Name: Establecimiento de esferoides tridimensionales a partir de muestras tumorales derivadas de pacientes y evaluación de su sensibilidad a los fármacos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Aprenda a generar esferoides tridimensionales a partir de células cancerosas primarias para evaluar la sensibilidad tumoral a fármacos anticancerígenos. Este método económico permite personalizar tratamientos oncológicos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

La recolección de muestras de tumores humanos utilizados para los cultivos de células tumorales primarias se realizó según los protocolos aprobados por la junta de revisión institucional (IRB) en el Centro Médico Rabin con el consentimiento informado por escrito de los pacientes. Los pacientes elegibles para participar en el estudio incluyeron hombres y mujeres adultos y pacientes pediátricos con cáncer de mama, colon, hígado, pulmón, neuroendocrino, ovario o páncreas no metastásico, cualquier cáncer pediátrico o cualquier cáncer metastásico. El único criterio de exclusión fue la falta de capacidad para dar su consentimiento informado.
1. Generación y recolección de esferoides
NOTA: El aislamiento de células tumorales primarias puede realizarse como lo describen Kodak et al.8. Es importante destacar que las células tumorales primarias utilizadas para generar los esferoides pueden derivarse directamente de muestras de pacientes obtenidas por biopsia, resección, etc., o indirectamente utilizando muestras tumorales de modelos de xenoinjertos derivados del paciente (PDX), como lo describen Moskovits et al.9.
<ol><li>Preparar una suspensión unicelular de cultivos de células tumorales primarias adherentes de confluencia del 75% al 100% tomando un matraz pequeño (T25) con un cultivo celular primario adherente de una sola célula, retirando los medios de cultivo celular, lavando con PBS y luego agregando 1 ml de 1x Accutase (una solución de desprendimiento celular) (consulte la Tabla de materiales) durante 3 min a 37 °C.</li>
	<li>Neutralice la solución de Accutase agregando 5 ml de medio de cultivo celular (medio de cultivo RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS, 1:100 de penicilina-estreptomicina, 1% de aminoácidos no esenciales y 1% de L-glutamina; consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Aspirar las células con una pipeta serológica de 10 mL, y depositarlas en un tubo cónico de 15 mL. Centrifugar el tubo a 800 x g durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire el medio de cultivo celular, agregue 5 ml de medio de cultivo celular fresco sobre el pellet celular y mezcle suavemente.</li>
	<li>Contar las células viables con un hemocitómetro10. Para ello, tome una alícuota de 50 μL de la suspensión celular y mézclela con 50 μL de azul de tripano. Cuente las celdas vivas (las celdas que son negativas para el color azul) y calcule el número total de celdas vivas en la suspensión.</li>
	<li>Prepare un "medio de cultivo 3D" (un medio de cultivo celular suplementado con una matriz de membrana basal al 5%; consulte la Tabla de materiales). NOTA: El "medio de cultivo 3D" es similar a un líquido a temperatura ambiente. A 37 °C, la consistencia se vuelve más gelatinosa (de modo que las células permanecen juntas), aunque todavía se puede pipetear (ya que contiene solo un 5% de matriz de membrana basal).</li>
	<li>Calcular el número de células necesarias para el ensayo y el volumen total requerido; cada pocillo debe contener 2.000-8.000 células en 200 μL de medio.</li>
	<li>Prepare una suspensión celular con el número deseado de células (por ejemplo, 4.000 células) en 200 μL del "medio de cultivo 3D" y mezcle suavemente con la pipeta para asegurar una distribución homogénea.</li>
	<li>Transfiera la suspensión a un depósito de pipeteo. Con una pipeta multicanal, añadir 200 μL de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fijación ultrabaja (véase la Tabla de materiales). Antes de cada recolección de las células, mezclar bien la suspensión.</li>
	<li>Centrifugar la placa a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente para reforzar la agrupación de las células, mejorando así la agregación celular, e incubar la placa a 37 °C en una incubadora humidificada deCO2 al 5%.</li>
	<li>Cada 2-3 días, actualice el "medio de cultivo 3D". Centrifugar la placa a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente, retirar y desechar suavemente el 50% del medio (100 μL) y añadir 100 μL de "medio de cultivo 3D" fresco para reemplazar la solución existente. Repita el paso 1.11 y vuelva a colocar la placa en la incubadora humidificada de 37 °C, 5% deCO2. NOTA: La extracción del medio debe realizarse cuando la placa se mantiene a 45°, y el medio debe recogerse solo de la parte superior para evitar la recolección de las células. No se debe utilizar un sistema de aspiración al vacío. El medio fresco debe agregarse lenta y suavemente para no interrumpir los esferoides, que ya habrán comenzado a formarse.</li>
	<li>Inspeccione las células bajo un microscopio cada 1-2 días para monitorear la formación de esferoides. Mida el diámetro de los esferoides formados utilizando la herramienta "escala" en el software de imágenes (consulte la Tabla de materiales). NOTA: La inspección microscópica debe revelar primero cuerpos irregulares redondos a ovalados que asumen una forma esferoide a medida que avanza el tiempo11,12.<ol><li>Cuando el diámetro del esferoide alcance 100-200 μm, realice los experimentos de eficacia del fármaco. NOTA: Los experimentos de eficacia farmacológica se realizan cuando los esferoides alcanzan este diámetro ya que, en ese momento, la mayoría de las células están proliferando, lo que es propicio para evaluar la respuesta al tratamiento. Los esferoides de mayor diámetro contienen un núcleo necrótico y una capa quiescente11,12, lo que resulta en una menor proporción de células proliferantes que responden al tratamiento.</li>
	</ol></li>
	<li>Para la recolección de esferoides, use una pipeta de 1,000 μL para recolectar los esferoides de cada pocillo y depositarlos en un tubo cónico de 15 ml. NOTA: Los esferoides son inherentemente frágiles y requieren un manejo suave. Al transferir el medio con los esferoides al tubo cónico, sostenga el tubo a 45° y pipete lentamente en la pared del tubo. Los esferoides son visibles para el ojo.</li>
	<li>Centrifugar el tubo cónico a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente, y aspirar y desechar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta.</li>
	<li>Añadir 0,5 ml del medio de cultivo celular y resuspender el pellet bien pero suavemente. Evite hacer burbujas.</li>
	<li>Realice el conteo de esferoides siguiendo los pasos a continuación.<ol><li>Use una placa de 96 pocillos y dibuje un signo más en la parte inferior de un pozo para dividir el pozo en cuadrantes (para ayudar a rastrear el conteo).</li>
		<li>Agregue 50 μL de la suspensión al pocillo y cuente los esferoides manualmente bajo el microscopio (usando una lente de objetivo 10x).</li>
		<li>Cuente los esferoides en cada cuadrante, tenga cuidado de no contar dos veces y calcule el número total de esferoides en el pozo. NOTA: Para mayor precisión del conteo, cuente al menos 50 esferoides en un pozo. Si hay menos de 50 esferoides, mezcle suavemente la suspensión para asegurar una distribución homogénea, y cuente nuevamente usando un volumen mayor de la suspensión agregada a un nuevo pozo. Alternativamente, si hay menos de 50 esferoides en un pozo, los esferoides pueden centrifugarse y resuspenderse suavemente en un volumen de <0,5 ml. Si hay más de 100 esferoides, agregue el medio de cultivo celular a la suspensión de esferoides, mezcle suavemente y vuelva a contar.</li>
		<li>Calcule la concentración de esferoides (recuento de esferoides/volumen de recuento [μL]) y, a continuación, calcule el número total de esferoides en la suspensión (concentración de esferoides × volumen total).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Ensayo de eficacia farmacológica (ensayo MTT)
NOTA: Para más detalles, véase van Meerloo et al.13. Además, para el ensayo MTT, solo se debe usar el medio de cultivo celular y no el "medio de cultivo 3D" (agregar la matriz de membrana basal no es necesario y podría interferir potencialmente con el ensayo MTT).
<ol><li>En un tubo nuevo, preparar una suspensión esferoide a una concentración de 200 esferoides por 200 μL de medio de cultivo celular (medio de cultivo RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS, 1:100 de penicilina-estreptomicina, 1% de aminoácidos no esenciales y 1% de L-glutamina).<ol><li>Para cada tratamiento farmacológico, prepare un stock de esferoides en un tubo de 15 ml. Calcule la cantidad necesaria para cada fármaco por el número de pocillos necesarios para las repeticiones: (5-8) × 200 μL. Agregue el medicamento al tubo hasta la concentración final necesaria. NOTA: Consulte la sección de resultados representativos con respecto a los medicamentos utilizados para el presente estudio y su dosis. Además, los detalles comerciales de los medicamentos se enumeran en la Tabla de materiales.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfiera 200 μL de la suspensión esferoide a los pocillos de una placa de 96 pocillos de fijación ultrabaja e incube la placa a 37 °C en una incubadora humidificada deCO2 al 5%. No utilice las filas y columnas externas de la placa de 96 pocillos para el ensayo, ya que estos pozos se caracterizan por una mayor evaporación, lo que podría conducir a una mayor variabilidad entre los experimentos repetidos; en su lugar, agregue PBS a estos pozos. NOTA: Es clave que el cultivo de los esferoides sea homogéneo antes de que el cultivo se alifique en la placa de 96 pocillos. Además, se debe incluir una condición de control (es decir, esferoides no tratados) en cada experimento.</li>
	<li>Después de incubar los esferoides con el fármaco del estudio durante 24-72 h, centrifugar la placa a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente y retirar suavemente 170 μL del medio de cultivo celular, dejando 30 μL (que incluye los esferoides) en el fondo del pozo. NOTA: La extracción de los 170 μL de medio de cultivo celular debe hacerse con cuidado, para no eliminar los esferoides. Sostenga la placa a 45 ° y coloque una mano (con un guante oscuro para contrastar) debajo de los pocillos para que los esferoides sean visibles (puntos blancos).</li>
	<li>Prepare la solución MTT (0.714 mg/ml en RPMI libre de fenol, ver la Tabla de materiales).</li>
	<li>Agregue 70 μL de solución MTT a cada pocillo hasta un volumen final de 100 μL por pocillo (la concentración final de MTT en el pocillo será de 0.05 mg por 100 μL). Además, prepare pozos "en blanco" con solución MTT sin células. NOTA: MTT es sensible a la luz. Por lo tanto, la luz en la campana debe estar apagada y el tubo que contiene la solución MTT debe cubrirse con papel de aluminio.</li>
	<li>Incubar la placa a 37 °C en una incubadora humidificada deCO2 al 5% durante 3-4 h hasta que se observe un cambio en el color de la solución en los pocillos (el color púrpura representa células vivas).</li>
	<li>Cuando se observe un cambio, agregue 100 μL de solución de parada (0.1N HCl en isopropanol) a cada pocillo y mezcle suavemente el contenido de los pocillos sin crear burbujas.</li>
	<li>Lea la absorbancia de la placa en un lector Fluorómetro-ELISA (consulte la Tabla de materiales) a una longitud de onda de 570 nm y una longitud de onda de fondo de 630-690 nM. NOTA: Si el lector Fluorometer-ELISA disponible no puede leer la placa de 96 pocillos de accesorio ultra bajo, transfiera el contenido de cada pocillo a una placa de 96 pocillos de fondo plano correspondiente.</li>
	<li>Calcule la viabilidad celular siguiendo los pasos a continuación.<ol><li>Para cada pozo, calcule la "señal específica" ("señal específica" = la señal a 570 nm - la señal a 630-690 nm). Luego, calcule el valor promedio de los pozos "en blanco" y reste este valor de cada pozo.</li>
		<li>Calcular el promedio de las "señales específicas" en los pocillos de control que contienen células que no fueron tratadas con el fármaco del estudio ("AV-SS-unt").</li>
		<li>Calcule la viabilidad (porcentaje) de células en cada pocillo en relación con los pocillos con células no tratadas. NOTA: Viabilidad = (señal específica en cada pozo/"AV-SS-unt") × 100</li>
	</ol></li>
</ol>3. Seguimiento y análisis de los cambios morfológicos en los esferoides
NOTA: En cuanto al ensayo MTT, solo se debe usar el medio de cultivo celular y no el "medio de cultivo 3D" en esta evaluación (agregar la matriz de membrana basal no es necesario y podría interferir potencialmente con el análisis).
<ol><li>Después de contar los esferoides, diluir la suspensión en medio de cultivo celular (medio de cultivo RPMI-1640 suplementado con 10% FBS, 1:100 penicilina-estreptomicina, 1% de aminoácidos no esenciales y 1% de L-glutamina) a aproximadamente 1-2 esferoides por 20 μL.</li>
	<li>Coloque 80 μL de medio de cultivo celular en los pocillos de una placa de 96 pocillos de fijación ultra baja, y luego agregue 20 μL de la suspensión esferoide a los pocillos. NOTA: Por lo tanto, los pocillos contendrán 1-2 esferoides en un volumen de 100 μL.</li>
	<li>Revise cuidadosamente los pocillos bajo el microscopio y marque los pozos que contienen un esferoide, ya que se utilizarán para este análisis.</li>
	<li>Prepare el fármaco del estudio en una concentración que sea el doble de la concentración de interés. Agregue 100 μL de la solución del fármaco a los pocillos relevantes (la concentración total en el pozo será entonces 1x).</li>
	<li>Capture una imagen de cada pocillo en el Día 0 (antes de agregar el fármaco del estudio) y use la herramienta "escala" en el software de imágenes (consulte la Tabla de materiales) para determinar los diámetros de los esferoides.</li>
	<li>Incubar la placa a 37 °C en una incubadora humidificada deCO2 al 5%, y examinar la morfología y medir el diámetro de los esferoides (utilizando la herramienta "escala") diariamente durante 3-7 días, dependiendo de cuándo se observe el efecto del fármaco (por ejemplo, diseminación celular, vainas invasivas, destrucción de estructuras, etc.).</li>
	<li>Al final del experimento, trace los cambios en los diámetros de los esferoides (en relación con el Día 0) a lo largo del tiempo. NOTA: Cambio (porcentaje) = (diámetro del esferoide en un día específico/el diámetro de ese esferoide en el día 0) × 100</li>
</ol>

<ol><li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+tumor+models%3A+Advantages%2C+disadvantages%2C+variables%2C+and+selecting+the+right+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12(2016).</li>
<li>Yoshida, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+patient-derived+tumor+xenograft+models+and+tumor+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+%26+Oncology%22%5BJournal%5D)">Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids.</a> Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 4(2020).</li>
<li>Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+conditions+defining+glioblastoma+cells+behavior%3A+What+is+the+impact+for+novel+discoveries%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries.</a> Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).</li>
<li>Richter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+donor+to+the+lab%3A+A+fascinating+journey+of+primary+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">From donor to the lab: A fascinating journey of primary cell lines.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 711381(2021).</li>
<li>Esparza-Lopez, J., Martinez-Aguilar, J. F., Ibarra-Sanchez, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+primary+cancer+cell+cultures+for+personalized+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+de+Investigacio%CC%81n+Cli%CC%81nica%22%5BJournal%5D)">Deriving primary cancer cell cultures for personalized therapy.</a> Revista de Investigación Clínica. 71 (6), 369-380 (2019).</li>
<li>Choi, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+human+cancer+models+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">In vitro human cancer models for biomedical applications.</a> Cancers. 14 (9), 2284(2022).</li>
<li>Eglen, R. M., Randle, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+discovery+goes+three-dimensional%3A+Goodbye+to+flat+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Drug discovery goes three-dimensional: Goodbye to flat high-throughput screening.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (5), 262-265 (2015).</li>
<li>Kodack, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+patient-derived+cancer+cells+and+their+potential+for+personalized+cancer+patient+care%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Primary patient-derived cancer cells and their potential for personalized cancer patient care.</a> Cell Reports. 21 (11), 3298-3309 (2017).</li>
<li>Moskovits, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palbociclib+in+combination+with+sunitinib+exerts+a+synergistic+anti-cancer+effect+in+patient-derived+xenograft+models+of+various+human+cancers+types%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Palbociclib in combination with sunitinib exerts a synergistic anti-cancer effect in patient-derived xenograft models of various human cancers types.</a> Cancer Letters. 536, 215665(2022).</li>
<li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+and+determining+the+viability+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Counting and determining the viability of cultured cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e752(2008).</li>
<li>Brajša, K., Trzun, M., Zlatar, I., Jelić, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+cultures+as+a+new+tool+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Periodicum+Biologorum%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell cultures as a new tool in drug discovery.</a> Periodicum Biologorum. 118 (1), 59-65 (2016).</li>
<li>Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+applying+multicellular+tumor+spheroids+in+preclinical+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase.</a> Cancer Cell International. 21 (1), 152(2021).</li>
<li>van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sensitivity+assays%3A+The+MTT+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell sensitivity assays: The MTT assay.</a> Methods in Molecular Biology. 731, 237-245 (2011).</li>
<li>Walzl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+resazurin+reduction+assay+can+distinguish+cytotoxic+from+cytostatic+compounds+in+spheroid+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">The resazurin reduction assay can distinguish cytotoxic from cytostatic compounds in spheroid screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (7), 1047-1059 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El presente protocolo describe un método simple para generar cultivos celulares primarios 3D (esferoides) derivados de muestras de tumores humanos. Estos esferoides se pueden utilizar para diversos análisis, incluida la evaluación de posibles candidatos a fármacos y combinaciones de fármacos, la identificación de posibles biomarcadores u objetivos terapéuticos, y la investigación de los mecanismos de respuesta y resistencia. El protocolo utiliza células tumorales primarias derivadas directamente de muestras de pacientes ...

Los estudios in vitro e in vivo representan enfoques complementarios para desarrollar tratamientos contra el cáncer. Los modelos in vitro permiten el control de la mayoría de las variables experimentales y facilitan los análisis cuantitativos. A menudo sirven como plataformas de detección de bajo costo y también se pueden utilizar para estudios mecanicistas1. Sin embargo, su relevancia biológica es inherentemente limitada, ya que tales modelos sólo reflejan parcialmente el microambiente tumoral1. Por el contrario, los modelos in vivo, como los xenoinjertos derivados del paciente (PDX), capturan la complejidad del microambiente tumoral y son más adecuados para estudios traslacionales y tratamiento individualizado en pacientes (es decir, investigar la respuesta a fármacos en un modelo derivado de un paciente individual)1. Sin embargo, los modelos in vivo no son propicios para enfoques de alto rendimiento para el cribado de fármacos, ya que los parámetros experimentales no pueden controlarse tan estrechamente como en los modelos in vitro y porque su desarrollo requiere mucho tiempo, requiere mucha mano de obra y es costoso 1,2.
Los modelos in vitro han estado disponibles por más de 100 años, y las líneas celulares han estado disponibles por más de 70 años3. Durante las últimas décadas, sin embargo, la complejidad de los modelos in vitro disponibles de tumores sólidos ha aumentado dramáticamente. Esta complejidad abarca desde modelos de cultivo bidimensionales (2D) (estructuras monocapa) que son líneas celulares establecidas derivadas de tumores o líneas celulares primarias hasta los enfoques más recientes que involucran modelos tridimensionales (3D)1. Dentro de los modelos 2D, una distinción clave es entre las líneas celulares establecidas y primarias4. Las líneas celulares establecidas son inmortalizadas; Por lo tanto, la misma línea celular se puede utilizar globalmente durante muchos años, lo que desde una perspectiva histórica, facilita la colaboración, la acumulación de datos y el desarrollo de muchas estrategias de tratamiento. Sin embargo, las aberraciones genéticas en estas líneas celulares se acumulan con cada paso, comprometiendo así su relevancia biológica. Además, el número limitado de líneas celulares disponibles no refleja la heterogeneidad de los tumores en los pacientes 4,5. Las líneas celulares de cáncer primario se derivan directamente de muestras tumorales resecadas obtenidas mediante biopsias, derrames pleurales o resecciones. Por lo tanto, las líneas celulares de cáncer primario son biológicamente más relevantes ya que preservan elementos del microambiente tumoral y las características del tumor, como los comportamientos intercelulares (por ejemplo, la diafonía entre células sanas y cancerosas) y los fenotipos similares a los vástagos de las células cancerosas. Sin embargo, la capacidad replicativa de las líneas celulares primarias es limitada, lo que conduce a un tiempo de cultivo estrecho y limita el número de células tumorales que pueden ser utilizadas para los análisis 4,5.
Los modelos que utilizan cultivos 3D son biológicamente más relevantes que los modelos de cultivo 2D, ya que se conservan las condiciones in vivo. Por lo tanto, los modelos de cultivo 3D preservan la forma y el crecimiento natural de las células y replican elementos del entorno tumoral, como la hipoxia, la necrosis y la adhesión celular. Los modelos 3D más utilizados en la investigación del cáncer incluyen esferoides multicelulares, estructuras basadas en andamios y cultivos incrustados en matrices 4,6,7.
El presente protocolo genera modelos de cultivo tumoral 3D (esferoides multicelulares) a partir de células cancerosas primarias y evalúa su sensibilidad a los fármacos utilizando dos enfoques complementarios: un ensayo de viabilidad celular (MTT) y exámenes microscópicos. Los resultados representativos presentados en este documento son de cáncer de mama y colon; Sin embargo, este protocolo es ampliamente aplicable a otros tipos de tumores sólidos (por ejemplo, colangiocarcinoma, cáncer gástrico, de pulmón y de páncreas) y también es rentable, ya que se puede realizar en su totalidad en un laboratorio típico de investigación / biología celular del cáncer sin depender de equipos especializados. Los esferoides multicelulares generados utilizando este enfoque se pueden utilizar para evaluar posibles candidatos a fármacos, identificar posibles biomarcadores u objetivos terapéuticos e investigar los mecanismos de respuesta y resistencia.
Este protocolo se divide en tres secciones: (1) la generación, recolección y conteo de los esferoides en preparación para su uso como modelo para probar la eficacia del fármaco; (2) ensayo MTT para evaluar la eficacia del fármaco en los esferoides; y (3) la evaluación microscópica de los cambios morfológicos después del tratamiento de los esferoides con fármacos como otro enfoque para evaluar la eficacia del fármaco (Figura 1).

<table><tbody><tr><td>5 Fluorouracilo</td><td>TEVA Israel</td><td>lote 16c22NA</td><td>Fluorouracilo, Adrucil</td></tr><tr><td>Accutasa</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>StemPro Accutase Disociación</td></tr> celular <tr><td>Cisplatino</td><td>TEVA Israel</td><td>20B06LA</td><td>Abiplatin,&nbsp;</td></tr><tr><td>Cultrex&nbsp;</td><td>Trevigen</td><td>3632-010-02 Matriz de</td><td>membrana basal, tipo 3</td></tr><tr><td>DMSO (dimetilsulfóxido)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2391595</td><td></td></tr><tr><td>Flurometer&nbsp; Lector ELISA</td><td>Biotek</td><td>Synergy H1</td><td>Gen5 3.11</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico (HCl)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320331</td><td>para la solución de parada</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, EE. UU.</td> <td>&nbsp; Versión 1.52a</td><td>Software de código abierto ImageJ</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Gadot</td><td>P180008215</td><td>para solución de parada</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco 1843977</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MTT&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5655-1G</td><td>Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio</td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Palbociclib&nbsp; &nbsp;</td><td>Med Chem Express</td><td>CAS # 571190-30-2</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190094</td> solución <td>salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) * sin</td></tr> penicilina de calcio y magnesio <tr><td>&ndash; estreptomicina&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>2119399</td><td></td></tr><tr><td>Libre de fenol RPMI 1640</td><td>Industrias biológicas, Israel</td><td>01-103-1A</td><td></td></tr><tr><td>Reservorio de pipeteo</td><td>Alexred</td><td>RED LTT012025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 medio de cultivo&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11530586</td><td></td></tr><tr><td>Sunitinib</td><td>Med Chem Express</td><td>CAS # 341031-54-7</td><td></td></tr><tr><td>Trastuzumab</td><td>F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basilea, Switherland</td><td>10172154 IL</td><td>Herceptin</td></tr><tr><td>Solución de azul de tripano al 0,5%</td><td>Industrias biológicas, Israel</td><td>03-102-1B</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos de fijación ultrabaja</td><td>Greiner Bio-one</td><td>650970</td><td></td></tr><tr><td>Vinorelbine</td><td>Ebewe</td><td>11733027-03</td><td>Navelbine</td></tr></tbody></table>

establecimiento de esferoides tridimensionales a partir de muestras tumorales derivadas de pacientes y evaluación de su sensibilidad a los fármacos

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

A pesar de los notables avances en la comprensión de la biología tumoral, la gran mayoría de los candidatos a fármacos oncológicos que ingresan a los ensayos clínicos fracasan, a menudo debido a la falta de eficacia clínica. Esta alta tasa de fracaso ilumina la incapacidad de los modelos preclínicos actuales para predecir la eficacia clínica, principalmente debido a su insuficiencia para reflejar la heterogeneidad tumoral y el microambiente tumoral. Estas limitaciones se pueden abordar con modelos de cultivo tridimensionales (3D) (esferoides) establecidos a partir de muestras de tumores humanos derivados de pacientes individuales. Estos cultivos 3D representan la biología del mundo real mejor que las líneas celulares establecidas que no reflejan la heterogeneidad tumoral. Además, los cultivos 3D son mejores que los modelos de cultivo bidimensionales (2D) (estructuras monocapa), ya que replican elementos del entorno tumoral, como hipoxia, necrosis y adhesión celular, y preservan la forma y el crecimiento natural de las células. En el presente estudio, se desarrolló un método para preparar cultivos primarios de células cancerosas de pacientes individuales que son 3D y crecen en esferoides multicelulares. Las células pueden derivarse directamente de tumores de pacientes o xenoinjertos derivados de pacientes. El método es ampliamente aplicable a tumores sólidos (por ejemplo, colon, mama y pulmón) y también es rentable, ya que se puede realizar en su totalidad en un laboratorio típico de investigación / biología celular del cáncer sin depender de equipos especializados. En este documento, se presenta un protocolo para generar modelos de cultivo tumoral 3D (esferoides multicelulares) a partir de células cancerosas primarias y evaluar su sensibilidad a los medicamentos utilizando dos enfoques complementarios: un ensayo de viabilidad celular (MTT) y exámenes microscópicos. Estos esferoides multicelulares se pueden utilizar para evaluar posibles candidatos a fármacos, identificar posibles biomarcadores u objetivos terapéuticos, e investigar los mecanismos de respuesta y resistencia.

Este protocolo presenta procedimientos para generar un cultivo homogéneo de esferoides a partir de células tumorales primarias, evaluar cuantitativamente la eficacia del fármaco en el cultivo de esferoides (ensayo MTT) y determinar el efecto de los fármacos del estudio sobre la morfología del esferoide. Se presentan los datos de los experimentos representativos en esferoides generados a partir de cultivos celulares de cáncer de colon y mama. Se realizaron experimentos similares con otros tipos de tumores, incluidos el co...

El presente protocolo describe la generación de modelos de cultivo tumoral 3D a partir de células cancerosas primarias y la evaluación de su sensibilidad a los fármacos mediante ensayos de viabilidad celular y exámenes microscópicos.

Establecimiento de esferoides tridimensionales a partir de muestras tumorales derivadas de pacientes y evaluación de su sensibilidad a los fármacos

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Nuestro protocolo es significativo porque describe una generación de modelos de cultivo tumoral 3D a partir de células cancerosas primarias, y este modelo representa la biología tumoral del mundo real mejor que las líneas celulares. Este enfoque es aplicable a una variedad de tumores sólidos. También es rentable, ya que se puede realizar de principio a fin en un laboratorio típico de biología celular.Los modelos tumorales 3D generados utilizando este enfoque apoyan la investigación sobre la sensibilidad y la resistencia de los tumores a las terapias contra el cáncer o una combinación de terapias. Este enfoque genera modelos 3D a partir de células cancerosas primarias. Por lo tanto, podría identificar qué terapia es probable que sea efectiva para un determinado paciente y, por lo tanto, ayudar a personalizar su tratamiento.Demostrando el procedimiento estará Ella Itzhaki, una estudiante de doctorado de mi laboratorio. Para comenzar, tome un matraz T25 pequeño con un cultivo celular primario adherente de una sola célula y retire los medios de cultivo celular. Lave las células con PBS y agregue un mililitro de 1x Accutase durante tres minutos a 37 grados centígrados para preparar una suspensión unicelular de cultivos de células tumorales primarias adherentes de 75 a 100% de confluencia.Neutralizar la solución Accutase añadiendo cinco mililitros de medio de cultivo celular. Aspirar las células con una pipeta serológica de 10 mililitros y depositarlas en un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar el tubo a 800 g durante cinco minutos a temperatura ambiente.Retire el medio de cultivo celular y agregue ocho mililitros de medio de cultivo celular fresco sobre el pellet celular, luego mezcle suavemente. Para contar las células viables con un hemocitómetro, tome una alícuota de 50 microlitros de la suspensión celular y mézclela con 50 microlitros de azul de tripano. Luego cuente las celdas vivas y calcule el número total de celdas vivas en la suspensión.A continuación, prepare el medio de cultivo 3D. Y después de calcular el número de células necesarias para el ensayo y el volumen total requerido, prepare la suspensión celular con el número deseado de células en 200 microlitros del medio de cultivo 3D. Mezclar suavemente con la pipeta para asegurar una distribución homogénea.Transfiera la suspensión a un depósito de pipeteo y agregue 200 microlitros de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fijación ultra baja con una pipeta multicanal. Centrifugar la placa a 300 g durante 10 minutos a temperatura ambiente para reforzar la agrupación de las células, mejorando así la agregación celular, e incubar la placa a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada con dióxido de carbono al 5%. Después de centrifugar nuevamente a 300 g durante 10 minutos a temperatura ambiente, retire y deseche suavemente el 50% del medio, y agregue 100 microlitros de medio de cultivo 3D fresco para reemplazar la solución existente.Repita este paso y vuelva a colocar la placa en la incubadora humidificada de 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Inspeccione las células bajo un microscopio cada uno o dos días para controlar la formación de esferoides. Mida el diámetro de los esferoides formados utilizando la herramienta de escala en el software de imágenes.Y una vez que el diámetro del esferoide alcanza de 100 a 200 micrómetros, realice los experimentos de eficacia del medicamento. Para la recolección de esferoides, use una pipeta de 1, 000 microlitros para recolectar los esferoides de cada pocillo y depositarlos en un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar el tubo cónico a 300 g durante cinco minutos a temperatura ambiente, y aspirar y desechar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta.Agregue 0,5 mililitros del medio de cultivo celular y vuelva a suspender el pellet bien pero suavemente. Para realizar el conteo de esferoides, use una placa de 96 pocillos y dibuje un signo más en la parte inferior de un pozo para dividir el pozo en cuadrantes. Agregue 50 microlitros de la suspensión al pozo.Y con una lente de objetivo 10x, cuente los esferoides manualmente bajo el microscopio. Cuente los esferoides en cada cuadrante y calcule el número total de esferoides en el pozo. Luego calcule la concentración de esferoides duplicando el recuento de esferoides contando el volumen y calcule el número total de esferoides en la suspensión.En un tubo nuevo, prepare la suspensión esferoide a una concentración de 200 esferoides por 200 microlitros de medio de cultivo celular. Para cada tratamiento farmacológico, prepare el stock de esferoides en un tubo diferente. Calcule la cantidad total necesaria para cada medicamento por el número de pocillos necesarios para las repeticiones, y agregue el medicamento al tubo a la concentración final necesaria.Transfiera 200 microlitros de la suspensión esferoide a los pocillos de una placa de 96 pocillos de fijación ultra baja e incube la placa a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada con dióxido de carbono al 5%. Después de incubar los esferoides con el fármaco del estudio durante 24 a 72 horas, centrifugar la placa a 300 g durante cinco minutos a temperatura ambiente y retirar suavemente 170 microlitros del medio de cultivo celular, dejando 30 microlitros en el fondo del pozo. Prepare la solución MTT y agregue 70 microlitros de la solución a cada pocillo a un volumen final de 100 microlitros por pocillo.La concentración final de MTT en el pozo será de 0,05 miligramos por 100 microlitros. Además, prepare pocillos en blanco con solución MTT sin células. Incubar la placa a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5% durante tres o cuatro horas hasta que se observe un cambio en el color de la solución en los pocillos.Cuando se observe un cambio, agregue 100 microlitros de solución Stop a cada pocillo y mezcle suavemente el contenido de los pocillos sin crear burbujas. Lea la absorbancia de la placa en un lector ELISA de parámetros a una longitud de onda de 570 nanómetros y una longitud de onda de fondo de 630 a 690 nanómetros. Para calcular la viabilidad celular, calcule la señal específica para cada pozo.Luego calcule el valor promedio de los pozos en blanco y reste este valor de cada pozo. Calcular el promedio de las señales específicas en los pocillos de control que contienen células que no fueron tratadas con el fármaco del estudio. Finalmente, calcule la viabilidad de las células en cada pocillo en relación con los pocillos con células no tratadas.La formación de esferoides a partir de un cultivo primario de células de cáncer de colon a lo largo del tiempo por el número de células inicialmente sembradas se muestra aquí. A partir de esta figura, se puede ver que el número de esferoides generados depende del número de células inicialmente sembradas en cada pozo. Aquí se muestran los esferoides de las células primarias de cáncer de colon después de 10 días en cultivo con una siembra celular inicial de 2, 000 por pocillo.Tras el cultivo prolongado de los esferoides de cáncer de colon, comenzaron a unirse entre sí y formaron grupos de esferoides y estructuras similares a uvas que impidieron un cultivo homogéneo y, por lo tanto, prohibieron el uso de los esferoides en los ensayos MTT. Los efectos de palbociclib, sunitinib y su combinación en los esferoides de las células tumorales primarias, incluyendo el cáncer de colon y de mama, se muestran aquí. Se realizó un ensayo MTT en esferoides derivados de células de cáncer de colon y mama.Las señales MTT se normalizaron a valores de células tratadas con DMSO. Los valores representan las medias de cuatro a ocho réplicas. Los efectos de los diversos tratamientos sobre el crecimiento celular también se evaluaron microscópicamente en el día cero y después de tres días de tratamiento de los esferoides derivados del cáncer de colon y las células de cáncer de mama.En esta figura se presentan los efectos de trastuzumab más vinorelbina y 5 fluorouracilo más cisplatino sobre los esferoides derivados del cáncer de mama a lo largo del tiempo. El cambio en el diámetro de los esferoides en relación con el día cero por la duración del tratamiento se muestra aquí. Cada grupo de tratamiento incluyó de cuatro a seis pocillos con un esferoide en cada pozo.El cambio promedio se presenta aquí. Los esferoides son herramientas importantes para muchos estudios más allá de la respuesta al tratamiento contra el cáncer. Estos estudios abordan, por ejemplo, la administración de fármacos e incluso cuestiones básicas de biología, como las interacciones célula-célula.Es fundamental iniciar un proceso de generación de esferoides con una suspensión de una sola célula. También es fundamental utilizar placas de fijación ultra bajas con un medio que contenga un 5% de métricas básicas de membrana.

establishing-3-dimensional-spheroids-from-patient-derived-tumor

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

La invasión de los tejidos normales circundantes es una característica definitoria de los tumores malignos. Proporcionamos aquí un ensayo de microplaca simple y semiautomatizado de invasión en una biomatriz 3D natural que se ha ejemplificado con una serie de modelos de cánceres humanos avanzados.

Tumor Ensayo tridimensional (3D) esferoide Invasion

Describimos la evolución de un modelo tridimensional, basado en el esferoide en vitro que nos permite poner a prueba el estándar actual de los regímenes de terapia experimental para cabeza y cuello de células escamosas en líneas celulares, con el objetivo de evaluar la terapia susceptibilidad y resistencia en células primarias de muestras humanas en el futuro.

Terapia de prueba en un modelo de cultivo celular 3D basado en el esferoide para cabeza y cuello de células escamosas

En una amplia variedad de indicaciones de enfermedad, modelos más fisiológico relevantes están siendo programas de descubrimiento de drogas desarrollado e implementado en. El nuevo sistema del modelo aquí descrito muestra tumor cómo tridimensional de esferoides pueden ser cultivados y defendidos en un sistema de base de placa de alto rendimiento 1536-bien buscar nuevos medicamentos de Oncología.

Generación de esferoides tumorales tridimensional de alto rendimiento para la detección de drogas

Tomografía de coherencia óptica (OCT), una tecnología de imagen tridimensional, fue utilizada para monitorear y caracterizar la cinética de crecimiento de esferoides multicelulares tumor. Cuantificación volumétrica precisa de esferoides tumorales usando un voxel contando el enfoque y la detección de tejido libre de etiqueta muerto en esferoides basado en contraste intrínseco atenuación óptica, fueron demostrados.

Longitudinal control morfológico y fisiológico de esferoides tumorales tridimensional mediante tomografía de coherencia óptica

Este protocolo describe la generación de esferoides derivados del paciente, y el análisis posterior, incluyendo la cuantificación de la proliferación, las pruebas de citotoxicidad, la citometría de flujo, la tinción de inmunofluorescencia y la toma de imágenes confocales, con el fin de evaluar la droga potencial de los candidatos como terapias antineoplásicas. Este protocolo apoya la medicina de precisión con la identificación de medicamentos específicos para cada paciente y etapa de la...

Paisidio Paciente Derivado Esferoides 3D para la detección de drogas antineoplásicas para apuntar a las células madre del cáncer

Aquí, presentamos varios métodos simples para evaluar la viabilidad y la muerte en esferoides de células cancerosas 3D, que imitan los gradientes fisicoquímicos de los tumores in vivo mucho mejor que el cultivo 2D. El modelo esferoide, por lo tanto, permite evaluar la eficacia del fármaco oncológico con una mejor traducción a condiciones in vivo.

Evaluación de la viabilidad celular y la muerte en cultivos esferoides 3D de células cancerosas

Aquí, describimos un ensayo de invasión fácil de usar para el glioblastoma. Este ensayo es adecuado para células similares al glioblastoma similares a un tallo. También se describe una macro de Fiji para cuantificar fácilmente la invasión, la migración y la proliferación.

Un modelo de esferoides 3D para Glioblastoma

Este artículo demuestra un método estandarizado para construir esferoides tumorales tridimensionales. También se describe una estrategia para la observación de esferoides y el análisis de aprendizaje profundo basado en imágenes utilizando un sistema automatizado de imágenes.

Generación de esferoides tumorales 3D para estudios de evaluación de fármacos

Aquí, presentamos un método para identificar compuestos que modulan el mecanismo ADCC, un importante mecanismo de destrucción de células cancerosas de anticuerpos antitumorales. El efecto citotóxico de las células NK se mide en esferoides de células de cáncer de mama en presencia de trastuzumab. El análisis de imágenes identifica células asesinas y diana vivas y muertas en esferoides.

Cuantificación de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos en un modelo de esferoide tumoral: aplicación para el descubrimiento de fármacos

Aquí, establecemos una plataforma de perfiles metabólicos que integra esferoides de glioma tridimensionales (3D) y normalización basada en imágenes a través del análisis de flujo extracelular. Este enfoque permite una evaluación más precisa de las respuestas metabólicas de los tumores a los tratamientos farmacológicos y proporciona información sobre los posibles mecanismos de resistencia.

Avances en el perfil metabólico de esferoides tumorales cerebrales tridimensionales para la detección de fármacos

Aprenda a generar esferoides tridimensionales a partir de células cancerosas primarias para evaluar la sensibilidad tumoral a fármacos anticancerígenos. Este método económico permite personalizar tratamientos oncológicos.

Establecimiento de esferoides tridimensionales a partir de muestras tumorales derivadas de pacientes y evaluación de su sensibilidad a los fármacos (Video) | JoVE Journal

Establecimiento de esferoides tridimensionales a partir de muestras tumorales derivadas de pacientes y evaluación de su sensibilidad a los fármacos

Explorar más videos