Mapeo de las interacciones del genoma 3D de los mamíferos con Micro-C-XL
3 de noviembre de 2023
Aquí se presenta un protocolo para mapear la organización tridimensional del genoma con resolución de nucleosomas utilizando el método de captura de conformación cromosómica de todo el genoma Micro-C-XL.
Este protocolo es importante ya que muestra bucles cromosómicos de alta resolución y otras características de interacción de corto alcance. La principal ventaja de esta técnica es el mapeo de la organización del genoma en 3D con resolución de nucleosomas con alta relación señal-ruido. Para realizar la valoración de MNasa, descongele un gránulo de una vez 10 a la sexta celda en hielo durante 10 minutos, y vuelva a suspender las células en 500 microlitros de DPBS, e incube la suspensión celular en hielo durante 20 minutos.
Recoger las células por centrifugación a 10.000 G durante cinco minutos a temperatura ambiente y retirar el sobrenadante. Resuspender las células peletizadas en 500 microlitros de tampón MB Número uno. Descongelar un vial de 20 unidades por microlitro de MNasa, y diluirlo con 10 milimolares de Tris para las condiciones de digestión descritas en el texto.
Con intervalos de tiempo apropiados de 10 a 20 segundos, agregue un microlitro de la primera solución de digestión de MNase a uno de los cuatro tubos de muestras, vórtice e incube en un ThermoMixer a 37 grados Celsius durante 10 minutos a 800 RPM. Continúe agregando un microlitro de las diluciones restantes de MNasa a las otras alícuotas celulares. Detenga la digestión de la MNasa agregando 200 microlitros de tampón de parada recién preparado a cada tubo en el mismo orden y en el mismo intervalo de tiempo en el que se agregó la MNasa.
Incubar a 65 grados centígrados durante dos horas. Agregue 500 microlitros de PCI a cada muestra y mezcle bien mediante vórtice. Centrifugar a 19,800 G durante cinco minutos a temperatura ambiente para separar las fases.
Y transfiera la fase acuosa a nuevos tubos. Purifique el ADN utilizando un kit comercial de purificación de ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante y eluya las muestras en 12 microlitros de tampón de elución. Agregue de dos a cinco microlitros de tinte de carga a la muestra de ADN purificada.
Coloque las muestras en un gel de agarosa al 1,5% y elija el mejor grado de digestión para el experimento. Un grado de digestión óptimo muestra poco o ningún fragmento subnucleosomal, y una proporción de 70 a 90% de mono a dinucleosoma. En esta muestra representativa, se seleccionó un grado de digestión intermedio entre los carriles tres y cuatro para los experimentos de seguimiento.
Sobre la base de la valoración de MNasa, digiera la cromatina añadiendo la cantidad adecuada de MNasa a cada alícuota de muestra. Mezclar bien e incubar en la ThermoMixer a 37 grados centígrados, 800 RPM durante 10 minutos. Detenga la digestión de MNasa agregando 1,6 microlitros de EGTA 0,5 molar a cada alícuota e incube en un ThermoMixer a 65 grados centígrados durante 10 minutos con agitación a 800 RPM.
Recoger la muestra por centrifugación a 10.000 G durante cinco minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante. Resuspender el gránulo celular en 500 microlitros de tampón 1X NEB 2.1. Agrupar muestras equivalentes a una entrada de cinco veces 10 a la sexta celda o menos para su posterior procesamiento.
Antes de proceder a la ligadura de proximidad, transfiera el 10% de la muestra como control de entrada para monitorear el nivel de digestión de MNasa. Agregue 150 microlitros de Tris de 10 milimolares, 25 microlitros de SDS al 10% y 25 microlitros de 20 miligramos por mililitro de proteinasa K al control de la digestión e incube durante la noche a 65 grados centígrados. Recoger la muestra restante por centrifugación a 10.000 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante.
Resuspenda el pellet en 90 microlitros de mezcla maestra Micro-C recién preparado e incube en un ThermoMixer a 37 grados Celsius, 800 RPM durante 15 minutos. Añadir 10 microlitros de cinco unidades por fragmento de microlitro de Klenow e incubar en un ThermoMixer. Luego agregue 100 microlitros de mezcla maestra Micro-C recién preparada.
Incubar durante 45 minutos a 25 grados Celsius, 800 RPM, y apagar la reacción enzimática con EDTA como se describe en el texto. Incubar en una termomezcladora durante 20 minutos a 65 grados centígrados, 800 RPM. Recoger la muestra por centrifugación a 10.000 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, y desechar el sobrenadante.
Vuelva a suspender la muestra en 500 microlitros de mezcla maestra Micro-C recién preparada e incube durante 2,5 horas a temperatura ambiente a 15 a 20 RPM. Repita la centrifugación y retire el sobrenadante. A continuación, vuelva a suspender la muestra en 200 microlitros de Micro-C master mix four recién preparados, e incube en un ThermoMixer ajustado a 37 grados centígrados durante 15 minutos a 800 RPM.
Para la reticulación inversa y la desproteinación, agregue 25 microlitros de 20 miligramos por microlitro de proteinasa K y 25 microlitros de SDS al 10% a la muestra, e incube a 65 grados Celsius durante la noche con mezcla intermitente. Agregue 500 microlitros de PCI a las muestras y al control de entrada, luego mezcle por vórtice. Separar las fases por centrifugación a 19,800 G durante cinco minutos, y transferir la fase acuosa superior a un tubo nuevo.
Concentrar el ADN y eluir las muestras en 30 microlitros, y los controles de entrada en 15 microlitros. Aplica un gel de agarosa al 1,5% para separar los mononucleosomas y los dinucleosomas. Extirpar los fragmentos de ADN que tienen un tamaño dinucleosomal y extraer el ADN como se describe en el texto.
Agregue 150 microlitros de perlas preparadas previamente a 150 microlitros de la muestra e incube a temperatura ambiente. Coloque los tubos en un imán apropiado y espere hasta que la solución se aclare. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las perlas en 300 microlitros de 1X TBW, y repita este paso.
Repita la separación magnética y, después de que la solución se aclare, retire el sobrenadante y vuelva a suspender las perlas en 100 microlitros de 0,1X TE. Repetir y resuspender en 50 microlitros de 0,1X TE. Transfiera la solución a tubos de PCR y realice la manipulación del ADN como se describe en el texto. Una vez completada la ligadura del adaptador, lavar la muestra en 1X TBW, desechar el sobrenadante y volver a suspender las perlas en 20 microlitros de 0,1X TE. Optimice el número de ciclos de PCR y amplíe las bibliotecas de secuencias como se describe en el texto. La cromatina de 250.000 células por reacción se digirió con una dilución cuádruple de MNasa.
La concentración más alta, 10 unidades, mostró cromatina sobredigerida que consistía casi exclusivamente en ADN mononucleosomal. La digestión de 250.000 células madre embrionarias de ratón con 0,625 unidades de MNasa ofreció el punto de partida más prometedor para las digestiones preparativas en experimentos de Micro-C. Sin embargo, se debe considerar una concentración intermedia de MNasa entre las condiciones mostradas en los carriles tres y cuatro, correspondiente a cinco unidades por 1 millón de células.
La banda de mononucleosoma ligada por proximidad tenía un tamaño aproximado de 300 pares de bases, similar al de los dinucleosomas. Por lo tanto, la relación de señal de banda mono a dinucleosomal cambió de predominantemente mononucleosomas a dinucleosomas. La calidad y la cantidad de la biblioteca de secuenciación preparada se evaluaron mediante PCR mínima.
La visualización mostró una banda distinta en 420 pares de bases, y ninguna banda para los dímeros adaptadores. Si bien ambas muestras en este estudio mostraron altas tasas de mapas, la muestra buena tuvo una fracción más alta de lecturas cis. Una alta tasa de interacciones transcromosómicas indica eventos de ligadura aleatorios, aunque algunas interacciones transcromosómicas pueden ser importantes.
Además, la buena muestra tenía una tasa moderada de pares de lectura de mapeo hacia adelante-atrás, con distancias inferiores a 500 pares de bases. Esto indicó una baja tasa de dinucleosomas no escindidos por la MNasa que tienen un tamaño similar a dos nucleosomas ligados por proximidad. Un grado adecuado de digestión de la MNasa es crucial para este experimento.
Los nucleosomas sobredigeridos están ligados de manera ineficiente, y la cromatina subdigerida tiene una gran fracción de dinucleosomas no digeridos que pueden contaminar la biblioteca de secuenciación. Micro-C se puede combinar con un enfoque de captura para mapear la organización del genoma específico del locus con una resolución enormemente alta.
Descripción general
Este protocolo describe un método para mapear la organización tridimensional del genoma a resolución de nucleosoma mediante la técnica Micro-C-XL. Destaca la alta resolución de los bucles cromosómicos y las interacciones de corto alcance.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Genómica
- Biología de la Cromatina
- Biología Celular
Antecedentes
- La organización tridimensional del genoma es fundamental para comprender la regulación génica.
- Micro-C-XL proporciona una alta relación señal-ruido para un mapeo preciso.
- Los métodos de captura de conformación cromosómica son esenciales para estudiar las interacciones de la cromatina.
- La resolución a nivel de nucleosoma es importante para estudios genómicos detallados.
Objetivo del estudio
- Presentar un protocolo detallado para la cartografía genómica de alta resolución.
- Mejorar la comprensión de la estructura y función de la cromatina.
- Proporcionar un método confiable para estudiar interacciones de cromatina a corto alcance.
Métodos Utilizados
- Titulación de MNasa para la digestión de cromatina.
- Ligación de proximidad para capturar interacciones de cromatina.
- Purificación de ADN y electroforesis en gel para analizar los productos de digestión.
- Ligación de adaptadores y amplificación por PCR para bibliotecas de secuenciación.
Resultados principales
- Mapa exitoso de interacciones de cromatina a resolución de nucleosoma.
- Identificación de las condiciones óptimas de digestión con MNasa.
- Demuestra ADN de alta calidad adecuado para secuenciación.
- Información sobre la organización espacial del genoma.
Conclusiones
- El método Micro-C-XL proporciona un enfoque robusto para estudiar la arquitectura del genoma.
- El mapeo de alta resolución puede revelar información importante sobre la regulación génica.
- Este protocolo puede adaptarse para diversos estudios genómicos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El mapeo de alta resolución de las interacciones del genoma 3D a nivel de nucleosoma permite una comprensión sin precedentes de la arquitectura de la cromatina, aportando información directa para la validación de objetivos y la reducción mecanicista de riesgos en las fases iniciales del descubrimiento. La relación señal-ruido mejorada de Micro-C-XL facilita la identificación confiable de elementos reguladores y bucles de cromatina, reduciendo la ambigüedad en genómica funcional. Esta capacidad refuerza la confianza predictiva en puntos críticos de inflexión del proceso de descubrimiento en biotecnología y farmacéutica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la cartografía precisa de las interacciones entre potenciadores y promotores para la validación funcional de dianas.
- Apoya la reducción mecanicista de riesgos al resolver bucles de cromatina y sitios de aislamiento con resolución a nivel de nucleosoma.
- Facilita la interrogación basada en hipótesis de las vías reguladoras en sistemas relevantes para enfermedades.
- Mejora la confianza predictiva para la selección de carteras al aclarar la organización tridimensional del genoma.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Proporciona mapas validados de interacciones de cromatina para orientar el diseño de ensayos posteriores.
- Ofrece resultados cuantitativos y reproducibles para la estandarización entre plataformas de cribado.
- Permite una evaluación robusta de los cambios en el estado de la cromatina en respuesta al tratamiento con compuestos.
- Apoya flujos de trabajo escalables para iniciativas de cribado genómico de alto rendimiento.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relaciona datos de interacción de cromatina con biomarcadores relevantes para enfermedades, para lograr una continuidad traslacional.
- Permite tomar decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la vinculación de características del genoma tridimensional con resultados funcionales.
- Apoya la selección de modelos preclínicos basada en la similitud de la arquitectura de la cromatina con sistemas humanos.
- Proporciona información mecanicista para orientar la estrategia de biomarcadores y la estratificación de pacientes.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Micro-C-XL se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación inicial del objetivo hasta la investigación preclínica, proporcionando una plataforma reutilizable para la cartografía de cromatina de alta resolución.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al resolver interacciones de la cromatina a nivel de nucleosoma.
- Selección: Proporciona datos cuantitativos y reproducibles sobre interacciones de la cromatina para orientar la preparación de ensayos y la evaluación de compuestos.
- Análisis: Ofrece mediciones con alta relación señal-ruido para comparaciones estadísticas robustas de estados de la cromatina.
- Investigación Traducional: Permite alinear características de la cromatina con biomarcadores de enfermedades para lograr continuidad en estudios preclínicos.
- Reutilización Empresarial: Establece un flujo de trabajo estandarizado para estudios continuos de arquitectura de la cromatina en diversos programas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Proporciona flujos de trabajo estandarizados, reproducibles y escalables para el mapeo de cromatina.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al aclarar la arquitectura reguladora.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización y el avance ajustados al riesgo de los programas de descubrimiento.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en biología de la cromatina y técnicas avanzadas de genómica.
- Exige acceso a MNasa de alta calidad, infraestructura de secuenciación y herramientas analíticas.
- Necesita una estandarización rigurosa entre equipos en los pasos de digestión y preparación de bibliotecas.
- Debe adaptarse a diferentes tipos celulares mamíferos y contextos de cromatina.
- Una digestión óptima con MNasa es fundamental para evitar artefactos por sobredigestión o subdigestión en los datos.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:26
MNase Titration
3:07
Preparative MNase Digestion
4:43
DNA End Processing and Proximity Ligation
6:50
Di‐Nucleosomal DNA Purification and Size Selection
7:42
Streptavidin Pull‐Down and On‐Bead Library Preparation
8:59
Results: Micro‐C Libraries for Mapping the Mammalian 3D Genome Interactions
11:07
Conclusion
