Name: Un método de electroporación para transformar Rickettsia spp. con un vector lanzadera fluorescente que expresa proteínas en líneas celulares de garrapatas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-11T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Aprende a transformar Rickettsia parkeri mediante electroporación con vectores fluorescentes en líneas celulares de garrapatas. Este protocolo permite estudiar la función génica en estas bacterias intracelulares obligadas.

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Agradecemos a Timothy J. Kurtti y Benjamin Cull por sus perspicaces discusiones y sugerencias. Este estudio fue apoyado financieramente por una subvención a U.G.M. del NIH (2R01AI049424) y una subvención a U.G.M. de la Estación Experimental Agrícola de Minnesota (MIN-17-078).

1. Propagación y purificación de R. parkeri a partir de cultivo de células de garrapatas
NOTA: Todos los procedimientos de cultivo celular deben realizarse en un gabinete de bioseguridad de clase II.
<ol><li>Preparando R. parkeri-células de garrapatas infectadas<ol><li>Cultivar células ISE6 en matraces de cultivo celular de 25 cm 2 a 34 °C en 5 ml de L15C300 medio17, suplementado con 5%de suero fetal bovino (FBS), 5% de caldo de fosfato de triptosa (TPB) y 0,1% de concentrado de lipoproteínas (LPC). NOTA: ISE6 (Ixodes scapularis embryo-derived cell line) es una línea celular de garrapata ampliamente utilizada en muchos laboratorios y, por lo tanto, es un modelo esencial para estudiar las interacciones garrapata-patógeno17,18,19. La tasa de crecimiento de las células ISE6 es más lenta que la de las células de mamíferos, con un tiempo de duplicación de la población de ≥72 h. Por ejemplo, las células ISE6 subcultivadas a partir de un cultivo 100% confluente en una proporción de 1:5 tardarán de 3 a 4 semanas en recuperar el 100% de confluencia. Las células ISE6 sanas generalmente se redondearán con numerosos filamentos adheridos17.</li>
		<li>Cuente las células ISE6 con un hemocitómetro bajo un microscopio óptico. Usar a una concentración de ~106 células/ml (100% confluente).<ol><li>Enjuagar suavemente las células del matraz con medio y dispersar las células pipeteando para generar una suspensión celular homogénea. Agregue 20 μL de suspensión celular entre el hemocitómetro y cubra el vidrio para contar las células con un hemocitómetro.</li>
		</ol></li>
		<li>Añadir R. parkeri 20 de tipo silvestre libre de células hospedadoras (número medio: 5 × 10 7-10 × 107) a los cultivos celulares ISE6 en matraces de cultivo celular de 25 cm2. Incubar cultivos celulares de R. parkeri infectados a 34 °C en 5 ml de medio completo compuesto por medio L15C300, 10% FBS, 5% TPB, 0,1% LPC, 0,25% bicarbonato de sodio (NaHCO3) y 25 mM HEPES hasta que el 90%-100% de las células estén infectadas. NOTA: La tasa de infección de R. parkeri en las células ISE6 está determinada por la tinción de Giemsa, y el tiempo de incubación para alcanzar el 90% -100% de infección varía de 5 días a 7 días en promedio.</li>
		<li>Determinar la tasa de infección a través de la tinción de Giemsa.<ol><li>En el gabinete de bioseguridad, resuspender los cultivos celulares infectados y transferir 50 μL de la suspensión a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.</li>
			<li>Diluir la suspensión con medio completo (dilución 1:5) y centrifugar 100 μL en portaobjetos de microscopio de vidrio utilizando una centrífuga a 113 × g durante 5 min. Para mantener vivo R. parkeri contenido, use una centrífuga con un rotor sellado que esté diseñado para ser retirado de la centrífuga. Esto permite el transporte del rotor sellado dentro y fuera del capó. NOTA: Como los R. parkeri todavía están vivos antes de la centrifugación, la muestra debe contenerse hasta que se elimine la rickettsia. Por lo tanto, la centrífuga utilizada para hacer girar el cultivo de R. parkeri sobre la corredera debe tener un rotor sellado que esté diseñado para ser levantado fuera de la centrífuga. Con el rotor en la campana de flujo laminar, cargue las muestras en el conjunto de portaobjetos de embudo-microscopio, vuelva a sellar el rotor y vuelva a colocar el rotor sellado en la centrífuga. Luego, encienda la centrífuga y las muestras se depositan en los portaobjetos del microscopio. Una vez finalizada la carrera, retire el rotor sellado de la centrífuga y colóquelo en la campana de flujo laminar. Allí, abra la tapa del rotor y descargue el conjunto de portaobjetos de embudo-microscopio dentro del capó. Una vez seco, sumerja los portaobjetos del microscopio de vidrio en metanol absoluto, que mata a todos los patógenos. Los embudos y los portadores metálicos se sumergen en DMQ diluido, lo que mata a R. parkeri.</li>
			<li>Seque al aire los portaobjetos y fíjelos en metanol absoluto durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT).</li>
			<li>Manchar los portaobjetos con tinción de Giemsa (4% en tampón de Sørenson, pH 6,6) durante 30 min a 37 °C y enjuagar con agua durante 5 s.</li>
			<li>Determinar el porcentaje de infección (número de células infectadas con rickettsiae/100 células) mediante microscopía óptica. NOTA: La Figura 1 muestra los resultados típicos de la tinción de Giemsa.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de R. parkeri libre de células NOTA: Cuando el 90%-100% de las células en el cultivo están infectadas, las rickettsias deben aislarse de las células ISE6 y se debe realizar la electroporación.<ol><li>Agregue grano de carburo de silicio estéril 60-90 a tubos de microcentrífuga estériles de 2 ml a un volumen de aproximadamente 0,2 ml.</li>
		<li>Extraer 2 ml de medio de cultivos infectados con R. parkeri al 100% (paso 1.1.3) y resuspender las células en los 3 ml restantes de medio.</li>
		<li>Transfiera partes iguales de esta suspensión a los tubos preparados en el paso 1.2.1.</li>
		<li>Vórtice cada tubo a alta velocidad durante 30 s y luego coloque los tubos sobre hielo. Deje que la arena se asiente en segundos por gravedad.</li>
		<li>En un gabinete de bioseguridad de clase II, tenga lista una jeringa Luer-lock estéril de 5 ml con el émbolo extendido y el extremo del émbolo asegurado en una base de poliestireno para tubos cónicos de 15 ml.</li>
		<li>Utilizando una punta de pipeta de barrera estéril de 1 ml instalada en un pipete adecuado, retire el sobrenadante del lisado celular vórtice del tubo, teniendo cuidado de no aspirar ningún grano. Inserte la punta de la pipeta en la abertura del cubo de la jeringa y expulse el contenido en la jeringa con una presión suave. Alternativamente, utilice una pipeta estéril Pasteur de barrera de 2 ml operada con una bombilla de goma.</li>
		<li>Coloque un filtro esterilizado de tamaño de poro de 2 μm en el cubo de la jeringa y filtre el cultivo de R. parkeri del paso 1.2.6 en tubos estériles de 1,5 ml.</li>
		<li>Recoger el R. parkeri por centrifugación a 13.600 × g a 4 °C durante 5 min, y desechar el sobrenadante.</li>
		<li>Vuelva a suspender el pellet en 1,2 ml de sacarosa helada de 300 mM y centrifugar de nuevo a 13.600 × g a 4 °C durante 5 min. Repita la resuspensión y centrifugación para un total de dos lavados de sacarosa.</li>
		<li>Combine los gránulos de R. parkeri en un tubo de microcentrífuga refrigerado y estéril de 1,5 ml en 50 μL de sacarosa helada de 300 mM por transformación. Como un matraz de 25 cm2 de R. parkeri proporciona suficientes rickettsias para dos o tres transformaciones, añadir 100-150 μL de sacarosa fría de 300 mM. NOTA: Si se desea, el número de rickettsias se puede calcular utilizando una cámara de conteo de Petroff-Hausser. Cuando se utiliza una inoculación inicial de 5 × 107 -10 × 10 7 R. parkeri libre de células, tomará 5-7 días en promedio alcanzar el 90% -100% de infección, produciendo aproximadamente 5 × 107-10 × 1010 R. parkeri libre de células.</li>
		<li>Resuspenda suavemente el pellet pipeteando hasta que se disperse completamente. Dividir la muestra en porciones de 50 μL en tubos de microcentrífuga refrigerados y estériles de 1,5 ml. NOTA: Si se desea, la viabilidad rickettsial puede evaluarse mediante citometría de flujo después de la tinción con un colorante fluorescente 21.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Transformación de R. parkeri con el plásmido pRAM18dSFA
<ol><li>En hielo, añadir 3 μg de pRAM18dSFA ADN plásmido libre de endotoxinas13,15,20 a cada tubo que contenga 50 μL de suspensión de R. parkeri y agitar la mezcla con la punta de la pipeta suave pero completamente. NOTA: Al preparar ADN plásmido, utilice un kit de purificación que incluya un paso de eliminación de endotoxinas para obtener ADN plásmido libre de endotoxinas23. Encontramos que un rango de concentraciones de plásmidos de entre 1 μg y 3 μg por 50 μL de suspensión de R. parkeri dio lugar a transformaciones exitosas, mientras que el aumento de la cantidad de plásmido a 10 μg inhibió la transformación.</li>
	<li>Transfiera la mezcla anterior de ADN y R. parkeri a una cubeta de electroporación refrigerada y estéril de 0,1 cm (golpee suavemente la cubeta hasta que la mezcla se distribuya uniformemente) y déjela reposar en hielo durante 10-30 minutos.</li>
	<li>Retire el medio de un cultivo 100% confluente de células ISE6 y resuspenda las capas celulares en 1,5 ml de medio fresco con NaHCO 3 y tampón HEPES (descrito anteriormente en el paso 1.1.3). Utilice un matraz de células confluentes por transformación.</li>
	<li>Transfiera las células resuspendidas a un tubo de microcentrífuga estéril de 2 ml (un tubo por cada matraz de 25 cm2 de células ISE6).</li>
	<li>Electroporar la mezcla de R. parkeri/pRAM18dSFA a 1,8 KV, 200 ohmios, 25 μF utilizando un electroporador.</li>
	<li>Con una pipeta de transferencia de punta fina estéril y extendida, transfiera una pequeña cantidad de la suspensión de células ISE6 (paso 2.4) a la cubeta y tire suavemente del líquido hacia arriba y hacia abajo para lavar la cubeta. Transfiera la mezcla al tubo de microcentrífuga de 2 ml que contiene el resto de la suspensión celular ISE6 y mezcle suavemente la mezcla de transformación con las células.</li>
	<li>Centrifugar las muestras transformadas a 700 × g durante 2 min a RT, y luego aumentar la velocidad de centrifugación a 13.600 × g durante 1 min más a RT. NOTA: Las dos velocidades de centrifugación promueven la unión rickettsial y la entrada en las células: 700 × g se utilizan para tirar hacia abajo de las células ISE6, mientras que 13.600 × g se utilizan para tirar hacia abajo de las rickettsias.</li>
	<li>Dejar reposar las muestras a RT o 34 °C durante 15 min a 1 h.</li>
	<li>Resuspender los transformadores (dos o tres) en células ISE6 con una punta de pipeta de barrera estéril de 2 ml instalada en una pipeta y transferir a dos o tres matraces de cultivo celular de 25cm2 que contengan 3,5 ml de medio fresco con tampón NaHCO3 y HEPES. Alternativamente, utilice una pipeta estéril Pasteur de barrera de 2 ml operada con una bombilla de goma.</li>
	<li>Mece los matraces para esparcir la mezcla uniformemente y luego incubar a 34 °C.</li>
	<li>Después de 16-24 h, añadir 10 μL de espectinomicina (50 mg/ml) y 10 μL de estreptomicina (50 mg/ml) a cada matraz en la etapa 2.10.</li>
</ol>3. Observación del R. parkeri transformado
NOTA: Utilice un microscopio de epifluorescencia con filtros de rodamina/TRITC para observar los matraces preparados en el paso 2.11 después de 3-7 días. Una vez que las placas son evidentes en los cultivos (5-14 días), se puede ver R. parkeri transformado que expresa la proteína fluorescente roja mKATE, codificada en el plásmido pRAM18dSFA.
<ol><li>Microscopía confocal<ol><li>Resuspender los cultivos celulares de los matraces del paso 2.11 y mezclar 100 μL de estos cultivos celulares con 5 μL de solución Hoechst 33342 durante 10-30 min a RT en la oscuridad. NOTA: Hoechst 33342 es una contratinción nuclear permeable a las células que se une al ADN de las células vivas de garrapatas y emite fluorescencia azul.</li>
		<li>Centrifugar 50 μL de la mezcla en portaobjetos de microscopio de vidrio utilizando una centrífuga a 5 × g durante 3 min.</li>
		<li>Agregue 3 μL de 1x PBS al punto de células depositadas en el portaobjetos, superponga con un cubreobjetos y vea con un microscopio confocal (objetivo 60x). Utilice los siguientes parámetros de excitación y emisión para imágenes fluorescentes: para 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), excitación a 350 nm, emisión a 470 nm; para tetrametilrodamina (TRITC), excitación a 557 nm, emisión a 576 nm.</li>
	</ol></li>
</ol>

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No se declaran conflictos de intereses.

Aquí, demostramos un método para introducir ADN exógeno codificado en el plásmido lanzadera pRAM18dSFA en rickettsiae utilizando electroporación. En este procedimiento, las rickettsias libres de células se purificaron a partir de células huésped, se transformaron con un vector lanzadera rickettsial y se liberaron en las células de garrapatas para la infección. También se describe un procedimiento de inmunofluorescencia confocal para detectar R. parkeri que expresa la proteína de fluorescencia roja en células de ...

Las rickettsiosis son causadas por una amplia gama de bacterias intracelulares obligadas que pertenecen al género Rickettsia (familia Rickettsiaceae, orden Rickettsiales). El género Rickettsia se clasifica en cuatro grupos principales basados en características filogenéticas1,2: el grupo de fiebre manchada (SFG), que contiene aquellas rickettsias que causan las rickettsias transmitidas por garrapatas más graves y fatales (por ejemplo, Rickettsia rickettsii, el agente causante de la fiebre maculosa de las Montañas Rocosas), el grupo del tifus (TG, por ejemplo, Rickettsia prowazekii, el agente del tifus epidémico), el grupo de transición (TRG, por ejemplo, Rickettsia felis, el agente causante de la fiebre maculosa transmitida por pulgas) y el grupo ancestral (AG, por ejemplo, Rickettsia bellii). 
Entre las enfermedades transmitidas por vectores más antiguas conocidas, las rickettsiosis se adquieren principalmente después de la transmisión de los patógenos a través de las picaduras de artrópodos vectores infectados, incluyendo garrapatas, pulgas, piojos y ácaros 3,4. Aunque el descubrimiento de antibióticos efectivos mejoró los resultados del tratamiento, las rickettsiosis epidémicas emergentes y reemergentes continúan desafiando las estrategias tradicionales de prevención y control. Por lo tanto, una comprensión integral de las interacciones rickettsia / huésped / vector establecería en última instancia una base sólida para desarrollar nuevos enfoques para prevenir y curar estas enfermedades antiguas.
En la naturaleza, la transferencia horizontal de genes (HGT) en bacterias ocurre a través de la conjugación, transducción y transformación5. La transformación bacteriana in vitro utiliza estos conceptos de HGT, aunque la naturaleza intracelular de rickettsiae presenta algunos desafíos. Las condiciones de crecimiento restringidas y los sistemas de conjugación y transducción poco conocidos en diferentes especies de rickettsias han impedido la aplicación de métodos de conjugación y transducción en rickettsias 6,7,8. En comparación con otros géneros bacterianos intracelulares obligados (por ejemplo, Chlamydia, Coxiella, Anaplasma y Ehrlichia), el género Rickettsia difiere con respecto a las estrategias de crecimiento y replicación dentro del citoplasma celular, lo que impone desafíos específicos a la modificación genética de rickettsiae debido a sus características únicas de estilo de vida9.
El obstáculo inicial a superar al intentar la modificación genética de rickettsiae es lograr una transformación exitosa. Por lo tanto, diseñar un enfoque factible con alta eficiencia de transformación sería extremadamente valioso para desarrollar herramientas genéticas para rickettsiae. Aquí, nos centramos en la electroporación, un método de transformación ampliamente reconocido que se ha utilizado para introducir ADN exógeno con éxito en varias especies de rickettsiae, incluyendo Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii y Rickettsia buchneri10,11,12 ,13,14,15,16.
Este artículo describe un procedimiento para la electroporación de la cepa Tate's Hell de R. parkeri (accesición: GCA_000965145.1) con el vector lanzadera pRAM18dSFA derivado del plásmido pRAM18 de la cepa AaR/SC de Rickettsia amblyommatis diseñado para codificar mKATE, una proteína fluorescente de color rojo lejano, y aadA, que confiere resistencia a la espectinomicina y la estreptomicina13,15,20. Los R. parkeri transformados son viables y se mantienen establemente bajo selección de antibióticos en líneas celulares de garrapatas. Además, mostramos que la localización de R. parkeri transformado en células vivas de garrapatas mediante microscopía confocal se puede utilizar para evaluar la calidad de las tasas de transformación en líneas celulares vectoriales.

<table><tbody><tr><td>0,1 cm de espacio gen pulsador de electroporación cubeta</td><td>Bio-Rad</td><td>1652083</td><td></td></tr><tr><td>2 &mu; Filtro de tamaño de poro m&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences Whatman</td><td>6783-2520</td><td></td></tr> 5 <tr><td>mL Jeringa Luer-lock&nbsp;</td><td>Grano</td><td></td> de carburo de silicio BD 309646 <td></td></tr><tr><td>60-90&nbsp;</td><td>LORTONE, inc</td><td>&nbsp; 591-056</td><td></td></tr><tr><td>metanol absoluto&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A457-4</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de fosfato de triptosa Bacto&nbsp;</td><td>BD</td><td>260300</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Cytospin Cytospin4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A78300003</td><td>El rotor es desmontable, por lo que todo el rotor se puede colocar en el capó para cargar muestras infecciosas</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td>utilizado para obtener un plásmido pRAM18dSFA libre de endotoxinas</td></tr><tr><td>pipeta de transferencia de punta fina extendida&nbsp;</td><td>Perfector Scientific</td><td>TP03-5301</td><td></td></tr><tr><td>suero fetal bovino&nbsp;</td><td>Gemini Bio</td><td>900-108</td><td>El lote FBS tiene que ser probado para asegurarse de que las células ISE6 crecerán bien en él.</td></tr><tr><td>Electroporador Gene Pulser II con controlador de pulsos PLUS</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2105 y 165-2110</td><td></td></tr><tr><td>hemocitómetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Instituto Nacional de Salud</td><td></td> de Fiji edición de <td>imágenes en bruto</td></tr><tr><td>KaryoMAX Giemsa tinción&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; 2021-10-30</td><td></td></tr><tr><td>Medio L-15</td><td>Gibco</td><td>41300039</td><td></td></tr><tr><td>concentrado de lipoproteínas de Leibovitz&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>191476</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Diaphot</td><td>Microscopio de epifluorescencia</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Live ReadyReactivo de sondas&nbsp;</td>Microscopio confocal <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Disc Scanning Unit (DSU)&nbsp;</td><td>Cámara</td> de recuento Olympus <td></td><td></td></tr><tr><td>Petroff-Hausser</td><td>Hausser Scientific</td><td>&nbsp; Cámara 3900</td><td></td></tr><tr><td>bicarbonato de sodio</td><td>Millipore-Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher Vortex Genie 2</td><td>12-812</td><td></td></tr></tbody></table>

un método de electroporación para transformar rickettsia spp. con un vector lanzadera fluorescente que expresa proteínas en líneas celulares de garrapatas

An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines

Las rickettsiosis son causadas por una amplia gama de bacterias intracelulares obligadas pertenecientes al género Rickettsia que pueden transmitirse a huéspedes vertebrados a través de la picadura de artrópodos vectores infectados. Hasta la fecha, las rickettsiosis epidémicas emergentes o reemergentes siguen siendo un riesgo para la salud pública debido a la dificultad en el diagnóstico, ya que los métodos de diagnóstico son limitados y no están estandarizados o universalmente accesibles. El diagnóstico erróneo resultante de la falta de reconocimiento de los signos y síntomas puede dar lugar a un retraso en el tratamiento con antibióticos y a resultados de salud deficientes. Una comprensión integral de las características de la rickettsia mejoraría en última instancia el diagnóstico clínico, la evaluación y el tratamiento con un mejor control y prevención de la enfermedad. 
Los estudios funcionales de los genes rickettsiales son cruciales para comprender su papel en la patogénesis. Este artículo describe un procedimiento para la electroporación de la cepa de Rickettsia parkeri Tate's Hell con el vector lanzadera pRAM18dSFA y la selección de R. parkeri transformado en cultivo de células de garrapatas con antibióticos (espectinomicina y estreptomicina). También se describe un método para la localización de R. parkeri transformado en células de garrapatas utilizando microscopía de inmunofluorescencia confocal, una técnica útil para verificar la transformación en líneas celulares vectoriales. Enfoques similares también son adecuados para la transformación de otras rickettsiae.

La morfología de R. parkeri en células ISE6 bajo un microscopio óptico después de la tinción de Giemsa se muestra en la Figura 1. En la Figura 2, R. parkeri transformada que expresa proteína de fluorescencia roja en células ISE6 se muestra mediante microscopía confocal. Hay un aumento sustancial en la tasa de infección de R. parkeri transformado (rojo) en células ISE6 (azul, corresponde a los núcleos) desde (A) día 7 h...

La electroporación es un método rápido y ampliamente adoptado para introducir ADN exógeno en el género Rickettsia. Este protocolo proporciona un método de electroporación útil para la transformación de bacterias intracelulares obligadas en el género Rickettsia.

Un método de electroporación para transformar Rickettsia spp. con un vector lanzadera fluorescente que expresa proteínas en líneas celulares de garrapatas

Rickettsioses are caused by a broad range of obligate intracellular bacteria belonging to the genus Rickettsia that can be transmitted to vertebrate hosts ...

Los estudios funcionales de los genes de Rickettsia son cruciales para comprender su papel en la patogénesis, por lo que necesitamos métodos confiables para alterar los genes de manera controlada. Nuestro protocolo utiliza la electroporación para introducir ADN exógeno en bacterias intracelulares obligadas del género Rickettsia, lo que nos permite estudiar los efectos del ADN introducido. Demostrando el procedimiento junto conmigo hoy estará Lisa Price, investigadora del Dr. Munderloh y del laboratorio del Dr. Kurtti.Para comenzar, prepare un cultivo de células ISE6 infectado con Rickettsia parkeri al 90 a 100% como se describe en el texto. Luego, para determinar la tasa de infección por tinción de Giemsa, diluya la suspensión celular a una proporción de 1: 5 con medio completo y deposite 100 microlitros de la suspensión celular en un portaobjetos de microscopio de vidrio por centrifugación a 113 G durante cinco minutos. Después de dejar que la diapositiva se seque al aire, fíjela en un metanol absoluto durante cinco minutos a temperatura ambiente.Luego, incuba el tobogán y tinción de Giemsa durante 30 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, enjuague el portaobjetos en agua y una vez seco, véalo bajo un microscopio óptico con objetivos de aceite. Determine el porcentaje de células infectadas contando las células infectadas y no infectadas.Para preparar el Rickettsia parkeri libre de células, vierta aproximadamente 0,2 mililitros de arena estéril de carburo de silicio de 60 a 90 en dos tubos de microcentrífuga estériles de dos mililitros y deje los tubos a un lado. De un matraz previamente inoculado infectado con Rickettsia parkeri que contenga cinco mililitros de medio, extraer dos mililitros del medio, teniendo cuidado de no perturbar la capa celular. Luego, resuspenda las células con los tres mililitros restantes del medio.Divida esta suspensión en partes iguales entre los dos tubos de arena de carburo de silicona preparados y haga un vórtice del tubo a alta velocidad durante 30 segundos. Luego, colócalos en hielo. A continuación, prepare una jeringa luer lock estéril de cinco mililitros extendiendo el émbolo e inserte el extremo del émbolo en una base de poliestireno utilizada para sostener tubos cónicos de 15 mililitros.Usando una pipeta Pasteur de barrera de dos mililitros operada con una bombilla de goma, retire cuidadosamente el sobrenadante de las células de vórtice sin aspirar ningún grano. A continuación, inserte la punta de la pipeta en la abertura del cubo de la jeringa y expulse el contenido en la jeringa con una presión suave. A continuación, filtre el cultivo de Rickettsia parkeri en tubos estériles de 1,5 mililitros a través de un filtro estéril de dos micrómetros de tamaño de poro instalado en el cubo de la jeringa y centrifugar los tubos a 13, 600 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Después de retirar el sobrenadante, lave el pellet celular dos veces con 1.2 mililitros de solución de sacarosa helada de 300 milimolares. Centrifugar la muestra y retirar el sobrenadante entre lavados. Al final de la centrifugación, resuspender el pellet de celda agrupado con 100 a 150 microlitros de solución de sacarosa helada para dos o tres muestras de transformación, respectivamente.Luego, divida la muestra en alícuotas de 50 microlitros en tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 microlitros preenfriados. Para la transformación a tres microgramos de ADN plásmido pRAM18sSFA libre de endotoxinas a cada tubo que contiene 50 microlitros de Rickettsia parkeri en hielo y agitar suavemente con una punta de pipeta. Transfiera la mezcla a una cubeta de electroporación estéril preenfriada con un espacio de 0,1 centímetros.Golpee suavemente la cubeta para distribuir la mezcla uniformemente e incubar en hielo durante 10 a 30 minutos. Mientras tanto, retire el medio de un matraz de cultivo celular ISE6 previamente cultivado completamente confluente y resuspenda la capa celular enjuagando suavemente las células con 1,5 mililitros de medio fresco que contenga bicarbonato de sodio y tampón HEPES. Después de generar una suspensión celular homogénea, transfiera todo el volumen a un solo tubo de microcentrífuga estéril de dos mililitros.A continuación, electroporate la mezcla de ADN de Rickettsia parkeri y plásmido usando un electroporador. Después de la electroporación, use una pipeta estéril extendida de punta fina para transferir una pequeña cantidad de la suspensión de células ISE6 a la cubeta y pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para recuperar la Rickettsia parkeri electroporada. Luego, transfiera el contenido de la cubeta al tubo de dos mililitros que contiene el resto de la suspensión de celdas ISE6.A continuación, centrifugar la muestra a temperatura ambiente, primero a 700 G durante dos minutos para bajar las células ISE6, y luego a 13, 600 G durante un minuto para bajar la Rickettsia. Incubar el tubo a 34 grados centígrados durante 15 minutos a una hora. Después de la incubación, transferir el contenido resuspendido de una transformación a un matraz de cultivo celular de 25 centímetros cuadrados que contenga 3,5 mililitros de medio fresco con bicarbonato de sodio y tampón HEPES.Mece el matraz para esparcir la mezcla uniformemente e incubar a 34 grados centígrados. Después de 16 a 24 horas, añadir 10 microlitros de espectinomicina y estreptomicina en el matraz incubado. Meca el matraz para mezclar los antibióticos uniformemente en el medio antes de devolverlo a la incubadora.La propagación exitosa de células salvajes de Rickettsia parkeri e ISE6 fue evidente por la tinción de Giemsa. Los núcleos de las células ISE6 teñidas de púrpura oscuro con Giemsa en el Rickettsi intracelular y extracelular son visibles. La transformación de Rickettsia parkeri expresando la proteína de fluorescencia roja en células ISE6 se confirmó mediante microscopía confocal después de siete días de incubación.Se observó un aumento sustancial en la tasa de infección después de 10 días. Mantenga todo estéril durante todo el procedimiento. Preste atención a los detalles y sea paciente, ya que algunas especies de Rickettsia tardan mucho tiempo en transformarse, especialmente los endosimbiontes de crecimiento lento.Este protocolo ha permitido el estudio de múltiples aspectos de la biología de Rickettsia y sus interacciones con sus artrópodos vectores y huéspedes mamíferos. Por ejemplo, Rickettsi que expresa proteínas fluorescentes se ha utilizado para rastrear la motilidad y las interacciones simbiontes de las células de garrapata.

an-electroporation-method-to-transform-rickettsia-spp-with

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Lyme estudios de investigación de la enfermedad a menudo requieren la generación de garrapatas infectadas con el patógeno Borrelia burgdorferi, un proceso que suele tardar varias semanas. Aquí se demuestra un procedimiento tick microinyección basado en una infección que se puede lograr en cuestión de horas. También demostramos un método de inmunofluorescencia para la localización in situ de B. burgdorferi en garrapatas.

Métodos para la transferencia rápida y localización de la enfermedad de Lyme patógenos en el intestino garrapatas

Fuente: Aigrain, L., et al. Internalización y observación de biomoléculas fluorescentes en microorganismos vivos mediante electroporación.  J. Vis. Exp. (2015)El vídeo demuestra la entrega de biomoléculas fluorescentes en células microbianas electrocompetentes mediante electroporación. El proceso comienza con la introducción de ADN o proteínas marcadas con fluoróforo en una suspensión celular refrigerada. A continuación, se aplica un pulso de alto voltaje para crear poros temporales de...

Entrega por electroporación de biomoléculas fluorescentes en células bacterianas

Este video demuestra la técnica de electroporación que introduce ADN plásmido codificante de proteínas fluorescentes en precursores de células granulosas cerebelosas primarias de ratón.

Entrega de genes in vitro mediada por electroporación: una técnica de pulso eléctrico para introducir plásmidos fluorescentes que codifican proteínas reporteras en células cultivadas

En este video, describimos la nucleologción, un procedimiento de transfección basado en electroporación para entregar ADN plásmido codificante de proteínas indicadoras fluorescentes en forma de esporozoito del parásito pollo Eimeria.

Nucleofección de formas de parásitos: un método de transfección basado en electroporación para administrar plásmidos codificantes de proteínas fluorescentes en el núcleo de esporozoíto

En este video, demostramos la introducción de proteínas efectoras bacterianas en células de mamíferos por electroporación. La localización intracelular de las proteínas efectoras bacterianas se detecta mediante microscopía confocal tras la tinción con anticuerpos específicos conjugados con fluoróforos.

Introducción de proteínas efectoras bacterianas en células de mamíferos por electroporación

Los estudios de biomoléculas in vivo son cruciales para comprender la función molecular en un contexto biológico. Aquí describimos un método novedoso que permite la internalización de biomoléculas fluorescentes, como el ADN o las proteínas, en microorganismos vivos. También se presenta y discute el análisis de datos in vivo registrados por microscopía de fluorescencia.

Internalización y Observación de fluorescente Biomoléculas en microorganismos que viven a través de electroporación

La electroporación se utilizó para insertar proteínas efectoras de virulencia bacteriana purificadas directamente en células eucariotas vivas. La localización de proteínas se monitorizó mediante microscopía de inmunofluorescencia confocal. Este método permite estudiar el tráfico, la función y las interacciones proteína-proteína utilizando proteínas exógenas activas, evitando la necesidad de expresión heteróloga en células eucariotas.

La electroporación de efectores bacterianos funcionales en células de mamífero

La translocación del efector a las células huésped a través de un sistema de secreción de tipo III es una estrategia de virulencia común entre las bacterias gramnegativas. Se aplicó un ensayo basado en fusión de efectores betalactamasas para el análisis cuantitativo de la translocación. En las células infectadas por Yersinia, la conversión de un indicador FRET por la betalactamasa se controla mediante microscopía de barrido láser.

Análisis de<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Efector translocación en las células huésped Usando beta-lactamasa Efector fusiones

El presente protocolo describe un método para inyectar embriones de garrapata. La inyección de embriones es la técnica preferida para la manipulación genética para generar líneas transgénicas.

Técnica de inyección de embriones para la edición de genes en la garrapata de patas negras, Ixodes scapularis

La capacidad de los bacteriófagos para mover el ADN entre las células bacterianas los convierte en herramientas efectivas para la manipulación genética de sus huéspedes bacterianos. Aquí se presenta una metodología para inducir, recuperar y usar φBB-1, un bacteriófago de Borrelia burgdorferi, para transducir ADN heterólogo entre diferentes cepas de la espiroqueta de la enfermedad de Lyme.

Manipulación genética mediada por fagos de la enfermedad de Lyme Espiroqueta Borrelia burgdorferi

Aprende a transformar Rickettsia parkeri mediante electroporación con vectores fluorescentes en líneas celulares de garrapatas. Este protocolo permite estudiar la función génica en estas bacterias intracelulares obligadas.

Un método de electroporación para transformar Rickettsia spp. con un vector lanzadera fluorescente que expresa proteínas en líneas celulares de garrapatas (Video) | JoVE Journal

Un método de electroporación para transformar Rickettsia spp. con un vector lanzadera fluorescente que expresa proteínas en líneas celulares de garrapatas

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