Name: Aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea a partir de ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Aprende a aislar y cultivar macrófagos derivados de médula ósea de ratones. Este método produce aproximadamente 2 x 10^7 células viables y no estimuladas para investigación en biología celular, inmunología y parasitología.

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Este trabajo contó con el apoyo de la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), a través de la Red de Pesquisa em Doenças Infecciosas Humanas e Animais do Estado de Minas Gerais (RED-00313-16) y la Red Minera de Engenharia de Tecidos e Terapia Celular - REMETTEC (RED-00570-16), y el Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq) de Brasil.

Este protocolo se llevó a cabo de acuerdo con el Consejo Nacional para el Control de la Experimentación Animal (Concea) y con la aprobación del Comité de Ética y Uso de Animales (CEUA). Se compraron ratones C57BL/6 en Biotério Central de la Universidad Federal de Minas Gerais (UFMG), Belo Horizonte, Brasil. Se debe utilizar equipo de protección personal (EPP), como batas de laboratorio, guantes y protección ocular, en todos los pasos descritos en este protocolo.
1. Preparación del sobrenadante del linaje de fibroblastos L-929 como fuente de M-CSF
<ol><li>Descongele las células del linaje de fibroblastos L-929 (American Type Culture Collection Certified Cell Line-ATCC CCL1) e inicie el proceso de cultivo inmediatamente para preservar la viabilidad.</li>
	<li>En una cabina de bioseguridad de flujo laminar, utilizando una pipeta de 1.000 μL, transfiera las células del linaje de fibroblastos L-929 del vial a un tubo de centrífuga estéril de 50 mL.</li>
	<li>Utilice una pipeta serológica para añadir 50 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS), libre de calcio y magnesio.</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g, 4 °C durante 10 min. Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Vuelva a suspender el pellet en 20 mL de Eagle's medium-F12 modificado de Dulbecco suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1 mL de penicilina/estreptomicina (P/S) (DMEM/F12-10) utilizando una pipeta serológica.</li>
	<li>Transfiera las células resuspendidas a un matraz de cultivo celular T75.</li>
	<li>Incubar en una incubadora a 37 °C, 5% de CO2 hasta la confluencia completa. NOTA: Al manipular el matraz, tenga cuidado de evitar mojar la tapa con solución, ya que esto puede ser una fuente de contaminación. Para obtener una cantidad conveniente de sobrenadante, es necesario replicar las células después de que cubran toda la superficie del matraz de cultivo celular. Las células L-929 se inhiben por contacto. Calentar la solución de tripsina/ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), DMEM/F12-10, y PBS estéril a 37 °C para iniciar la expansión del cultivo celular, como se describe en los siguientes pasos.</li>
	<li>Una vez alcanzada la confluencia completa, desechar el sobrenadante del matraz de cultivo celular, dentro de la cabina de bioseguridad de flujo laminar.</li>
	<li>Lave el matraz de cultivo celular con 20 mL de PBS estéril utilizando una pipeta serológica y deseche la solución.</li>
	<li>Añadir 10 mL de tripsina/EDTA (solución al 0,05%) al matraz de cultivo celular que contiene las células adheridas.</li>
	<li>Transfiera el matraz de cultivo celular de flujo laminar a una incubadora de CO2 al 5% de 37 °C e incube durante 3 min.</li>
	<li>Agite el matraz de cultivo celular para disociar las células de la superficie del matraz de cultivo y utilice un microscopio para asegurarse de que todas las células se han disociado.</li>
	<li>Inactivar la tripsina/EDTA (solución al 0,05%) con 10 mL de medio DMEM/F12-10.</li>
	<li>Transfiera la solución con una pipeta serológica a un tubo de centrífuga estéril de 50 mL.</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g a 4 °C durante 10 min. Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Vuelva a suspender el pellet en 10 mL de medio DMEM/F12-10.</li>
	<li>Añadir 1 mL de la suspensión celular a un matraz de cultivo celular T175 (cultivo 1:10).</li>
	<li>Repita el procedimiento para obtener diez matraces de cultivo celular T175.</li>
	<li>Añadir 50 mL de DMEM/F12-10 a cada matraz de cultivo celular.</li>
	<li>Incubar en una incubadora a 37 °C, 5% de CO2 hasta la confluencia completa. NOTA: Estos pasos garantizan 500 mL de sobrenadante celular L-929. El día 5, después de que las células hayan cubierto la superficie del matraz de cultivo celular T175, el sobrenadante se enriquecerá para M-CSF y debe recogerse14.</li>
	<li>Retire el matraz de cultivo celular de la incubadora el día 5 después de la inhibición por contacto.</li>
	<li>Transfiera el medio a un tubo de centrífuga estéril de 50 ml.</li>
	<li>Centrifugar a 3.200 x g, a 4 °C durante 10 min.</li>
	<li>Recoja el sobrenadante enriquecido con M-CSF y transfiera la solución a un tubo de centrífuga estéril de 50 mL. Conservar en el congelador a -20 °C. NOTA: La centrifugación es extremadamente importante para eliminar las células y los desechos de los sobrenadantes.</li>
	<li>El sobrenadante L-929 es una fuente conveniente y económica de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) y generalmente contiene de 5 a 10 ng/mL de M-CSF8. Estos sobrenadantes también contienen trazas de otras citocinas y factores de crecimiento, pero no ejercen una influencia profunda en la fisiología de los macrófagos15. Sin embargo, el M-CSF purificado puede comprarse y utilizarse como alternativa a los sobrenadantes L-929 en concentraciones de 1 a 2 ng/mL8.</li>
</ol>2. Extirpación del fémur y la tibia
<ol><li>Proceder a la eutanasia de ratón macho C57BL-6 de 8 semanas de edad por luxación cervical después de asfixia por dióxido de carbono, de acuerdo con la resolución normativa número 18 del Consejo Nacional de Experimentación Animal (Concea) y con la aprobación del Comité de Ética y Uso de Animales (CEUA).</li>
	<li>Remoje el ratón con una solución de etanol al 70% y use tijeras estériles para hacer una incisión de 1 cm a lo largo del abdomen.</li>
	<li>Retire la piel hasta que el músculo de las patas traseras esté completamente expuesto.</li>
	<li>Retire las patas traseras a la altura de la cadera, teniendo cuidado de no romperse el fémur y la tibia.</li>
	<li>Coloque las patas traseras en un tubo centrífugo cónico con una solución de etanol al 70%. NOTA: Utilice siempre ratones libres de patógenos. Asegúrate de recoger ambas patas para lograr un mayor número de células. El paso 2 se realiza en un entorno no estéril (mesa de trabajo). Por lo tanto, es importante extirpar el fémur y la tibia con cuidado para que permanezcan intactos y evitar la contaminación bacteriana. Los pasos restantes de este procedimiento se llevan a cabo en una cabina de bioseguridad de flujo laminar. El tiempo de exposición de las patas a una solución de etanol al 70% debe limitarse a 10 minutos. Si el tiempo es más largo, los progenitores de la médula ósea pueden verse afectados.</li>
</ol>3. Obtener progenitores de médula ósea a partir de la luz de la tibia y el fémur
<ol><li>Retire las patas de la solución de etanol al 70% y transfiéralas a PBS estéril.</li>
	<li>Usar fórceps y toallitas desinfectantes para eliminar todo el músculo y la fascia. El hueso debe estar limpio después de este paso.</li>
	<li>Use una hoja de bisturí quirúrgico estéril para cortar la epífisis ósea en ambos extremos para exponer la médula ósea.</li>
	<li>Llene una jeringa de 20 ml con 10 ml de PBS estéril suplementado con una solución de penicilina/estreptomicina al 2% y conecte una aguja de 26 g.</li>
	<li>Sostenga el hueso con pinzas de disección anatómica con una mano y use la otra para insertar la aguja en la cavidad ósea. Tenga cuidado de no aplastar el hueso con las pinzas.</li>
	<li>Lave el interior del hueso con el PBS y recoja la médula ósea en un tubo centrífugo cónico estéril. Después de este paso, la cavidad ósea debe aparecer blanca.</li>
	<li>Centrifugar las células recogidas durante 10 min a 300 x g a 4 °C.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 1 mL de DMEM/F12-10.</li>
	<li>Homogeneizar y añadir otros 9 mL de medio DMEM/F12-10 para llevar las células hasta un total de 10 mL.</li>
</ol>4. Cultivo de macrófagos
<ol><li>Añadir 1 mL de progenitores celulares a cada una de las placas de Petri redondas de plástico de 100 mm x 20 mm (un total de 10 placas), distribuyendo las células a través de las placas con una pipeta para obtener una distribución uniforme. No utilice platos tratados con cultivo de tejidos.</li>
	<li>Añadir 9 mL de DMEM/F12-10 suplementado con un 20% del sobrenadante celular L-929 a cada placa.</li>
	<li>Incubar en una incubadora a 37 °C, 5% de CO2 .</li>
	<li>Al3º día, añadir 10 mL de medio DMEM/F12-10 suplementado con un 20% del sobrenadante de células L-929 a cada placa. De esta manera, las placas de cultivo tienen ahora un total de 20 mL de medio de cultivo, suficiente para el crecimiento de las células hasta el final de su maduración. NOTAS: No se deben utilizar placas tratadas con cultivo de tejidos porque los macrófagos, como células adherentes naturales marcadas por fuertes interacciones con las superficies, no se disociarán fácilmente de la placa más tarde. Por lo general, los progenitores celulares de un ratón (dos fémures) se pueden sembrar en 10 placas de cultivo. Los progenitores celulares se transformarán en macrófagos, que se pueden utilizar desde el día 7 hasta el 10 de incubación. La confirmación de la maduración se identifica por cambios en la morfología de los macrófagos. Los macrófagos maduros son adherentes y muestran una morfología heterogénea, explicada por la emisión de seudópodos en diferentes direcciones. Ejemplos de estas células maduras se muestran en los resultados representativos.</li>
</ol>5. Recolección de macrófagos
<ol><li>Deseche los sobrenadantes de todos los platos de cultivo.</li>
	<li>Lave cada placa de cultivo con 10 mL de PBS estéril tibio (37 °C) sin Mg2+ y Ca2+ .</li>
	<li>Deseche la solución de cada plato.</li>
	<li>Precalentar la solución de disociación celular no enzimática a 37 °C y añadir 3 mL a cada plato. Incubar durante 10 min en una incubadora a 37 °C con 5% deCO2 y 37 °C. Utilice un microscopio invertido para visualizar si los macrófagos se están disociando de las placas de cultivo. NOTA: El uso de placas de plástico tratadas sin cultivo de tejidos debería permitir la fácil disociación de las células y evitar la necesidad de raspar las células de la placa.</li>
	<li>Lavar los platos con una pipeta serológica con la solución de disociación celular no enzimática una y otra vez, realizando movimientos circulares para confirmar que todos los macrófagos están disociados del plato.</li>
	<li>Recoja la solución de todas las placas de cultivo juntas en un tubo centrífugo cónico de 50 mL.</li>
	<li>Añada 10 ml de PBS estéril precalentado a las placas de cultivo vacías y proceda como se indica en el paso 5.4. Este procedimiento es una repetición del paso 5.4 y pretende garantizar que se recojan todos los macrófagos.</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g, 4 °C durante 10 min.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet con 1 mL de DMEM/F12-10. Homogeneizar lenta y cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo con la pipeta para evitar dañar las células.</li>
	<li>Prepare una alícuota de 10 μL de solución de macrófagos diluida con 10 μL de Azul de Tripán para contar las células usando el hemocitómetro. NOTA: En el día 7, cada plato producirá aproximadamente 2 x 106 macrófagos. Esto significa que un ratón puede producir aproximadamente 2 x 107 macrófagos primarios cuando se cosecha en diez placas. Dado que el M-CSF solo impulsa la maduración de los macrófagos, el procedimiento garantiza una población de células que son esencialmente solo macrófagos y libres de otros leucocitos contaminantes.</li>
</ol>

<ol><li>Gomez Perdiguero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophages+originate+from+yolk-sac-derived+erythro-myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors.</a> Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).</li>
<li>van Furth, R., Cohn, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+kinetics+of+mononuclear+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">The origin and kinetics of mononuclear phagocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 128 (3), 415-435 (1968).</li>
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<li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+physiological+roles+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Origin and physiological roles of inflammation.</a> Nature. 454 (7203), 428-435 (2008).</li>
<li>Shapouri-Moghaddam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity%2C+polarization%2C+and+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity, polarization, and function in health and disease.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6425-6440 (2018).</li>
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<li>Jin, X., Kruth, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+macrophage+colony-stimulating+factor+differentiated+human+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Culture of macrophage colony-stimulating factor differentiated human monocyte-derived macrophages.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e54244(2016).</li>
<li>Gonçalves, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+characterization+of+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The isolation and characterization of murine macrophages.</a> Current Protocols in Immunology. 111 (1), 1-16 (2015).</li>
<li>Varol, C., Mildner, A., Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%3A+development+and+tissue+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophages: development and tissue specialization.</a> Annual Review of Immunology. 33, 643-675 (2015).</li>
<li>Andrés, V., Pello, O. M., Silvestre-Roig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+proliferation+and+apoptosis+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Lipidology%22%5BJournal%5D)">Macrophage proliferation and apoptosis in atherosclerosis.</a> Current Opinion in Lipidology. 23 (5), 429-438 (2012).</li>
<li>Pineda-Torra, I., Gage, M., de Juan, A., Pello, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+polarization+of+murine+bone+marrow-derived+and+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and polarization of murine bone marrow-derived and peritoneal macrophages.</a> Methods in Molecular Biology. 1339, 101-109 (2015).</li>
<li>Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+functional+characterization+of+three+activated+macrophage+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations.</a> Journal of Leukocyte Biology. 80 (6), 1298-1307 (2006).</li>
<li>Hamczyk, M. R., Villa-Bellosta, R., Andrés, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+macrophage+phagocytosis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro macrophage phagocytosis assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1339, 235-246 (2015).</li>
<li>Hosoe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+tumoricidal+macrophages+from+bone+marrow+cells+of+normal+mice+or+mice+bearing+a+colony-stimulating-factor-producing+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Induction of tumoricidal macrophages from bone marrow cells of normal mice or mice bearing a colony-stimulating-factor-producing tumor.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 28 (2), 116-122 (1989).</li>
<li>Rice, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rM-CSF+efficiently+replaces+L929+in+generating+mouse+and+rat+bone+marrow-derived+macrophages+for+in+vitro+functional+studies+of+immunity+to+intracellular+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">rM-CSF efficiently replaces L929 in generating mouse and rat bone marrow-derived macrophages for in vitro functional studies of immunity to intracellular bacteria.</a> Journal of Immunological Methods. 477, 112693(2020).</li>
<li>Boltz-Nitulescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+rat+bone+marrow+cells+into+macrophages+under+the+influence+of+mouse+L929+cell+supernatant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant.</a> Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).</li>
<li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+macrophages+%28BMM%29%3A+isolation+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived macrophages (BMM): isolation and applications.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (12), (2008).</li>
<li>Austin, P. E., Mcculloch, E. A., Till, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+factor+in+L-cell+conditioned+medium+capable+of+stimulating+colony+formation+by+mouse+marrow+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture.</a> Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).</li>
<li>Stanley, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+colony-stimulating+factor+%28CSF-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophage colony-stimulating factor (CSF-1).</a> Encyclopedia of Immunology. 116 (1983), 1650-1654 (1998).</li>
<li>Bou Ghosn, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+physically%2C+functionally%2C+and+developmentally+distinct+peritoneal+macrophage+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Two physically, functionally, and developmentally distinct peritoneal macrophage subsets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (6), 2568-2573 (2010).</li>
<li>Ray, A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+peritoneal+cavity+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse peritoneal cavity cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (35), e1488(2010).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

La producción de una población de macrófagos derivados de la médula ósea es un paso básico en muchos modelos experimentales de biología celular, especialmente cuando es importante lograr una población homogénea de células primarias. Como se mencionó, los progenitores celulares solo pueden transformarse en macrófagos en presencia de M-CSF. Los sobrenadantes celulares L-929 se pueden utilizar como fuente principal de M-CSF. Aparte del costo, no hay problema con el uso de M-CSF recombinante en sí mismo</su...

Los monocitos y macrófagos son fagocitos mononucleares que pueden derivarse de progenitores en la médula ósea. Estudios recientes han reportado que los macrófagos también se originan a partir de progenitores eritromieloides derivados del saco vitelino1. Independientemente de su derivación, estos leucocitos tienen importantes funciones efectoras en la homeostasis y la inflamación 2,3. Los monocitos son células de sangre periférica que pueden diferenciarse en macrófagos en el tejido 2,4, mientras que los macrófagos son células heterogéneas que exhiben fenotipos y funciones reguladas por la exposición local a factores de crecimiento y citocinas5. Dado que los macrófagos muestran tal diversidad funcional, se han estudiado en muchos modelos de enfermedades. Así, el cultivo in vitro de macrófagos se ha convertido en una herramienta importante para comprender su fisiología y su papel en diferentes enfermedades. La médula ósea es una fuente importante de células progenitoras, incluidos los progenitores de macrófagos, que pueden aislarse y multiplicarse, aumentando exponencialmente el número de macrófagos obtenidos. Además, los macrófagos derivados de la médula ósea son especialmente importantes para evitar los efectos generados por el microambiente tisular, ya que los macrófagos cambian su fenotipo en respuesta a diferentes estímulos en los tejidos 6,7. Los progenitores de la médula ósea se transforman en macrófagos tras la exposición al factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF)8. Los macrófagos derivados de la médula ósea no se pueden distinguir de los macrófagos derivados de monocitos mediante marcadores bioquímicos en los tejidos. Estas células representan una población muy homogénea de células primarias, que en muchos otros aspectos son comparables a los macrófagos peritoneales 6,9.
Debido a su conjunto heterogéneo de funciones celulares, los macrófagos han sido estudiados minuciosamente por los investigadores. Estas células pueden ser utilizadas en diferentes modelos experimentales, incluyendo enfermedades infecciosas e inflamatorias, ya que están presentes en estos procesos10,11. También pueden ser útiles para investigar la polarización de los macrófagos en respuesta a diversos estímulos microambientales12,13. Por lo tanto, aquí se proporciona un protocolo simple y confiable con el fin de obtener un alto número de macrófagos primarios de la médula ósea del ratón.

<table><tbody><tr><td>Jeringa de 20 cc</td><td>DESCARPACK</td><td>SI100S4G</td><td>Jeringa estéril</td></tr><tr><td>Agujas de 26 G</td><td>BD</td><td>497AQDKT7</td><td>Agujas estériles Tubo</td></tr> de <tr><td>centrífuga cónico de 50 ml</td><td>SARSTEDT</td><td>62547254</td><td>Tubos cónicos de plástico aptos para la centrifugación Solución de</td></tr><tr><td>etanol al 70%</td><td>EMFAL</td><td>490</td><td>Solución de etanol para esterilización</td></tr><tr><td>Disección anatómica pinza</td><td>3B SCIENTIFIC</td><td>W1670</td><td>Mantener en vaso de precipitados estéril que contiene una solución de etanol al 70%</td></tr><tr><td>C57Bl/6 ratón de tipo salvaje</td><td>Comprado en Biot&eacute; rio Central de la Universidad Federal de Minas Gerais</td><td>No aplicable</td><td>Los ratones deben estar libres de patógenos específicos, con una edad comprendida entre las 6 y las 10 semanas. Los ratones deben acomodarse al menos una semana antes para recuperarse del estrés del transporte</td></tr><tr><td>Matraz de cultivo celular T175</td><td>GREINER</td><td>C7481-50EA</td><td>Matraz T-175, cuello inclinado, superficie 75 cm2, con tapón filtrante, sin DNasa, sin RNasa</td></tr><tr><td>Matraz de cultivo celular T75</td><td>GREINER</td><td>C7231-120EA</td><td>Matraz T-75, cuello inclinado, superficie 75 cm2, con tapón filtrante, sin DNasa, </td></tr>¿<tr><td>Desinfectante o toallitas húmedas para bebés sin RNASA?</td><td>CLOROX</td><td>No aplicable</td><td>Ayuda a limpiar el hueso</td></tr><tr><td>Agua destilada</td><td>GIBCO</td><td>15230</td><td>Agua destilada estéril</td></tr><tr><td>DMEM/F12-10</td><td>No aplicable</td><td>No aplicable Añadir</td><td>10 mL de Suero Fetal Bovino (FBS) y 1 mL de Penicilina/Estreptomicina (P/S) al DMEM/F12 (q.s.p. 100 mL)</td></tr><tr><td>DMEM/F12-10 + sobrenadante de células L-929</td><td>No aplicable</td><td>No aplicable</td><td>Añadir 20% de sobrenadante de cultivo de células L929 en DMEM/F-12-10</td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Eagle&prime modificado; s Medio - F12 (DMEM/F12)</td><td>GIBCO</td><td>12500096</td><td>DMEM: F-12 Medium contiene 2,5 mM de L-glutamina, 15 mM de HEPES, 0,5 mM de piruvato de sodio y 1200 mg/L de bicarbonato de sodio. Vuelva a suspender el polvo a 1 litro de agua destilada y agregue 3,7 g de bicarbonato de sodio. Ajuste el pH a 7,2 y filtre con 0,22 &micro;M. Almacenamiento a 2 - 8 &deg; C congelador</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, certificado, inactivado por calor, Estados Unidos (FBS)</td>Enriquecimiento de <td>10082147</td> <td>GIBCO</td> para el hemocitómetro <td>DMM-F12</td></tr><tr><td></td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>Z359629</td><td>Se utiliza para contar macrófagos al microscopio</td></tr><tr><td>Células L-929</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>ATCC # CCL-1</td><td>L-929 es un linaje de células de fibroblastos de ratón utilizadas como fuente de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF)</td></tr><tr><td>Nikon TI eclipse&nbsp;</td><td>NIKON&nbsp;</td><td>No aplicable</td><td>Nikon TI Eclipse es un microscopio de fluorescencia y contraste de fase</td></tr><tr><td>Solución de disociación celular no enzimática</td><td>CELLSTRIPER (CORNING)</td><td>25-056-CI</td><td>Solución de disociación celular no enzimática Elimine los macrófagos de la placa sin dañarlos</td></tr><tr><td>Placas de cultivo redondas no tratadas 100 &times; 20&ndash; mm</td><td>CORNING</td><td>CLS430591</td><td>No utilice placas de Petri tratadas con cultivo de tejidos ni ninguna placa tratada con cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>P3199 Penicilina G Sal de potasio</td><td>USBIOLOGICAL</td><td>113-98-4</td><td>Antibióticos</td></tr><tr>Solución <td></td><td></td> de<td>penicilina y estreptomicina (P/S)</td><td>Utilice 0,26 gramos de penicilina y 0,40 gramos de estreptomicina. Mezclar con 40 mL de PBS estéril. Dentro de una cabina de flujo laminar horizontal, utilice un 0,22 &micro; M filtrar y almacenar alícuotas de 1,0 mL en tubos de microfuga de 1,5 ml en el congelador (-20&deg; C)</td></tr> <tr><td>Solución salina tamponada con fosfato libre de calcio y magnesio (PBS)</td><td>MEDIATECH</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>S7975 Sulfato de estreptomicina estéril, 650-850U/mg</td><td>USBIOLOGICAL</td><td>3810-74-0</td><td>Antibióticos Pipetas</td></tr><tr><td>serológicas de 10 ml o 25 ml</td><td>SARSTEDT</td><td>861254001</td><td>pipetas serológicas se utilizan volúmenes superiores a 1 mL</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>144-55-8 Corrección de</td><td>pH para el software DMEM-F12</td></tr><tr><td>Nis Elements Viewer</td><td>NIKON</td><td>No aplicable</td><td>NIS-Elements Viewer es un programa independiente gratuito para ver archivos de imagen y conjuntos de datos</td></tr><tr><td>PBS estéril y solución al 2% de P/S</td><td>LABORCRIN</td><td>590338</td><td>Agregue 1 mL de P/S en 40 mL de PBS estéril</td></tr><tr><td>Tijeras de iris recto</td><td>KATENA</td><td>No aplicable</td><td>Mantener en vaso de precipitados estéril que contiene una solución de etanol al 70%</td></tr><tr><td>Supernadante de células L-929</td><td>No aplicable</td><td>No aplicable</td><td>L-929 es un linaje de células de fibroblastos de ratón utilizado como fuente de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF). El sobrenadante L-929 se obtuvo del protocolo</td></tr><tr><td>Hoja de bisturí quirúrgico No.24 Acero inoxidable</td><td>SWANN-MORTON</td><td>311</td><td>Se utiliza para exponer la epífisis de los huesos Solución de azul de</td></tr><tr><td>tripano, 0,4%</td><td>GIBCO</td><td>15250061</td><td>La solución de azul de tripano, 0,4%, se utiliza de forma rutinaria como tinción celular para evaluar la viabilidad celular mediante la prueba de exclusión de colorante</td></tr><tr><td>Solución de tripsina/EDTA 0,05%</td><td>GIBCO</td><td>25300-062</td><td>Se utiliza para disociar células de la botella de cultivo</td></tr><tr><td>Agua para inyección (WFI) para cultivo celular</td><td>GIBCO</td><td>A12873</td><td>Agua estéril y libre de endotoxinas</td></tr></tbody></table>

aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea a partir de ratones

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

Los macrófagos tienen importantes funciones efectoras en la homeostasis y la inflamación. Estas células están presentes en todos los tejidos del cuerpo y tienen la importante capacidad de cambiar su perfil de acuerdo con los estímulos presentes en el microambiente. Las citocinas pueden afectar profundamente a la fisiología de los macrófagos, especialmente al IFN-γ y a la interleucina 4, generando tipos M1 y M2 respectivamente. Debido a la versatilidad de estas células, la producción de una población de macrófagos derivados de la médula ósea puede ser un paso básico en muchos modelos experimentales de biología celular. El objetivo de este protocolo es ayudar a los investigadores en el aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de progenitores de médula ósea. Los progenitores de médula ósea de ratones C57BL/6 libres de patógenos se transforman en macrófagos tras la exposición al factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) que, en este protocolo, se obtiene del sobrenadante del linaje de fibroblastos murinos L-929. Después de la incubación, los macrófagos maduros están disponibles para su uso del7º al 10º día. Un solo animal puede ser la fuente de aproximadamente 2 x 107 macrófagos. Por lo tanto, es un protocolo ideal para la obtención de grandes cantidades de macrófagos primarios utilizando métodos básicos de cultivo celular.

Los macrófagos son células grandes y adherentes con características fisiológicas especiales. Muestran una diversidad de presentaciones morfológicas en cultivo debido a la capacidad de adherirse al vidrio y al plástico, y su morfología típica de dispersión está relacionada con la emisión de extensiones citoplasmáticas (Figura 1). Una vez que los progenitores de la médula ósea se exponen al M-CSF del sobrenadante celular L-929 y comienzan la transformación en macrófagos maduros, se adhieren a ...

El presente protocolo describe el aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea de ratones.

Aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea a partir de ratones

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...

Este protocolo tiene como objetivo obtener altas cantidades de macrófagos no estimulados que se han derivado de la médula ósea y que nunca han estado expuestos a factores tisulares o citoquinas. La principal ventaja de esta técnica es el número de células adquiridas de un solo animal. Con el procedimiento correcto, se puede obtener aproximadamente 2 veces 10 elevado a 7 macrófagos.Este método podría ayudar a los investigadores de diferentes áreas que estudian los macrófagos, como la biología celular, la patología, la inmunología y la parasitología, ya que debido a que las células siempre son susceptibles a la contaminación, es necesario tener cuidado con todos los pasos estériles y utilizar una cabina de bioseguridad de flujo laminar para mantener la viabilidad celular. La demostradora del procedimiento estará a cargo de Izabela Aparecida de Souza. Un estudiante de maestría de nuestro laboratorio.Para comenzar el procedimiento en el ratón macho de tipo salvaje C57BL/6 de ocho semanas de edad debidamente sacrificado, empape el ratón con una solución de etanol al 70%. Con unas tijeras estériles, haga una incisión de un centímetro a lo largo del abdomen y retire la piel hasta que el m

isolation-and-culture-of-bone-marrow-derived-macrophages-from-mice

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Los macrófagos juegan un papel central en la homeostasis y la patología en muchos tejidos. El protocolo presentado aquí se describen métodos para agotar los...

El agotamiento y la reconstitución de los macrófagos en ratones

En este video, demostramos el aislamiento y cultivo de células estromales de médula ósea a partir de huesos largos de ratones. Las BMSC adherentes aisladas se pueden utilizar para un análisis posterior.

Aislamiento y cultivo de células estromales de médula ósea de una tibia de ratón

En este video, demostramos la activación de macrófagos derivados de la médula ósea en respuesta al lipopolisacárido bacteriano y la inmunoglobulina intravenosa.

Activación de macrófagos derivados de la médula ósea de ratón en respuesta a anticuerpos

El artículo describe una adaptación fácil...

Investigación de la polarización de macrófagos utilizando la médula ósea macrófagos derivados

Los macrófagos han sido reconocidos como un componente crítico de la respuesta inmune innata y adaptativa. La reciente explosión de conocimientos relativos a los aspectos evolutivos, genéticos y bioquímicos de la interacción entre los macrófagos y los microbios ha renovado la atención científica a los macrófagos. Este artículo describe un método para diferenciar los macrófagos de médula ósea de ratón.

Médula ósea derivada de macrófagos Producción

Aquí presentamos un protocolo que genera grandes cantidades de monocitos murinos a partir de médula ósea heterogénea para aplicaciones traslacionales. En comparación con otros, este nuevo método ayuda a reducir el número de animales sacrificados y reduce los costos al evitar métodos costosos como la separación de células magnéticas (MACS) de alto gradiente.

Aislamiento y la inyección intravenosa de murino médula ósea derivados monocitos

La reprogramación metabólica es una característica y un requisito previo para la polarización de los macrófagos M1 y M2. Este manuscrito describe un ensayo para la medición de los parámetros fundamentales de la glucólisis y la función mitocondrial en macrófagos derivados de la médula ósea de ratón. Esta herramienta se puede aplicar para investigar cómo factores particulares afectan el metabolismo y el fenotipo del macrófago.

Caracterización metabólica de polarizado M1 y macrófagos derivados de Médula ósea M2 Uso del análisis extracelular Flux en tiempo real

Este protocolo se ha establecido para cultivar macrófagos murinos primarios deficientes en tetrahidrobiopterina (BH4) y óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) para estudiar la biología del NO-redox. El estudio se centra en reducir la contaminación potencial de BH4 y otros artefactos encontrados en los métodos tradicionales de aislamiento y cultivo que pueden confundir los resultados experimentales y la interpretación de los resultados.

Aislamiento y cultivo in vitro de macrófagos derivados de la médula ósea para el estudio de la biología NO-redox

Presentamos un protocolo de dos pasos para el aislamiento de mitocondrias de alta calidad que es compatible con el descubrimiento y cuantificación de proteínas a escala de proteoma. Nuestro protocolo no requiere ingeniería genética y, por lo tanto, es adecuado para estudiar las mitocondrias de cualquier célula y tejido primario.

Aislamiento de dos pasos sin etiquetas de las mitocondrias para mejorar el descubrimiento y la cuantificación de proteínas

Este protocolo describe un método sencillo y no enzimático para aislar células de médula ósea de ratón neonatal de 7-9 días de edad y generar macrófagos diferenciados utilizando un sobrenadante de células L929 como fuente de factor estimulante de colonias de granulocitos (M-CSF). Los macrófagos derivados de la médula ósea se analizaron más a fondo para determinar los antígenos de superficie F4/80, CD206, CD11b y la competencia funcional.

Aislamiento de médula ósea de ratón neonatal y preparación de macrófagos derivados de la médula ósea

Aprende a aislar y cultivar macrófagos derivados de médula ósea de ratones. Este método produce aproximadamente 2 x 10^7 células viables y no estimuladas para investigación en biología celular, inmunología y parasitología.

Aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea a partir de ratones

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