Name: Aislamiento de poblaciones de células madre quiescentes de músculos esqueléticos individuales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: Aprende a aislar células madre musculares y progenitores fibro-adipogénicos de músculos esqueléticos individuales en ratones. Este protocolo utiliza disociación enzimática y citometría de flujo para estudiar funciones de células madre en homeostasis, regeneración y enfermedades.

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La clasificación celular se realizó en la instalación central de FACS, Universidad de Aarhus, Dinamarca. Las figuras se crearon utilizando Biorender.com. Agradecemos al Dr. J. Farup por compartir el anticuerpo anti-PDGFRa del conejo. Este trabajo fue apoyado por una subvención inicial de AUFF para E.P. y subvenciones Start Package de NovoNordiskFonden a E.P. (0071113) y a A.D.M. (0071116).

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</ol>

Los autores no tienen intereses financieros en competencia ni conflictos de intereses.

Varios pasos son clave en la ejecución de este protocolo para lograr buenos rendimientos. Los músculos individuales tienen un volumen pequeño en comparación con la cantidad de músculo utilizado en los protocolos de aislamiento a granel. Esto resulta en un riesgo de que el músculo se seque durante la disección, lo que reduce el rendimiento. Para evitar esto, es importante agregar medio a los músculos inmediatamente después de la disección. Además, si la disección está tomando más tiempo, la piel se puede quitar de una ext...

El músculo esquelético tiene una alta capacidad de regeneración debido a la presencia de células madre musculares (MuSC). Los MuSC se encuentran en las miofibras, debajo de la lámina basal, y residen en un estado quiescente de salida prolongada y reversible del ciclo celular 1,2,3,4. Tras la lesión, los MuSCs se activan y entran en el ciclo celular para dar lugar a progenitores amplificadores que pueden diferenciarse y fusionarse para formar nuevas miofibras 2,5. Trabajos previos han demostrado que los MuSCs son absolutamente esenciales para la regeneración muscular 6,7,8. Además, un solo MuSC puede injertar y generar tanto nuevas células madre como nuevas miofibras9. El músculo esquelético también alberga una población de células estromales mesenquimales llamadas progenitores fibro-adipogénicos (FAPs), que juegan un papel crucial en el apoyo a la función MuSC durante la regeneración muscular 6,10,11,12.
Debido a su potencial para coordinar la regeneración muscular, ha habido un gran interés en comprender cómo funcionan los MuSC y los FAP. Los MuSC quiescentes están marcados por la expresión de los factores de transcripción Pax7 y Sprouty1, y el receptor de calcitonina de la proteína de la superficie celular, mientras que los FAP quiescentes están marcados por el receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas de la proteína de superficie celular (PDGFRa)10,12,13,14,15 . Estudios previos han demostrado que los MuSC y FAPs podrían purificarse a partir de los músculos esqueléticos utilizando marcadores de superficie celular y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)9,15,16,17,18,19,20,21. Si bien estos protocolos han avanzado enormemente la capacidad de estudiar MuSC y FAP, un inconveniente es que la mayoría de estos protocolos requieren el aislamiento de MuSC de un conjunto de diferentes tejidos musculares. Trabajos recientes de nosotros y otros han revelado diferencias en el fenotipo celular y los niveles de expresión génica entre MuSCs aislados de diferentes tejidos22,23. Los MuSCs del diafragma, tríceps y gracilis muestran una activación más rápida que los MuSCs de los músculos de las extremidades posteriores inferiores22, mientras que los MuSCs del músculo extraocular muestran una diferenciación más rápida que los MuSCs del diafragma y los músculos de las extremidades posteriores inferiores23.
Este protocolo describe el aislamiento de MuSCs y FAPs de músculos esqueléticos individuales (Figura 1). Esto incluye la disección del diafragma, tríceps, gracilis, tibial anterior (TA), sóleo, extensor largo de los dedos (EDL), gastrocnemio (GA) y músculos maseteros. Los músculos diseccionados se disocian posteriormente por digestión enzimática utilizando colagenasa II (una proteasa que se dirige específicamente a la secuencia amino Pro-X-Gly-Pro en el colágeno, lo que permite la degradación del tejido conectivo y la disociación tisular24) y dispasa (una proteasa que escinde la fibronectina y el colágeno IV, lo que permite una mayor disociación celular25). Los MuSC y los FAP se aíslan de suspensiones unicelulares mediante FACS. Como ejemplos de ensayos posteriores para el análisis celular, la activación de células madre se determina mediante el ensayo de incorporación de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU), mientras que la pureza celular se determina mediante tinción de inmunofluorescencia para los marcadores específicos de tipo celular Pax7 y PDGFRa.

<table><tbody><tr><td>Tubo de 1,5 mL( Rendimiento de PCR probado, PP, 30.000 xg, Libre de ADN/DNasa-/RNasa, Baja unión al ADN, Estéril)</td> <td>Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>72.706.700</td><td>Tubo de 1,5 mL</td></tr><tr><td>Tubo de 15 mL (PP/HD-PE, 20.000 xg, IVD/CE, IATA, ADN/DNasa-/RNasa-, No citotóxico, Libre de pirógenos, Estéril)</td><td>Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>62.554.502</td><td>Tubo</td></tr> <tr><td>de 15 mLTubo de poliestireno de fondo redondo de 5 mL Falcon</td><td>, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>352054</td><td>Tubo FACS sin tapón de filtro</td></tr><tr><td>5 mL de poliestireno Tubo de fondo redondo con tapón de filtro de celdas</td><td>Falcon, Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td>352235</td><td>Tubo FACS con tapón de filtro</td></tr><tr><td>Tubo de 5 mL (PP, esterilizable en autoclave no estéril)</td><td>Colección VWR</td><td>525.0946</td><td>Tubo de 5 mL Tubo</td></tr> de <tr><td>50 mL( PP/HD-PE, 20.000 xg, IVD/CE, ADR, libre de ADN/DNasa-/RNasa, no citotóxico, libre de pirógenos, Estéril)</td><td>Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>62.547.254</td><td>Tubo de 50 mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Donkey anti-conejo IgG (H+L)</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher</td><td>Lote: 2387458 (Cat # A31572)</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 donkey-anti mouse IgG (H + L)</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher</td><td>Lote: 2420713 (Cat # A31571)</td><td></td></tr><tr><td>ARIA 3</td><td>BD</td><td></td><td>FACS, Instalación central Centrífuga de la Universidad de Aarhus</td></tr><tr><td>5810</td><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td></td> EP022628188</tr><tr><td>Click-iT EdU Kit de proliferación celular para imágenes, Alexa Fluor 488 tinte</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher</td><td>Lot: 2387287 (Cat# C10337)</td><td>Kit de proliferación celular</td></tr><tr><td>Colágeno de piel de becerro&nbsp;</td><td>Biorreactivo, Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>Fuente: SLCK6209 (Cat# C8919)</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa tipo II</td><td>Worthington, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Lote: 40H20248 (cat# L5004177 )</td><td>Colagenasa</td></tr><tr><td>Dispasa</td><td>Gibco, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Lote: 2309415 (cat# 17105-041 )</td><td>Dispasa</td></tr><tr><td>Suero de burro (no estéril)</td><td>Sigma Aldrich, Merck</td><td>Lote: 2826455 (Cat# S30-100mL)</td><td></td></tr><tr><td>Dumont nr. 5, 110 mm</td><td>Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>1606.327</td><td>Pinzas rectas con puntas finas</td></tr><tr><td>Dumont nr. 7, 115 mm</td><td>Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>1606.335</td><td>Pinzas</td></tr> <tr><td>curvasF-10 Mezcla de nutrientes (Jamón) (1x), +L-glutamina</td><td>Gibco, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Lote. 2453614 (cat# 31550-023)</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-ratón CD31</td><td>BioLegend, NordicBioSite</td><td>MEC13.3 (cat # 102506)</td><td></td></tr><tr><td>FITC Anti-ratón CD45</td><td>BioLegend, NordicBioSite</td><td>30-F11 (Cat# 103108)</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial (100%)</td><td>EMSURE, Merck&nbsp; &nbsp;</td><td>K44104563 9Cat # 1000631000)</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de minitubos de cabeza sobre cabeza&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>15534080 (Modelo n.º 88861052)Rotor</td> <td>de minitubos de cabeza sobre cabeza</td></tr><tr><td>Suero de caballo</td><td>Gibco, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Lot. 2482639 (cat# 10368902 )</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp SWB 15</td><td>FisherBrand, Fisher Scientific</td><td>15325887</td><td>Baño de agua agitador</td></tr><tr><td>MS2 mini-agitador&nbsp;</td><td>IKA&nbsp;</td><td></td><td>Unidad de vórtice</td></tr><tr><td>Aguja 20 G (0,9 mm x 25 mm)</td><td>Microlanza BD, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>304827</td><td>aguja de 20G&nbsp;</td></tr><tr><td>Tampón de formalina neutro 10%</td><td>CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>Lote: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002)</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células no pirogénico (40 &micro; M)</td><td>Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>83.3945.040</td><td>Filtro de células&nbsp;</td></tr><tr><td>Azul Pacífico anti-ratón Ly-6A/E (Sca-1)</td><td>BioLegend, NordicBioSite</td><td>D7 (Cat# 108120)</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo primario Pax7</td><td>DSHB</td><td>Lote: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428)</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x concentrado en polvo</td><td>Fisher BioReagents, Fisher Scientific</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 anti-mouse CD106 (VCAM1)</td><td>BioLegend, NordicBioSite</td><td>429 (MVCAM. A) (Cat # 105720)</td><td></td></tr><tr><td>Pluma/estreptococo</td><td>Gibco, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Lote. 163589 (cat# 11548876 )</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta p10</td><td>Puntas Art, barrera autosellante, Thermo Scientific</td><td>2140-05</td><td>Puntas de filtro preesterilizadas de baja retención, preesterilizadas Puntas</td></tr> de <tr><td>pipeta p1000</td><td>Puntas Art, barrera autosellante, Thermo Scientific</td><td>2279-05</td><td>Puntas de filtro de baja retención, preesterilizadas, puntas</td></tr> de <tr><td>filtro Puntas de pipeta p20</td><td>Puntas Art, barrera autosellante, Thermo Scientific</td><td>2149P-05</td><td>Puntas de filtro de baja retención, preesterilizadas,</td></tr> puntas de <tr><td>pipeta p200</td><td>Puntas de arte, barrera autosellante, Thermo Scientific</td><td>2069-05</td><td>Puntas de filtro de baja retención, preesterilizadas,</td></tr><tr><td>almohadilla protectora</td><td>Abena&nbsp;</td><td>ACTC-7712</td><td>&nbsp; 60 x 40 cm, 8 capas</td></tr><tr><td>Rainin, pipet-lite XLS</td><td>Mettler Toledo, Thermo Scientific&nbsp;</td><td>2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05</td><td>Pipetas (P10, P20, P200, P1000)</td></tr><tr><td>Recombinante anti-PDGFR-alfa</td><td>RabMAb, abcam</td><td>AB134123</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí (eje n.º 3)</td><td>Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>1902.502</td><td>Bisturí</td></tr><tr><td>Hoja de bisturí n.º 11</td><td>Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>1902.0911</td><td>Bisturí</td></tr><tr><td>Scanlaf mars</td><td>Labogene</td><td>Gabinete de clase 2: Mars</td><td>Flow banco</td></tr><tr><td>ScanR</td><td>Microscopio Olympus</td><td></td><td>, Instalación central Universidad de Aarhus</td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>FST</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>Serie 8000 DH</td><td>Incubadora Thermo Scientific</td><td>3540-MAR</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica 10 mL</td><td>VWR</td><td>612-3700</td><td>Estéril, no pirogénica</td></tr><tr><td>Pipeta serológica 5 mL</td><td>VWR, Avantor suministrado por VWR</td><td>612-3702</td><td>Jeringa estéril, no pirogénica</td></tr><tr><td>5 mL, punta Luer (6%), estéril&nbsp;</td><td>BD Emerald, Fisher Scientific</td><td>307731</td><td>Jeringa</td></tr><tr><td>TC Dish 100, estándar</td><td>Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>83.3902</td><td>Placa de Petri&nbsp;</td></tr><tr><td>Superficie tratada con cultivo de tejidos (TC), poliestireno negro, fondo plano, estéril, tapa, paquete de 20</td><td>Corning, Sigma Aldrich</td><td>3764</td><td>Placa de medio fondo de 96 pocillos</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich, Merck</td><td>Fuente: SLCJ6163 (Cat # T8787)</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de poblaciones de células madre quiescentes de músculos esqueléticos individuales

Isolation of Quiescent Stem Cell Populations from Individual Skeletal Muscles

El músculo esquelético alberga distintas poblaciones de células madre adultas que contribuyen a la homeostasis y reparación del tejido. Las células madre del músculo esquelético (MuSC) tienen la capacidad de producir músculo nuevo, mientras que los progenitores fibroadipogénicos (FAP) contribuyen a los tejidos de soporte del estroma y tienen la capacidad de producir fibroblastos y adipocitos. Tanto los MuSC como los FAP residen en un estado de salida reversible prolongada del ciclo celular, llamado quiescencia. El estado de reposo es clave para su función. Las células madre quiescentes se purifican comúnmente a partir de múltiples tejidos musculares agrupados en una sola muestra. Sin embargo, estudios recientes han revelado claras diferencias en los perfiles moleculares y la profundidad de quiescencia de los MuSC aislados de diferentes músculos. El presente protocolo describe el aislamiento y estudio de MuSCs y FAPs de músculos esqueléticos individuales y presenta estrategias para realizar análisis moleculares de activación de células madre. Detalla cómo aislar y digerir músculos de diferentes orígenes de desarrollo, grosores y funciones, como el diafragma, tríceps, gracilis, tibial anterior (TA), gastrocnemio (GA), sóleo, extensor largo de los dedos (EDL) y los músculos maseteros. Los MuSC y FAP se purifican mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y se analizan mediante tinción de inmunofluorescencia y ensayo de incorporación de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU).

Siguiendo el protocolo para el aislamiento individual del músculo esquelético (Figura 2), los músculos gracilis, TA, EDL, GA, sóleo, tríceps, masetero y diafragma se aislaron de tres ratones machos suizos criados que habían sido descontinuados de un programa de cría local (Figura 2). Después de la disociación tisular y la tinción de anticuerpos, los MuSC y FAP de los músculos individuales fueron purificados por FACS (Figura 3). La a...

Este protocolo describe el aislamiento de células madre musculares y progenitores fibroadipogénicos de músculos esqueléticos individuales en ratones. El protocolo incluye la disección de un solo músculo, el aislamiento de células madre mediante clasificación de células activadas por fluorescencia, la evaluación de la pureza mediante tinción de inmunofluorescencia y la medición cuantitativa de la entrada en fase S mediante un ensayo de incorporación de 5-etinil-2'-desoxiuridina.

Aislamiento de poblaciones de células madre quiescentes de músculos esqueléticos individuales

Skeletal muscle harbors distinct populations of adult stem cells that contribute to the homeostasis and repair of the tissue. Skeletal muscle stem cells ...

Este protocolo es significativo porque permite el estudio de la función de las células madre en diferentes músculos esqueléticos, profundizando nuestra comprensión de cómo contribuyen a la homeostasis, la regeneración y la progresión de la enfermedad. Usando este protocolo, podemos aislar dos poblaciones de células madre vivas de músculos específicos y estudiar cómo funcionan. Para comenzar el aislamiento muscular, rocíe el ratón sacrificado con etanol y colóquelo con el abdomen hacia arriba.Usando tijeras, haga una incisión horizontal de 0,5 centímetros de largo en la piel abdominal. Usando ambas manos, tire de la piel para exponer el torso, así como las extremidades inferiores hasta las extremidades posteriores. Localice el gracilis o el músculo interno del muslo y con un par de pinzas curvas agárrelo y levante ligeramente el músculo.Usando tijeras, haga una incisión de 0,5 centímetros para cortar el músculo gracilis. Repita el procedimiento en la otra pierna. Usando un bisturí, corte la fascia haciendo una incisión de 0,5 centímetros a lo largo del lado lateral de la tibia.Luego agarre la fascia con pinzas curvas y retírela tirando, exponiendo los tendones en el extremo distal de la extremidad posterior. A continuación, inserte un par de pinzas rectas con puntas súper finas entre el tendón distal del TA y el músculo EDL. Separe los músculos deslizando los fórceps hacia el extremo proximal de los músculos.Lleve los fórceps de vuelta al extremo distal y corte el tendón distal. Agarre suavemente el tendón distal del TA con fórceps curvos y levante el músculo hacia arriba y sobre su inserción proximal. Para cortar cuidadosamente el tendón proximal, corte el otro extremo lo más cerca posible de su unión y transfiera el TA a una placa de Petri.Luego use los fórceps rectos con puntas súper finas para ir debajo del tendón distal de la EDL y deslice los fórceps hacia el extremo proximal del músculo para separar los músculos entre sí. Lleve los fórceps de vuelta al extremo distal y corte el tendón distal sin dañar el músculo. Al agarrar suavemente el tendón distal de EDL con fórceps curvos, levante el músculo hacia arriba y sobre su unión proximal para cortar cuidadosamente el tendón proximal lo más cerca posible de su unión.Corte el otro extremo y transfiera el músculo EDL a una placa de Petri. Repita el procedimiento para la otra extremidad posterior. Use fórceps rectos con puntas súper finas para alcanzar entre el tendón de Aquiles y los huesos inferiores de las extremidades posteriores.Deslice los fórceps hacia el extremo proximal del músculo para separar el músculo de los huesos. Lleve los fórceps de vuelta al extremo distal y corte el tendón distal. Tire del músculo gastrocnemio o GA hacia arriba y sobre el peroné.Para localizar el tendón sóleo proximal. Inserte los fórceps rectos entre los músculos sóleo y GA y mueva los fórceps hacia el extremo distal de los músculos para separar el sóleo del GA. Ahora corte el tendón sóleo proximal. Agárralo con pinzas curvas y levanta con cuidado el sous para acceder a su tendón distal.Corte el tendón distal para aislar el sóleo del AG y coloque el sóleo en la placa de Petri que contiene el medio de lavado. Luego corta el GA y colócalo en la placa de Petri. Para aislar el músculo tríceps, use fórceps rectos con puntas súper finas para alcanzar entre el tríceps y el hueso del húmero y deslice los fórceps hacia el extremo proximal del músculo para separar el músculo del hueso.A continuación, corte el extremo distal del músculo tríceps y con pinzas curvas tire de él hacia arriba y sobre el codo para acceder al tendón proximal. Cortar el tendón proximal del tríceps y transferir el músculo a una placa de Petri. Repita el procedimiento para las otras cuatro extremidades.Para quitar el pelaje y la piel de la mandíbula, use tijeras para hacer una incisión de 0,5 centímetros debajo del ojo, cortando en la dirección caudal. Luego, usando los pulgares y los dedos índice de ambas manos, pellizque cada lado de la incisión y retire la piel tirando de ella hacia arriba y hacia abajo. Localice el tendón principal del masetero en el lado caudal debajo del ojo e inserte la hoja de bisturí plana entre el hueso y el músculo para cortar el tendón.Agarre el tendón del masetero mayor con pinzas curvas y córtelo con una hoja de bisturí o tijeras en la dirección rostral para separar el músculo masetero de la mandíbula. Coloque el músculo masetero aislado en la placa de Petri y repita el procedimiento para el segundo músculo masetero. Use tijeras para hacer una toracotomía en el medio del esternón y corte a través del esternón.Exponga el diafragma cortando 360 grados a través de la caja torácica. Luego, para separar la parte superior del cuerpo del abdomen, use tijeras para cortar la tráquea, el esófago, la vena cava y la aorta abdominal. A continuación, usando tijeras, realice una laparotomía un centímetro por debajo del esternón y haga un corte alrededor de 360 grados.Coloque las tijeras cerradas entre la caja torácica y los órganos abdominales y presione hacia abajo. Tire suavemente de la caja torácica para separarla de los órganos abdominales. Para separar el diafragma de la caja torácica, sostenga libremente el diafragma entre dos dedos y corte a través de la caja torácica con tijeras.Corte el diafragma lo más cerca posible de las costillas alrededor de 360 grados y coloque el diafragma aislado en una placa de Petri. Picar los músculos aislados uno por uno cortándolos en trozos de aproximadamente un milímetro. Transfiera los músculos picados a un tubo cónico de 15 litros que contenga cinco litros de tampón de disociación e incube el tubo a 37 grados centígrados durante 35 minutos en un baño de agua agitante a una velocidad de 60 rotaciones por minuto.Después de la digestión enzimática de los músculos picados, transfiera la suspensión del tubo de 15 mililitros a un tubo de 50 mililitros. Con una jeringa de 10 mililitros equipada con una aguja de calibre 20, vuelva a suspender la muestra tirando de ella hacia arriba y hacia abajo a través de la aguja cinco veces. Extraiga la suspensión celular en la jeringa y cuele la muestra en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros equipado con un filtro celular en la parte superior.Para recuperar todas las células mononucleadas, lave el tubo cónico vacío con 20 mililitros de medios de lavado y viértalo a través del filtro para combinarlo con la muestra filtrada. Recupere el volumen restante debajo del filtro celular con una pipeta P1000. Después de la disociación tisular y la tinción de anticuerpos, las células madre del músculo esquelético o MuSC y los progenitores fibro adipogénicos o FAP de los músculos individuales se purificaron mediante clasificación celular activada por fluorescencia.Después de la activación inicial para identificar las celdas y separar los singletes de los dobletes, se establecieron puertas posteriores utilizando controles FMO para identificar los umbrales de tinción. La muestra de tinción se cerró y la población SCA1 positiva CD31 negativa y CD45 negativa correspondiente a FAPs se clasificó en un tubo de recolección separado. La población doble negativa se cerró aún más para clasificar la población VCA positiva correspondiente a los MuSC.Las suspensiones unicelulares del músculo diafragma y tríceps, a diferencia de las otras, tuvieron una mayor abundancia relativa de MuSC que las FAP. La tinción de EDU, aunque robusta, indicó una diferencia en las fracciones de células EDU positivas para los dos tipos de células madre y entre los diferentes músculos. Sin embargo, para todos los tejidos, la fracción media de MUSC positivos para EDU fue mayor que la de FAP positivos para EDU.Los MuSC aislados de EDL y GA mostraron una incorporación significativamente menor de EDU en comparación con los de TA, diafragma, gracilis o tríceps. Del mismo modo, también se observó una variación significativa en la incorporación de EDU en FAP aislados de diferentes músculos. Finalmente, la pureza celular se confirmó con tinción inmunofluorescente, indicando la especificidad del protocolo de aislamiento de células madre.El paso más crítico es la digestión mecánica del tejido. Cuando el tejido se corta demasiado, la viabilidad disminuye. Cuando el tejido se corta muy poco, la anguila disminuye.El protocolo se puede combinar con ensayos que miden el comportamiento celular, como el injerto después del trasplante para comprender mejor las funciones de las células madre in vivo. Esta técnica puede responder si las diferencias en el comportamiento de las células madre dentro de los músculos individuales pueden contribuir a los fenotipos de enfermedades y enfermedades caracterizadas por patrones únicos de músculos afectados.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Aislar las células madre adultas de músculo esquelético tejidos blandos sobre la base de la velocidad de la adhesión de las células para matraz.

Aislamiento de células madre de tejidos blandos musculoesqueléticos

El micro-disección técnica de explantes es un método robusto y fiable para el aislamiento de proliferación células del músculo esquelético de los músculos menores, adultas o embrionarias como fuente de células madre de músculo esquelético. Excepcionalmente, estas células han sido derivadas por clonación para producir músculo esquelético líneas de células madre utilizadas en el trasplante de vivo.

Adultas y embrionarias del músculo esquelético Cultura Microexplant y aislamiento de células madre de músculo esquelético

Aislamiento y cultivo de fibras musculares es el estándar de...

Aislamiento y cultivo de fibras individuales y sus células satélite del músculo esquelético adulto

El aislamiento y cultivo de una población pura de células satélite quiescentes, una población de células madre de músculo, es esencial para la comprensión de la biología de células madre del músculo y la regeneración, así como el trasplante de células madre para terapias en la distrofia muscular y otras enfermedades degenerativas.

Aislamiento, cultivo y trasplante de células musculares satélite

Los vasos sanguíneos dentro del puerto músculo esquelético varias poblaciones precursoras de múltiples linajes humanos que son ideales para aplicaciones regenerativas. Este método de aislamiento permite la purificación simultánea de tres poblaciones de células precursoras multipotentes, respectivamente, de tres capas estructurales de los vasos sanguíneos: las células endoteliales de miogénicos íntima, pericitos de los medios de comunicación y células adventicias de la adventicia.

Aislamiento de Vaso sanguíneo derivado Multipotentes Precursores de músculo esquelético humano

Los principales tipos de células adherentes derivadas del músculo humano son las células miogénicas y los fibroblastos. Aquí, las poblaciones celulares se enriquecen mediante la clasificación de células activadas magnéticamente basadas en el antígeno CD56. El posterior inmunomarcaje con anticuerpos específicos y el uso de técnicas de análisis de imagen permiten cuantificar las características citoplasmáticas y nucleares de las células individuales.

Aislamiento y Caracterización cuantitativa inmunocitoquímica de células miogénicas Primarias y fibroblastos de músculo esquelético humano

Presentamos técnicas para aislar, cultivar, caracterizar y diferenciar las células progenitoras musculares primarias humanas (hMPC) obtenidas del tejido de biopsia muscular esquelética.  los hMPC obtenidos y caracterizados a través de estos métodos se pueden utilizar para abordar posteriormente cuestiones de investigación relacionadas con la miogénesis humana y la regeneración muscular esquelética.

Aislamiento, cultivo, caracterización y diferenciación de células progenitoras musculares humanas del procedimiento de biopsia muscular esquelética

Aquí, proponemos un método para obtener eficientemente fibras musculares individuales en etapas de desarrollo postnatal tempranas a partir del modelo de ratón lamin 8-11 mutante homocigoto, un modelo muy severo para la distrofia muscular de Emery-Dreifuss (EDMD).

Aislamiento de miofiber único y cultura de un modelo murino de distrofia muscular de Emery-Dreifuss en el desarrollo post-Natal temprano

En este protocolo se describe un método de cultivo y análisis funcional in vitro para células madre musculares, que conserva la mayoría de sus interacciones con su nicho endógeno.

Ensayo único de cultivo de Myofiber para la evaluación de la funcionalidad de las células madre musculares adultas ex vivo

El músculo esquelético comprende múltiples tipos de células, incluidas las células madre residentes, cada una con una contribución especial a la homeostasis y regeneración muscular. Aquí, se describe el cultivo 2D de células madre musculares y el nicho de células musculares en un entorno ex vivo que conserva muchas de las características fisiológicas, in vivo y ambientales.

Cultivo masivo no fraccionado de músculo esquelético de ratón para recapitular la quiescencia de nicho y de células madre

Este protocolo proporciona un método estandarizado para aislar y enriquecer mioblastos primarios del músculo óseo de ratón adulto y neonatal mediante disociación tisular, filtración secuencial, pre-placado y condiciones definidas de cultivo, permitiendo el establecimiento y mantenimiento de cultivos de mioblastos derivados de células satélite para aplicaciones experimentales posteriores.

Aislamiento de células satélite del músculo esquelético para estudios in vitro de miogénesis

Aprende a aislar células madre musculares y progenitores fibro-adipogénicos de músculos esqueléticos individuales en ratones. Este protocolo utiliza disociación enzimática y citometría de flujo para estudiar funciones de células madre en homeostasis, regeneración y enfermedades.

Aislamiento de poblaciones de células madre quiescentes de músculos esqueléticos individuales

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