>Chemyx</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Soporte de laboratorio con soporte pinza de laboratorio</td><td>Geyer</td><td>212100</td><td></td></tr><tr><td>Nitrógeno líquido</td><td>Airgas</td><td>NI 180LT22</td><td></td></tr><tr><td>Litio Fenil(2,4,6-trimetilbenzoil)fosfinato</td><td>TCI-Chemicals</td><td>L0290</td><td></td></tr><tr><td>Liofililizador</td><td>Labconco</td><td>N/A</td><td>Labconco FreeZone 6 plus ha sido descontinuado, pero se podrían usar otros liofilizadores de consola de grado de laboratorio para este protocolo.</td></tr><tr><td>Metiltetrazina-PEG4-maleimida</td><td>Kerafast</td><td>FCC210</td><td>Para la síntesis de tetrazina marcada con fluorescencia</td></tr><tr><td>2-(4-morfolino)etano Ácido sulfónico (MES)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP300-100</td><td>Para modificar HA</td></tr><tr><td>Micro cubreobjetos, 24 x 60 mm Nº 1</td><td>VWR</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo microfluídico SU8 oblea maestra</td><td>FlowJem</td><td></td><td>Diseño personalizado hecho en casa en Sala limpia o externalizada</td></tr><tr><td>Aceite mineral, pesado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330760</td><td></td></tr><tr><td>MMP-Péptido reticulante de ditiol escindible (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2)</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>5-Norbornene-2-metilamina</td><td>TCI-Chemicals</td><td>95-10-3</td><td>Para la síntesis de HA-NB</td></tr><tr><td>Cinta de embalaje</td><td>Scotch</td><td>3M 1426</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>PEG(tiol)2</td><td>JenKem Technology USA</td><td>A4001-1</td><td>Para la síntesis de tetrazina marcada con fluorescencia</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina, 10.000 unidades/mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Para el cultivo celular D1</td></tr><tr><td>Placa de Petri, poliestireno, desechable, Ø x H=150 x 15 mm</td><td>Corning</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td>Para el lavado de HMP</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>RainX tratamiento de vidrio repelente al agua</td><td>Grainger</td><td>465D20</td><td>Solución de tratamiento hidrofóbico sintético para el tratamiento de dispositivos microfluídicos</td></tr><tr><td>Péptido RGD (Ac-RGDSPGERCG-NH2)</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bandas elásticas</td><td>Grapas</td><td>112417</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Chem-Impex</td><td>30070</td><td>Para diálisis</td></tr><tr><td>Span 80 para síntesis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1338-43-8</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Elastómero de silicona</td><td>Microscopía electrónica Ciencia</td><td>4019862</td><td>elastómero de polidimetilsiloxano (PDMS) para la fabricación de dispositivos microfluídicos y dispositivos de cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>Filtro de jeringa, Whatman Uniflo, 0.2 &mu; m PES, 13 mm de diámetro</td><td>Cytvia</td><td>09-928-066</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio digital LCD</td><td>Tetraview Celestron</td><td>44347</td><td></td></tr><tr><td>Sal de HCl de tetrazina-amina</td><td>Chem-Impex</td><td>35098</td><td>Para la síntesis de HA-Tet</td></tr><tr><td>Trietilamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>471283</td><td>Para la síntesis de tetrazina marcada con fluorescencia</td></tr><tr><td>Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP)</td><td>Millipore Sigma</td><td>51805-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>97063-864</td><td></td></tr><tr><td>Solución de azul de tripán, 0,4 %</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>tripsina EDTA (0,25 %), rojo de fenol</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-200-056</td><td>Para elevar las células adherentes a la semilla en geles MAP</td></tr><tr><td>Tygon ND-100-80 Tubo médico sin DEHP, calibre de aguja = 23, espesor de pared = 0,020 pulgadas, diámetro interno = 0,020, exterior diámetro = 0.060 en</td><td>Thomas Scientific</td><td>1204G82</td><td></td></tr><tr><td>Controlador del sistema de curado UV, LX500 LED&nbsp;</td><td>OmniCure</td><td>010-00369R</td><td></td></tr><tr><td>Cabezal de curado UV, punto LED</td> UV <td>OmniCure</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de luz UV, trazable</td><td>VWR</td><td>61161-386</td><td></td></tr><tr><td>Desecador de vacío</td><td>Bel-Art</td><td>08-594-15C</td><td></td></tr><tr><td>X-Acto Z Series Cuchillo multiusos de precisión</td><td>Elmer's</td><td>XZ3601W</td><td></td></tr></tbody></table>

control de la fracción de partículas en andamios microporosos de partículas recocidas para cultivo celular 3d

Controlling Particle Fraction in Microporous Annealed Particle Scaffolds for 3D Cell Culture

Los microgeles son los bloques de construcción de los andamios de partículas recocidas microporosas (MAP), que sirven como plataforma tanto para el cultivo celular in vitro como para la reparación de tejidos in vivo . En estos andamios granulares, la porosidad innata generada por el espacio vacío entre los microgeles permite la infiltración y migración celular. El control de la fracción vacía y la fracción de partículas es fundamental para el diseño de andamios MAP, ya que la porosidad es una señal bioactiva para las células. Los microgeles esféricos se pueden generar en un dispositivo microfluídico para controlar el tamaño y la forma y, posteriormente, liofilizar utilizando métodos que evitan la fracturación de la red de polímeros. Tras la rehidratación, los microgeles liofilizados conducen a fracciones de partículas controladas en andamios MAP. La implementación de estos métodos para la liofilización de microgel ha llevado a estudios reproducibles que muestran el efecto de la fracción de partículas en la difusión de macromoléculas y la propagación celular. El siguiente protocolo cubrirá la fabricación, liofilización y rehidratación de microgeles para controlar la fracción de partículas en andamios MAP, así como el recocido de los microgeles a través de reticulación bio-ortogonal para cultivo celular 3D in vitro.

El objetivo de este protocolo es demostrar la preparación de andamios de partículas recocidas microporosas (MAP) con un esquema de reticulación bio-ortogonal, así como fracciones de partículas controladas para cultivo celular 3D. Primero, HA se modificó con grupos colgantes de norborneno para ser utilizados tanto en la formación de microgel como en la interconexión para formar andamios MAP. Usando estos métodos, aproximadamente el 31% de las unidades de repetición de HA se modificaron con éxito con un mango funcional de ...

Minimizar la variabilidad en la fracción de partículas dentro de andamios granulares facilita la experimentación reproducible. Este trabajo describe métodos para generar andamios granulares con fracciones de partículas controladas para aplicaciones de ingeniería de tejidos in vitro .

Control de la fracción de partículas en andamios microporosos de partículas recocidas para cultivo celular 3D

Microgels are the building blocks of microporous annealed particle (MAP) scaffolds, which serve as a platform for both in vitro cell culture and in vivo ...

Los materiales granulares, como los andamios MAP, son materiales inyectables porosos hechos de partículas de hidrogel de tamaño micro interconectadas. El control de la fracción de partículas es fundamental para las propiedades del material y las respuestas celulares. Las fracciones de partículas variables en andamios MAP dan como resultado un rango de propiedades de andamio y respuestas celulares, pero esta técnica permite a los usuarios definir la fracción de partículas final en los andamios MAP que crean.Los andamios MAP se pueden utilizar para promover la reparación y regeneración de heridas complejas, así como para administrar medicamentos. La fracción de partículas, por ejemplo, afecta la velocidad y el grado de infiltración y regeneración celular. Este método se puede aplicar en todas las clases de hidrogeles granulares.Ahora que podemos hacer andamios MAP con fracciones de partículas controladas por el usuario, podemos estudiar de manera reproducible la bioactividad de estos materiales e investigar respuestas celulares únicas, como el confinamiento. Configurar la generación de microgel microfluídico requiere tiempo y paciencia a medida que aprende las técnicas. Es mejor tener varios dispositivos preparados y listos en caso de que tenga problemas con la configuración.Comience con la producción microfluídica de ácido hialurónico, o HA, y norborneno, o NB, microgeles. Antes de secar los microgeles, pese un tubo de tapón de rosca crioseguro. Luego, en una campana estéril, transfiera los microgeles lavados y purificados a un tubo de tapón de rosca crioseguro utilizando una pipeta de desplazamiento positivo.Agregue 70% de etanol a los microgeles purificados y mezcle bien. Centrifugar el tubo durante cinco minutos a 5, 000 g. Aspire el sobrenadante y agregue etanol al 70%.Mezclar bien e incubar durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, centrifuga brevemente para asegurarte de que los microgeles estén en el fondo del tubo. Agregue nitrógeno líquido a un recipiente criogénico y coloque el tubo de microgeles para congelar rápidamente.Después de cinco a 10 minutos, retire el tubo de microgeles con fórceps. Retire rápidamente la tapa y cubra el tubo con tejido de laboratorio. Asegure el tejido con una banda elástica y transfiéralo a un recipiente o cámara de liofilización.Cargue la muestra en el liofilizador siguiendo las instrucciones del fabricante y liofilice a 0.066 Torr y menos 63 grados centígrados. Pese los microgeles liofilizados del tubo antes de almacenarlos a temperatura ambiente. Mezcle la base de elastómero de polidimetilsiloxano o PDMS con el agente de curado en una proporción de 10 a uno en masa.Vierta la mezcla de PDMS en una placa de Petri de plástico grande y desgasifique en el desecador durante 30 minutos, o hasta que todas las burbujas hayan desaparecido. Una vez que todas las burbujas hayan desaparecido, coloque cuidadosamente el molde impreso en 3D en el PDMS para minimizar la formación de nuevas burbujas. Colocar en el horno a 60 grados centígrados durante dos horas para curar el PDMS.Después del curado, use un cuchillo o una cuchilla de afeitar para trazar suavemente alrededor del perímetro del dispositivo de cultivo y retire cuidadosamente el moho. Use un punzón de biopsia de cuatro milímetros para extraer cualquier PDMS del fondo de los pocillos. Corte los dispositivos para que quepan en un cubreobjetos de vidrio.Use cinta adhesiva para eliminar el polvo de la parte inferior del dispositivo de cultivo. Coloque el dispositivo de cultivo y deslizamiento de cubierta de vidrio limpio en una placa caliente a 135 grados centígrados durante 15 minutos para eliminar la humedad. En una campana extractora, use una pistola de plasma corona en lo alto del resbalón de la cubierta de vidrio y en la parte inferior del dispositivo durante 30 segundos.Luego, une rápidamente las superficies tratadas. Aplique presión suavemente para asegurar un buen sellado entre el dispositivo de cultivo y el deslizamiento de la cubierta de vidrio. Coloque el dispositivo en un horno de 60 grados centígrados durante la noche para asegurar la unión.Al día siguiente, autoclave el dispositivo a esterilizar antes de usarlo in vitro. A continuación, prepare la partícula recocida microporosa, o componentes de andamio MAP, en función de la fracción de partículas deseada para el cultivo celular en andamios MAP. Pesar microgeles liofilizados para determinar la masa de microgeles.Luego reconstituir los microgeles en el 84% del volumen final de MAP de los medios celulares en función del porcentaje de MAP elegido en peso. Deje que los microgeles se hinchen durante 20 minutos. Disuelva el ácido hialurónico, o HA-tetrazina, y los medios celulares en el 16% del volumen final de MAP.Una vez que las células hayan alcanzado la confluencia deseada, levante y cuente las células. Transfiera 10, 000 células por microlitro MAP a un nuevo tubo. Centrifugar las células y aspirar el sobrenadante del pellet sin aspirar las células.Añadir microgeles y reticulante al pellet mediante una pipeta de desplazamiento. Mezclar bien, y sembrar 10 microlitros por pocillo. Pipetear con movimientos circulares para distribuir uniformemente la mezcla en el pozo.Deje que los microgeles se reanuden a 37 grados centígrados durante 25 minutos antes de agregar medios celulares para llenar los pocillos. Mantenga las culturas 3D a 37 grados centígrados y cambie los medios según sea necesario. Para evitar aspirar el andamio, estabilice la punta de la pipeta a lo largo de la cresta del pocillo superior.En los puntos de tiempo deseados, fije las muestras reemplazando los medios con 50 microlitros de paraformaldehído al 4% por pocillo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Lave las muestras tres veces con 50 microlitros de PBS, o tampón preferido, y proceda a la inmunofluorescencia o tinción de fluorescencia utilizando 50 microlitros por pozo como el volumen de trabajo. Se demostró que los dispositivos microfluídicos con una región de enfoque de flujo producen microgeles HA-NB de 50 o 100 micras de diámetro.El medio para liofilizar los microgeles se optimizó para minimizar la formación de criogel mediante el uso de etanol al 70%. Sin embargo, otros medios, como el alcohol isopropílico, el agua y el acetonitrilo se pueden usar indistintamente para facilitar la formación de criogel. Para facilitar la interconexión bioortogonal de los microgeles HA-NB se sintetizó un reticulante lineal de HA-tetrazina.La espectroscopia de RMN de protones muestra una modificación exitosa del 11% de las unidades de repetición de HA con un grupo colgante de tetrazina. El producto de microgel liofilizado seco se rehidrató con volúmenes especiales y se recoció para lograr diferentes formulaciones de porcentaje en peso de microgeles en andamios MAP. Estos porcentajes de peso de microgeles en andamios MAP correspondían a fracciones de partículas únicas.Aquí se muestra el cultivo celular en andamios MAP. Las células en cultivo 3D en andamios MAP se fijaron el quinto día, se tiñeron y se obtuvieron imágenes en un microscopio confocal. Los cortes Z individuales muestran diferencias en el crecimiento celular y los andamios que comprenden diferentes porcentajes de MAP en peso.Seleccione sus medios de liofilización adecuadamente dependiendo de si desea criogels, o no. No se salte los pasos de incubación, para que sus microgeles tengan tiempo suficiente para hincharse en los medios. Se pueden usar técnicas estándar como microscopía, citometría de flujo, secuenciación de ARN y más para evaluar las respuestas celulares dentro de estos materiales granulares con porosidades definidas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Se presentan dos procesos de microfabricación de chips de polímero poroso para el cultivo de células en tres dimensiones. El primero es el estampado en caliente combinado con un proceso de soldadura vapores de disolventes. El segundo utiliza un proceso desarrollado recientemente microthermoforming combinada con la tecnología de iones de la pista que conduce a una simplificación significativa de la fabricación.

Microfabricación de chip del tamaño de andamios para el cultivo de células en tres dimensiones

Los nanosensores sol-gel biocompatibles que responden al pH se pueden incorporar en andamios electrohilados de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA). Los andamios autoinformados producidos se pueden utilizar para el monitoreo in situ de las condiciones microambientales mientras se cultivan células en el andamio. Esto es beneficioso ya que la construcción celular 3D se puede monitorear en tiempo real sin perturbar el experimento.

Los andamios de autoinforme para el 3-Dimensional Cultivo Celular

Este artículo describe una gama de configuraciones para sembrar células madre mesenquimales humanas en materiales, en este caso hilos electrohilados, que no cubren la base de las placas de pocillos de cultivo estándar con el fin de maximizar y cuantificar el número de células que se adhieren inicialmente en comparación con la densidad de siembra conocida.

Optimización de unión de las células madre mesenquimales humanas en poli (ε-caprolactona) electrohiladas Hilos

Los avances en las tecnologías de biomateriales permiten el desarrollo de construcciones tridimensionales de tipo multicélula. Hemos desarrollado protocolos de electrospinning para producir tres andamios individuales para cultivar las principales células estructurales de la vía aérea y proporcionar un modelo 3D in vitro de la pared del bronquiolo de la vía aérea.

Adaptación del Proceso Electrohilado para proporcionar tres ambientes únicos para un Tri-capa<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la pared de la vía aérea

Aquí, presentamos un protocolo para obtener sistemas 3D-cultura en uno mismo-montaje de andamios péptido para promover la diferenciación de condrocitos articulares humanos dedifferentiated en tejido similar al cartílago.

Cultivo de células de mamífero en andamios tridimensionales péptido

Presentamos un procedimiento para el control de la forma de racimo de célula inicial en una matriz extracelular 3D para obtener una formación de patrón repetible. Un dispositivo cúbico que contiene dos diferentes hidrogeles se emplea para lograr la proyección de imagen multi-direccional para la formación de patrones de tejido.

Celular 3D inicial grupo Control en un dispositivo híbrido Gel cubo para formaciones de patrón repetible

Las varillas de microgel con grupos reactivos complementarios se producen a través de microfluídica con la capacidad de interconectarse en solución acuosa. Los microgeles anisómetros se atascan y se entrelazan en construcciones estables con poros más grandes en comparación con los sistemas de base esférica. Los microgeles modificados con GRGDS-PC forman construcciones 3D macroporosas que se pueden utilizar para el cultivo celular.

Andamios 3D macroporosos interconectados de varillas de microgel

Este protocolo describe un conjunto de métodos para sintetizar los bloques de construcción de microgel para andamios de partículas recocidas microporosas, que se pueden usar para una variedad de aplicaciones de medicina regenerativa.

Síntesis microfluídica de bloques de construcción de microgel para andamios de partículas recocidas microporosas

Estos detalles del trabajo de la preparación de la fibrina andamios 3D para el cultivo y diferenciación de las células madre plutipotent. Tales andamios puede ser utilizado para cribar los efectos de diversos compuestos biológicos sobre el comportamiento de células madre, así como modificado para contener los sistemas de suministro de fármacos.

Preparación de fibrina Andamios 3D para Aplicaciones madre para cultivo celular

Velocimetría de imágenes de micro-partículas (μPIV) se utiliza para visualizar imágenes pareadas de micro partículas sembradas en los flujos sanguíneos que son correlación cruzada para dar un perfil exacto de velocidad. Velocidad de cizallamiento, la velocidad máxima, la forma del perfil de velocidad, y la velocidad de flujo, cada uno de los cuales tiene aplicaciones clínicas, se pueden derivar de estas mediciones.

Velocímetro de Micro-partículas para Velocity perfil mediciones de flujos de sangre Micro

Aprende a controlar la fracción de partículas en andamios MAP para ingeniería de tejidos. Este método permite definir porosidades específicas y estudiar respuestas celulares en cultivos 3D con aplicaciones en medicina regenerativa.

Control de la fracción de partículas en andamios microporosos de partículas recocidas para cultivo celular 3D

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