Aislamiento, activación y expansión de células T basadas en flotación a partir de muestras de células mononucleares de sangre periférica humana utilizando microburbujas

El protocolo de activación y expansión de microburbujas es importante porque aborda una importante necesidad insatisfecha en la investigación y fabricación de terapias celulares, mejorando la persistencia y eficacia de las terapias de células T. La técnica de selección, activación y expansión positiva basada en la flotabilidad de Akadeum limita la sobreestimulación y el posterior agotamiento de las células T durante los flujos de trabajo de activación y expansión. Para comenzar, incubar 3 veces 10 a la 8ª PBMCs obtenidas comercialmente en 2,5 mililitros de tampón de separación, con anticuerpo anti-CD3 biotinilado.

Mezclar suavemente los componentes por pipeteo e incubarlos a temperatura ambiente durante 10 minutos. Agregue microburbujas de avidina peladas a las células en una proporción de 0.5 a 1, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Y mezcle usando un rotador comercial de extremo a extremo a 20 RPM durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente.

Centrifugar a 400g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, las células seleccionadas positivamente estarán en la parte superior de la suspensión con las microburbujas de avidina peladas, y las células restantes no seleccionadas estarán en el pellet de células en la parte inferior del tubo. Con una pipeta de vidrio de nueve pulgadas, inserte la punta debajo de la capa de celda de burbuja en la parte inferior del tubo.

Aspirar el pellet celular y el subnadante con una pipeta electrónica y transferirlos a un nuevo tubo. Resuspenda la capa de células burbuja que queda en el tubo original en un mililitro de medio completo de células T. Centrifugar el subnadante a 400 g durante cinco minutos a temperatura ambiente, y utilizarlo para la medición indirecta de la pureza y la recuperación.

Después de la centrifugación del subnadante y las células no seleccionadas, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de medio antes de contar. Usando un contador de células automatizado, cuente las células en el subnadante con microscopía de campo brillante y determine el número de células capturadas en la capa de células burbuja, como se describe en el texto manuscrito. Para crear la avidina despojada anti-CD28 conjugada y las microburbujas, agregue el anticuerpo anti-CD28 biotinilado a las micro burbujas comerciales y mezcle usando rotación de extremo a extremo durante un mínimo de dos horas.

Agregue las micro burbujas de avidina estreptocócica conjugadas anti-CD28 a la suspensión de células de burbujas preparada en una proporción de 1.5 a 1. Mezcle los componentes usando rotación de extremo a extremo durante 15 minutos. Luego ajuste el volumen total a 2 millones de células por mililitro con un medio completo de células T, u otro medio deseado de acuerdo con el número de células obtenidas.

Distribuir un mililitro de células activadas en una placa de 24 pocillos e incubar en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados. Después de 24 horas, agregue IL-2 y anti-CD3 soluble para estimular una mayor expansión, como se calcula utilizando el número inicial de células plateadas en el día cero. Coloque la placa celular de nuevo en la incubadora humidificada de dióxido de carbono e incube durante la noche a 37 grados centígrados.

Retire la mitad del medio del midnatant cada dos días. Reemplácelo con un medio de células T fresco y completo, y agregue IL-2 a una concentración de 50 unidades por mililitro. Cuente las células T dos veces por semana para evaluar la densidad celular.

Cuando la densidad celular excede 2 veces 10 a la 6ª, o 2,5 veces 10 a la 6ª células por mililitro, transfiéralas a un recipiente más grande, diluyéndolas a 5 veces 10 a 5ª células por mililitro. Mezclar suavemente el contenido de cada pocillo pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Retire todo el contenido del pozo, incluidas las microburbujas, y transfiéralas a un tubo de 1,5 mililitros.

Lave cada pocillo con 400 microlitros de DPBS sin calcio y sin magnesio, y transfiera la solución a un tubo de 1,5 mililitros. Luego centrifugar el tubo a 400 g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 50 microlitros de tampón de separación.

A continuación, divida 50 microlitros de suspensión celular en 25 microlitros cada uno para la activación y el agotamiento. Tiñe las células con un cóctel de tinción de anticuerpos de activación y agotamiento, e incubarlas durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Agregue un mililitro de tampón de separación, mezcle suavemente y centrifugar para eliminar el exceso de anticuerpos.

Aspirar el sobrenadante completamente. Resuspender el pellet celular en un mililitro de tampón de separación y transferirlo a un recipiente apropiado para el análisis de citometría de flujo. Se observaron aumentos en el número de células T viables y células T transgénicas positivas entre la muestra de control y las células que recibieron coestimulación de microburbujas.

También se observó un aumento de las poblaciones de células efectoras en las muestras de microburbujas. Las células T activadas viables expresan un aumento del marcador de activación temprana CD69 y un marcador de activación media a tardía CD25. El número total y el porcentaje de marcadores de agotamiento de las células PD1 positivas también fueron significativamente mayores en las muestras de células que recibieron coestimulación de microburbujas.

La mezcla y dispensación adecuadas de microburbujas es esencial para garantizar una dosificación precisa, ya que las microburbujas flotan rápidamente a la superficie sin agitación. Esperamos que lo haga permitiendo el rápido crecimiento de una gran población de células T con mayor actividad que las células T más agotadas que se ven con frecuencia en otros métodos.