Name: Mapeo de las interacciones del genoma 3D de los mamíferos con Micro-C-XL (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-03T14:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Aprende a mapear la organización tridimensional del genoma con resolución de nucleosoma usando Micro-C-XL en células de mamíferos. Este método permite estudiar interacciones cromatínicas de corto alcance con alta señal.

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Agradecemos a Christl Gaubitz y Kathleen Stewart-Morgan por su lectura crítica del manuscrito. Agradecemos a Anja Groth y al laboratorio de Groth por su apoyo en el establecimiento de nuestro laboratorio. Agradecemos al personal de la Plataforma de Genómica CPR/reNEW por su apoyo: H. Wollmann, M. Michaut y A. Kalvisa. El Centro de Medicina de Células Madre de la Fundación Novo Nordisk (reNEW) cuenta con el apoyo de la subvención número NNF21CC0073729 de la Fundación Novo Nordisk. El Centro de Investigación de Proteínas (CPR) de la Fundación Novo Nordisk cuenta con el apoyo de la subvención número NNF14CC0001 de la Fundación Novo Nordisk. Agradecemos al laboratorio Brickman del Centro Novo Nordisk de Medicina de Células Madre, reNEW Copenhague, por las células madre embrionarias de ratón.

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<li>Hua, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+genome+architecture+at+base-pair+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defining genome architecture at base-pair resolution.</a> Nature. 595 (7865), 125-129 (2021).</li>
<li>Downes, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+targeted+3C+interrogation+of+cis-regulatory+element+organization+at+genome-wide+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-resolution targeted 3C interrogation of cis-regulatory element organization at genome-wide scale.</a> Nature Communications. 12, 531(2021).</li>
<li>Goel, V. Y., Huseyin, M. K., Hansen, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region+capture+Micro-C+reveals+coalescence+of+enhancers+and+promoters+into+nested+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Region capture Micro-C reveals coalescence of enhancers and promoters into nested microcompartments.</a> BioRxiv. , (2022).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El éxito de un experimento Micro-C depende de unos pocos pasos críticos en el protocolo que deben ejecutarse cuidadosamente. En primer lugar, la reticulación con el reticulante adicional DSG o EGS puede conducir a la agregación de células, dependiendo del tipo de célula. La adición de 0,1%-0,5% de BSA a la reacción de reticulación reduce significativamente la agregación sin afectar la eficiencia de la reticulación. La reticulación ineficiente puede dar lugar a un aumento de las tasas de interacciones transcromosómicas que son indicativas de ligaduras aleatorias. El segundo paso, pero el más importante, de este protocolo es la digestión de la cromatina con MNasa. La digestión subóptima de la cromatina conduce a una ligadura de proximidad ineficiente (digestión excesiva) o a un aumento de las tasas de dinucleosomas no ligados a la proximidad (digestión insuficiente). La eficiencia de la reacción de ligadura puede evaluarse mediante electroforesis en gel de agarosa (Figura 1B) y, además, se estima mejor mediante secuenciación de baja entrada. Si la secuenciación de baja entrada revela una alta tasa de duplicación (ligadura ineficiente) o un aumento de las tasas de dinucleosomas, se debe volver a evaluar el grado de digestión de la MNasa. En particular, la pérdida de muestra al ejecutar el protocolo puede conducir a una reducción de la complejidad de la biblioteca. La concentración de una muestra se evalúa mejor después de la purificación del ADN (paso 5.3) o mediante una PCR mínima (paso 8). El rendimiento total de ADN de 5 x 106 células de mamíferos después de la purificación del ADN suele ser de >2 μg. La concentración de ADN debe controlarse después de la digestión de MNasa, la digestión de ExoIII y la purificación del ADN. Las nucleasas endógenas, cuya abundancia es específica del tipo de célula y de la especie, pueden ser una fuente de degradación del ADN. Además, la purificación de ADN basada en columnas puede provocar la pérdida de muestras debido a la incompatibilidad con la SDS de las reacciones de desproteinación. Se puede considerar la precipitación de etanol si la concentración de ADN es baja en este paso.
Dado que Micro-C requiere una valoración de MNasa específica de la muestra, es un reto aplicar Micro-C a poblaciones de células pequeñas, como órganos pequeños de varios organismos modelo, embriones y células individuales, organoides o biopsias de pacientes. En este caso, Hi-C 3.0 ofrece una alternativa bien establecida que utiliza una reacción de punto final mediante endonucleasas de restricción específica de secuencia 8,9.
Micro-C es una tecnología de conformación cromosómica de alta resolución ampliamente aplicable con un alto rango dinámico y una baja relación señal-ruido, lo que la hace particularmente adecuada para investigar características cromosómicas de corto alcance 4,5,8, como bucles cromosómicos. La resolución de Micro-C permite capturar bucles promotor-potenciador, que están más allá del límite de detección de Hi-C, lo que permite un análisis más detallado de la relación entre la organización del genoma y la regulación13,14,15. Además, las estrategias de captura de ADN se han combinado recientemente con Micro-C para aumentar la resolución específica del locus de los loci genómicos objetivo a niveles sin precedentes, revelando nuevos conocimientos sobre la ultraestructura del genoma 3D16,17,18. En resumen, prevemos que Micro-C y sus derivados serán una tecnología clave para diseccionar el papel del genoma 3D en la regulación transcripcional y, en consecuencia, en la diferenciación y mantenimiento de los tipos celulares.

Micro-C-XL es una técnica de todo el genoma para medir la conformación del genoma en 3D con resolución de nucleosomas. Micro-C-XL se basa en la tecnología Hi-C basada en la ligadura de proximidad ampliamente utilizada, que ha transformado nuestra comprensión de cómose organizan los genomas 3D. Micro-C-XL y su primera iteración, Micro-C, se desarrollaron inicialmente en Saccharomyces cerevisiae2,3 y posteriormente se adaptaron a sistemas celulares de mamíferos, para los que el protocolo ha demostrado todo su potencial en la detección de características de corto alcance del genoma 3D, como bucles cromosómicos y sitios de aislamiento. Esta versión se basa en publicaciones recientes de Micro-C-XL en mamíferos 4,5. Como Micro-C-XL reemplaza a Micro-C, Micro-C-XL se denominará Micro-C en el manuscrito.
Las principales diferencias entre Micro-C y Hi-C6 son las siguientes: 1) fragmentación del genoma con nucleasa microcócica (MNasa) en comparación con enzimas de restricción y 2) reticulantes adicionales con mayor espaciamiento atómico entre los grupos reactivos en comparación con solo formaldehído. Ambos pasos contribuyen significativamente a la mejora de la relación señal-ruido de Micro-C en comparación con Hi-C convencional. El tamaño de la fragmentación limita la resolución a la que se puede resolver la organización del genoma 3D durante el protocolo de ligadura de proximidad. La MNasa es una nucleasa que digiere preferentemente el ADN accesible y deja intacto el ADN protegido por nucleosomas. La huella de nucleosomas mediante secuenciación de MNasa ha demostrado que los nucleosomas cubren completamente la mayoría de los genomas eucariotas7. Como los nucleosomas se distribuyen por todo el genoma con un espaciamiento medio de 160-220 pb, dependiendo de la especie y el tipo de célula, la MNasa es la enzima ideal para el mapeo de alta resolución de la arquitectura del genoma.
El uso de un reticulante adicional en combinación con formaldehído (FA) en el método Micro-C mejora adicionalmente la relación señal-ruido 2,8. Los reticulantes específicos de aminas con espaciadores atómicos más largos entre los grupos reactivos facilitan los reticulantes proteína-proteína. Por lo general, se trata de glutarato de disuccinimidil (DSG) o succinimidato de etilenglicol bis-succinimidil (EGS) con espaciadores de 7,7 Å y 16,1 Å, respectivamente. La reducción del ruido a través de EGS o DSG es particularmente evidente en experimentos con altas tasas de fragmentación, como Micro-C, y presumiblemente ocurre debido a una reducción en la tasa de eventos de ligadura aleatoria8.
Un protocolo Hi-C 3.0 recientemente desarrollado que utiliza la reticulación ESG/DSG y múltiples combinaciones de enzimas de restricción reduce el ruido en los experimentos Hi-C y mejora significativamente la detección de bucles cromosómicos y sitios de aislamiento 8,9. Aun así, una comparación sitio por sitio de varias características de datos de interacción encontró que Micro-C tenía una detección superior de características de corto alcance, como bucles cromosómicos y sitios de aislamiento, en comparación con Hi-C 3.0 y Hi-C8 convencional. Sin embargo, Hi-C 3.0 mejora la detección de características de corto alcance y mantiene una fuerte detección de la compartimentación del genoma en comparación con Hi-C convencional. En resumen, la elección de un método de captura de la conformación cromosómica debe estar determinada por la cuestión objetiva y biológica.
Aquí, proporcionamos un protocolo paso a paso para experimentos exitosos de Micro-C que pueden desentrañar la organización del genoma 3D.

<table><tbody><tr><td>1 mM de biotina dATP</td><td>Jenna Bioscience&nbsp;</td><td>NU-835-Bio14-S</td><td></td></tr><tr><td>1 mM Biotina dCTP</td><td>Jenna Bioscience</td><td>NU-809-BioX-S</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dGTP</td><td>NEB</td><td>N0442S</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dTTP&nbsp;</td><td>NEB</td><td>N0443S</td><td></td></tr><tr><td>10 U/ml T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>100 U/L Exonucleasa III</td><td>NEB</td><td>M0206L</td><td></td></tr><tr><td>10x NEBuffer 1.1</td><td>NEB</td><td>B7001S</td><td></td></tr><tr><td>10x NEBuffer 2.1 NEB</td><td></td><td>B7202S</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 Tampón de ADN Ligasa&nbsp;</td><td>NEB</td><td>B0202A</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS sin Mg2+ y Ca2+</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>14190144</tr><tr><td>1x LIF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2_Mercaptoethanol 50 mM&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td>0,1 mM b-mercaptoetanol&nbsp;</td></tr><tr><td>37% Formaldehído&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252549-500ML</td><td>Precaución. Ver fabricantes MSDS</td></tr><tr><td>400 U/ml T4 DNA Ligasa&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>5 U/ml Klenow Fragment</td><td>NEB</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>BIO-RAD</td><td>1613102</td><td>Precaución. Ver fabricantes MSDS BSA</td></tr><tr><td>20mg/ml</td><td>NEB</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cell contador</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418-100ML</td><td>Precaución. Ver fabricantes MSDS</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Invitrogen</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>referido como: imán magnético para tubos de 1,5 ml</td></tr><tr><td>DynaMag-PCR Magnet</td><td>Invitrogen</td><td>492025</td><td>denominado como: imán magnético para tubos de PCR</td></tr><tr><td>EDTA Ultrapure 0.5M pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>EGTA Ultrapure 0.5M pH 8.0</td><td>BioWorld</td><td>40121266-1</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 96%&nbsp;</td>Sistema de control de calidad <td>20824365 de VWR Chemicals</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bromuro de etidio&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15585-011</td><td></td></tr><tr><td>Etilenglicol bis(succinato de succinimidilo) (EGS)</td><td>ThermoFisher</td><td>21565</td><td></td></tr><tr><td>Fetl Bovin Serum</td><td>Sigma</td><td>Aldrich F7524</td><td>15% FBS</td></tr><tr><td>Gel Cargando tinte púrpura (6X)</td><td>NEB</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>Glicina&nbsp;</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1067.0500</td><td></td></tr><tr><td>Halt Inhibidor de la proteinasa (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>78430</td><td>Precaución. Ver fabricantes MSDS</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630 (NP-40)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>18896-50ML</td><td></td></tr><tr><td>MgCl 1 M</td><td>Invitrogen</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcal Nucleasa (MNasa)</td><td>Worthington</td><td>LS004798</td><td></td></tr><tr><td>células madre embrionarias de ratón&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos para Illumina (cebadores de doble índice)</td><td>NEB</td><td>E7600S</td><td>cebadores de amplificación para bibliotecas de secuenciación</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Kit de preparación de bibliotecas de ADN para Illumina</td><td>NEB</td><td>E7645L</td><td>kit de preparación de bibliotecas de secuenciación&nbsp;</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Q5 Master mix&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0544S</td><td>Precaución. Ver fabricantes MSDS</td></tr><tr><td>Solución de Aminoácidos No Esenciales</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>1x NEAA</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140148</td><td>1% Pen-Strep</td></tr><tr><td>Proteinasa K (40 mg/ml)</td><td>GoldBio</td><td>P-480-1</td><td>Precaución. Ver fabricantes MSDS</td></tr><tr><td>QIAquick Kit de extracción de gel</td><td>QIAgen</td><td>28706</td><td>referido como: Kit de elución de gel de ADN&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de purificación de PCR QIAquick</td><td>QIAgen</td><td>28106</td><td>referido como: kit de purificación de ADN comercial&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de ensayo Qubit dsDNA HS</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>instrumento de cuantificación de ADN de alta sensibilidad&nbsp;</td></tr><tr><td>Carga rápida púrpura 1kb plus DNA Ladder</td><td>NEB</td><td>N0550S</td><td></td></tr><tr><td>SPRIseleccionar tamaño de abalorios de selección</td><td>Beckman Coulter</td><td>B23319</td><td>perlas paramagnéticas&nbsp;</td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td>5382000015 se refiere como: termomezclador</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7949-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure 10% SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15553-035</td><td></td></tr><tr><td>Fenol Cloroformo Alcohol isoamílico (PCI) ultrapuro</td> <td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td></td></tr><tr><td>Analizador</td><td></td><td></td><td></td> de fragmentos</tr></tbody></table>

mapeo de las interacciones del genoma 3d de los mamíferos con micro-c-xl

Mapping Mammalian 3D Genome Interactions with Micro-C-XL

La organización cromosómica tridimensional (3D) es un factor importante en la regulación del genoma y la especificación del tipo de célula. Por ejemplo, se cree que los elementos cis-reguladores, conocidos como potenciadores, regulan la actividad de los promotores distales a través de la interacción en el espacio 3D. Las tecnologías de captura de la conformación cromosómica (3C) de todo el genoma, como Hi-C, han transformado nuestra comprensión de cómo se organizan los genomas en las células. La comprensión actual de la organización del genoma 3D está limitada por la resolución con la que se puede resolver la organización topológica de los cromosomas en el espacio 3D. Micro-C-XL mide el plegamiento cromosómico con resolución a nivel del nucleosoma, la unidad básica de la cromatina, mediante la utilización de la nucleasa microcócica (MNasa) para fragmentar los genomas durante el protocolo de captura de la conformación cromosómica. Esto da como resultado una mejor relación señal-ruido en las mediciones, lo que facilita una mejor detección de sitios de aislamiento y bucles cromosómicos en comparación con otras tecnologías 3D de todo el genoma. En este artículo se presenta un protocolo paso a paso, detallado y con soporte visual para preparar muestras de Micro-C-XL de alta calidad a partir de células de mamíferos.

La preparación exitosa de las bibliotecas Micro-C se puede evaluar en varios pasos del protocolo. El paso más importante es la elección de un grado de digestión de MNasa adecuado. Por lo tanto, la concentración de MNasa debe valorarse para producir de manera consistente un 70%-90% de mononucleosomas sobre dinucleosomas para cada muestra. Es importante tener en cuenta que la digestión de la cromatina es diferente para la eu- y la heterocromatina, ya que la MNasa digiere la heterocromatina de manera menos eficiente. Por lo tanto, el grado óptimo de digestión depende de la región de cromatina de interés y del tipo de célula estudiado, ya que la proporción relativa de eu- y heterocromatina es específica del tipo de célula. Por lo tanto, es aconsejable valorar cuidadosamente la concentración de MNasa requerida y evaluar primero el éxito del experimento Micro-C mediante secuenciación de baja entrada.
En la Figura 1A se muestra un patrón típico de titulación de MNasa de cromatina tratada con cantidades decrecientes de MNasa. Aquí, la cromatina de 250.000 células por reacción se digiere con una dilución cuádruple de MNasa. La concentración más alta (10 U de MNasa, Carril 2) muestra cromatina sobredigerida que consiste casi exclusivamente en ADN mononucleosómico (~150 pb). En particular, el centro de la banda mononucleosomal es más bajo en el gel de agarosa en comparación con las bandas correspondientes en las muestras con concentraciones reducidas de MNasa, lo que indica una digestión excesiva del ADN nucleosomal. Los nucleosomas sobredigeridos se ligan de manera ineficiente en la reacción de ligadura de proximidad; por lo tanto, la muestra en el carril 2 no es óptima para experimentos de Micro-C. El carril 3 (2,5 U de MNasa) muestra un grado de digestión casi apropiado para experimentos de Micro-C. Aquí, la banda mononucleosomal es la especie dominante, y el frotis subnucleosomal, indicativo de nucleosomas sobredigeridos, se reduce; sin embargo, todavía está presente. El grado de digestión en el carril 4 (0,635 U de MNasa) es una condición ideal para un experimento de Micro-C en este ejemplo de valoración. Está presente una banda mononucleosómica clara sin ADN subnucleosomal. La intensidad de la banda para el ADN mononucleosoma y dinucleosoma es casi igual, lo que indica un rendimiento de mononucleosoma del 66% o más. Vale la pena señalar que el ADN dinucleosomal es aproximadamente el doble del tamaño del ADN mononucleosomal (~ 320 pb frente a ~ 150 pb), por lo que su intensidad de banda por mol de ADN es dos veces mayor en comparación con su contraparte mononucleosomal. El grado de digestión en el carril 5 (0,156 U de MNasa) muestra cromatina subdigerida con casi ningún ADN nucleosomal, y esto, por lo tanto, representa una muestra subóptima.
En conclusión, en este ejemplo, la digestión de 2,5 x 10 5 células madre embrionarias de ratón con 0,625 U de MNasa (correspondiente a2,5 U de MNasa para 1 x 106 células en 200 μL) ofrece el punto de partida más prometedor para las digestiones preparativas en experimentos de Micro-C. Sin embargo, también debe considerarse una concentración intermedia de MNasa entre las condiciones utilizadas para las muestras en el carril 3 y el carril 4 (correspondiente a 5 U de MNasa para 1 x 106 células en 200 μL). Es importante destacar que la digestión de la cromatina con MNasa no se puede escalar linealmente y no se recomienda aumentar la digestión preparativa más de 4 veces. Para preparar bibliotecas de Micro-C a partir de más de 1 x 10 6 células, es aconsejable digerir la cromatina en alícuotas de 1 x 106 células y agruparlas después de la inactivación de la MNasa.
Para evaluar el éxito del protocolo de ligadura de proximidad, el control de entrada, que es digerido por MNasa y no ligado por proximidad (paso 3.8), debe compararse con la muestra ligada por proximidad (paso 5.3) mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5% (Figura 1B). La banda mononucleosoma ligada por proximidad tiene un tamaño aproximado de 300 pb, similar al de los dinucleosomas. Por lo tanto, la relación de señal de banda mononucleosoma a dinucleosoma debe cambiar de predominantemente mononucleosomas (carril 1) a dinucleosomas (carril 3 y carril 4). Como el gel de agarosa en este paso es el ADN dinucleosomal que se extirpa y purifica, es aconsejable dividir las muestras en varios carriles para evitar la sobrecarga.
Se recomienda evaluar la calidad y cantidad de la biblioteca de secuenciación preparada mediante una PCR mínima. Aquí, el ADN de 1 μL de perlas (1/20 de la muestra total) se amplifica durante 16 ciclos en 10 μL de reacción de PCR. La concentración total de la biblioteca mínima de PCR suele oscilar entre 50 y 500 ng después de 16 ciclos de PCR. En teoría, esto corresponde a una biblioteca de 1-10 μg de la muestra restante de 19 μL si también se amplificara durante 16 ciclos. Se recomienda utilizar el número mínimo de ciclos de PCR necesarios para generar una biblioteca de aproximadamente 100 ng a partir del ADN total. Suponiendo una amplificación logarítmica en la PCR, la concentración teórica del ADN obtenida a partir de la entrada de 19 μL a 16 ciclos se puede dividir sucesivamente por dos para calcular el número de ciclos de PCR necesarios para generar una biblioteca de 100 ng. Por ejemplo, un rendimiento de 100 ng de 1 μL después de 16 ciclos corresponde a un rendimiento de 1.900 ng amplificado de 19 μL. En este escenario, lo ideal es que 12 ciclos generen una biblioteca de secuenciación de 118 ng a partir del ADN total (1.900 ng/[2 × 2 × 2 × 2] = 118 ng). La muestra restante de 9 μL de la PCR mínima se puede utilizar para evaluar la calidad de la biblioteca mediante electroforesis en gel de agarosa (Figura 1C). La visualización debe mostrar una banda distinta a 420 pb y ninguna banda para los dímeros adaptadores (120 pb). También pueden aparecer fragmentos más pequeños, que corresponden a cebadores de PCR no utilizados.
A continuación, se recomienda analizar y confirmar el éxito de la preparación de la muestra de Micro-C mediante la secuenciación de baja entrada antes de comprometerse con la secuenciación profunda que consume muchos recursos. Normalmente, las bibliotecas se secuencian a una profundidad de lectura de 5 x 106 a 1 x 107 y se evalúan en función de los siguientes criterios: la tasa de duplicación de lectura de secuenciación, la tasa de interacción cisómica frente a la transcromosómica y la frecuencia de orientación de lectura de secuenciación. Las bibliotecas Micro-C se procesan con Distiller, una canalización de servicio completo que procesa los datos desde la secuenciación de archivos de lectura (formato Fastq) hasta archivos de pares de lectura (formato Bedpe) y matrices de interacción escalables (formatos Cool y Mcool) utilizando cooler, pairtools y cooltools10,11,12. La canalización también genera un archivo de resumen que es ideal para evaluar la calidad de las bibliotecas de Micro-C10 (https://github.com/open2c/distiller-nf). La tasa de duplicación de PCR proporciona información sobre la complejidad de la biblioteca de secuenciación y se puede extraer del archivo *.stats generado. Las bibliotecas Micro-C de alta calidad tienen tasas de duplicación de PCR inferiores al 5%-10% cuando se generan a partir de 5 millones o más de células. En particular, algunas plataformas de secuenciación generan duplicados de PCR durante la formación del clúster, independientemente de la complejidad de la biblioteca de secuenciación. La Figura 2A muestra las tasas de duplicación relativas de dos experimentos: uno que consideramos una muestra buena y otro que una muestra mala. En este ejemplo, ambas muestras mostraron velocidades de mapa aceptables. El siguiente criterio para evaluar la calidad de las bibliotecas Micro-C es la relación cis frente a trans y las frecuencias de orientación de lectura. Dentro del núcleo, los cromosomas habitan territorios cromosómicos individuales y, por lo tanto, rara vez interactúan con otros cromosomas. Una alta tasa de interacciones transcromosómicas detectadas indica una alta tasa de ligaduras aleatorias. Cabe destacar que en este nivel de análisis, la muestra mala mostró una alta tasa de interacciones transcromosómicas en comparación con la muestra buena (Figura 2B). Para Micro-C, es deseable una tasa de interacción ciscromosómica del 70% o más.
Una biblioteca Micro-C tiene un tamaño de fragmento similar a la banda de ADN dinucleosomal, que puede copurificarse con la muestra ligada por proximidad y contaminar el experimento. Estos contaminantes son siempre interacciones ciscromosómicas. Por lo tanto, es importante evaluar también las tasas de orientación de lectura. La tasa de contaminación dinucleosómica puede estimarse mediante secuenciación de bajos insumos. El ADN dinucleosomal proviene de dos nucleosomas vecinos que no han sido escindidos por la MNasa. Por lo tanto, las lecturas de secuenciación resultantes siempre mostrarán una orientación de lectura hacia adelante-hacia atrás (F y R), y la distancia entre los pares de lectura será de alrededor de 320 pb. Los fragmentos ligados por proximidad, en comparación, se pueden ligar en cuatro orientaciones, lo que produce pares de lectura con F-R, R-R, R-F y F-F, idealmente con la misma abundancia (Figura 2C). Además, muestran varias distancias entre los dos pares de lectura. Para estimar la cantidad de contaminantes dinucleosómicos, la frecuencia de las orientaciones de lectura se puede calcular a partir de los archivos *stats generados por el destilador (Figura 2D). En particular, en este trabajo, la fracción de lecturas F-R (rojo) fue mayor en la muestra mala en comparación con la muestra buena, y esto se hizo más evidente cuando las orientaciones de lectura se estratificaron por distancia (Figura 2E). La fracción F-R está dominada por fragmentos dinucleosomales en comparación con las bibliotecas Micro-C cuando los pares de lectura se estratifican en lecturas con distancias &lt;562 pb o ≥562 pb. Aquí, la fracción de lecturas con distancia &lt;562 pb está dominada por lecturas F-R, mientras que la fracción con distancias ≥562 pb muestra una distribución uniforme entre las cuatro orientaciones posibles, lo que indica que la sobrerrepresentación global de lecturas F-R se debe a contaminantes dinucleosómicos. La elección de 562 pb como umbral para el subconjunto se define mediante la discretización en el archivo *stats generado. Aunque no es necesario para este control de calidad, se puede lograr un subconjunto más definido extrayendo las distancias del archivo *pairs, que también es generado por distiller. Es importante tener en cuenta que las lecturas dinucleosomales no disminuyen la calidad de la muestra de Micro-C, ya que pueden identificarse e ignorarse durante el procesamiento de datos. Sin embargo, no contienen información valiosa sobre las interacciones 3D y diluyen las lecturas informativas.
Por lo tanto, la valoración cuidadosa de MNasa y el control de calidad exhaustivo con secuenciación de baja entrada son las mejores herramientas para optimizar la calidad de los experimentos de Micro-C.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64579/64579fig01.jpg"> Figura 1: Etapas intermedias del protocolo Micro-C . (A) Electroforesis en gel de agarosa de cromatina de 2,5 x 105 células madre embrionarias de ratón digeridas con concentraciones variables de MNasa. Las bandas mononucleosomales, dinucleosómicas y trinucleosómicas se indican con flechas. M: Escalera de ADN (Carril 1/6); 10 U de MNasa por cada 250.000 células (carril 2); 2,5 U de MNasa por cada 250.000 células (carril 3); 0,625 U de MNasa por cada 250.000 células (carril 4); 0,156 U de MNasa por cada 250.000 células (carril 2). (B) La electroforesis en gel de agarosa al 1,0% de las muestras preparadas con Micro-C (Carril 3 y Carril 4) y el control de entrada digerido por MNasa (Carril 1). El carril 1 y el carril 2 (M: escalera de ADN) se mejoran para enfatizar el cambio relativo en la intensidad de los fragmentos mononucleosomales a dinucleosomales. Las bandas mono y dinucleosomales se indican con flechas. La banda dinucleosomal en la muestra ligada por proximidad combina ADN dinucleosomal y de la biblioteca Micro-C. (C) La electroforesis en gel de agarosa al 1,0% de las bibliotecas de secuenciación Micro-C amplificada a partir de una muestra de 1 μL para evaluar la calidad. Carril 1 (M): escalera de ADN; Carril 2 (S): Biblioteca Mirco-C. (D) Traza del analizador de fragmentos de la biblioteca Micro-C final. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64579/64579fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64579/64579fig02.jpg"> Figura 2: Estadísticas de muestra para la secuenciación de entrada baja de una muestra buena y una muestra mala . (A) Gráfico de barras del porcentaje mapeado (verde) y no mapeado (rojo) lecturas. (B) Fracción normalizada de lecturas que mapea las interacciones cis y transcromosómicas. Los conjuntos de datos se normalizaron a la lectura de mapeo cis. Las lecturas de mapeo cis se estratificaron por la distancia entre la primera y la segunda lectura de las muestras secuenciadas de extremos pareados: ≤1 kbp (amarillo), &gt;1 kbp y ≤10 kbp (naranja) y &gt;10 kbp (rojo). (C) Esquema de las especies moleculares potenciales con los tamaños dinucleosomales. (D) Porcentajes de orientaciones de pares de lectura de todas las lecturas de la muestra buena y de la muestra mala. (E) Igual que el panel (D) pero estratificado por distancias (izquierda, &lt;562 pb y derecha, ≥562 pb). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64579/64579fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componentes</td>
			<td>1 vez</td>
			<td>4.4x</td>
		</tr><tr><td>10x NEBuffer 2.1,</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>44 μL</td>
		</tr><tr><td>2 μL 100 mM ATP</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>8,8 μL</td>
		</tr><tr><td>TDT de 100 mM</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>22 μL</td>
		</tr><tr><td>H2O</td>
			<td>68 μL</td>
			<td>299,2 μL</td>
		</tr><tr><td>10 U/μL T4 PNK</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>22 μL</td>
		</tr><tr><td>Total</td>
			<td>90 μL</td>
			<td>396 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Mezcla maestra Micro-C 1. Composición de la mezcla maestra para la reacción de masticación final.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componentes</td>
			<td>1 vez</td>
			<td>4.4x</td>
		</tr><tr><td>1 mM de biotina-dATP</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>44 μL</td>
		</tr><tr><td>1 mM de biotina-dCTP</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>44 μL</td>
		</tr><tr><td>Mezcla de 10 mM de dTTP y dGTP</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>4,4 μL</td>
		</tr><tr><td>10x Tampón de ADN ligasa T4</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>22 μL</td>
		</tr><tr><td>200x BSA</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>1,1 μL</td>
		</tr><tr><td>H2O</td>
			<td>23,75 μL</td>
			<td>104,5 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2: Mezcla maestra Micro-C 2. Composición de la mezcla maestra para la reacción de etiquetado final.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componentes</td>
			<td>1 vez</td>
			<td>4.4x</td>
		</tr><tr><td>10x Tampón de reacción de ligasa NEB T4</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>220 μL</td>
		</tr><tr><td>H2O</td>
			<td>422,5 μL</td>
			<td>1859 μL</td>
		</tr><tr><td>ADN ligasa T4</td>
			<td>25 μL</td>
			<td>110μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 3: Mezcla maestra Micro-C 3. Composición de la mezcla maestra para la reacción de ligadura de proximidad.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componentes</td>
			<td>1 vez</td>
			<td>4.4x</td>
		</tr><tr><td>10x NEBuffer 1.1</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>88 μL</td>
		</tr><tr><td>H2O</td>
			<td>180 μL</td>
			<td>792 μL</td>
		</tr><tr><td>Nucleasa ExoIII</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>44 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 4: Mezcla maestra Micro-C 4. Composición de la mezcla maestra para la reacción de eliminación de biotina.

Aquí se presenta un protocolo para mapear la organización tridimensional del genoma con resolución de nucleosomas utilizando el método de captura de conformación cromosómica de todo el genoma Micro-C-XL.

Mapeo de las interacciones del genoma 3D de los mamíferos con Micro-C-XL

Three-dimensional (3D) chromosome organization is a major factor in genome regulation and cell-type specification. For example, cis-regulatory elements, ...

Este protocolo es importante ya que muestra bucles cromosómicos de alta resolución y otras características de interacción de corto alcance. La principal ventaja de esta técnica es el mapeo de la organización del genoma en 3D con resolución de nucleosomas con alta relación señal-ruido. Para realizar la valoración de MNasa, descongele un gránulo de una vez 10 a la sexta celda en hielo durante 10 minutos, y vuelva a suspender las células en 500 microlitros de DPBS, e incube la suspensión celular en hielo durante 20 minutos.Recoger las células por centrifugación a 10.000 G durante cinco minutos a temperatura ambiente y retirar el sobrenadante. Resuspender las células peletizadas en 500 microlitros de tampón MB Número uno. Descongelar un vial de 20 unidades por microlitro de MNasa, y diluirlo con 10 milimolares de Tris para las condiciones de digestión descritas en el texto.Con intervalos de tiempo apropiados de 10 a 20 segundos, agregue un microlitro de la primera solución de digestión de MNase a uno de los cuatro tubos de muestras, vórtice e incube en un ThermoMixer a 37 grados Celsius durante 10 minutos a 800 RPM. Continúe agregando un microlitro de las diluciones restantes de MNasa a las otras alícuotas celulares. Detenga la digestión de la MNasa agregando 200 microlitros de tampón de parada recién preparado a cada tubo en el mismo orden y en el mismo intervalo de tiempo en el que se agregó la MNasa.Incubar a 65 grados centígrados durante dos horas. Agregue 500 microlitros de PCI a cada muestra y mezcle bien mediante vórtice. Centrifugar a 19,800 G durante cinco minutos a temperatura ambiente para separar las fases.Y transfiera la fase acuosa a nuevos tubos. Purifique el ADN utilizando un kit comercial de purificación de ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante y eluya las muestras en 12 microlitros de tampón de elución. Agregue de dos a cinco microlitros de tinte de carga a la muestra de ADN purificada.Coloque las muestras en un gel de agarosa al 1,5% y elija el mejor grado de digestión para el experimento. Un grado de digestión óptimo muestra poco o ningún fragmento subnucleosomal, y una proporción de 70 a 90% de mono a dinucleosoma. En esta muestra representativa, se seleccionó un grado de digestión intermedio entre los carriles tres y cuatro para los experimentos de seguimiento.Sobre la base de la valoración de MNasa, digiera la cromatina añadiendo la cantidad adecuada de MNasa a cada alícuota de muestra. Mezclar bien e incubar en la ThermoMixer a 37 grados centígrados, 800 RPM durante 10 minutos. Detenga la digestión de MNasa agregando 1,6 microlitros de EGTA 0,5 molar a cada alícuota e incube en un ThermoMixer a 65 grados centígrados durante 10 minutos con agitación a 800 RPM.Recoger la muestra por centrifugación a 10.000 G durante cinco minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante. Resuspender el gránulo celular en 500 microlitros de tampón 1X NEB 2.1. Agrupar muestras equivalentes a una entrada de cinco veces 10 a la sexta celda o menos para su posterior procesamiento.Antes de proceder a la ligadura de proximidad, transfiera el 10% de la muestra como control de entrada para monitorear el nivel de digestión de MNasa. Agregue 150 microlitros de Tris de 10 milimolares, 25 microlitros de SDS al 10% y 25 microlitros de 20 miligramos por mililitro de proteinasa K al control de la digestión e incube durante la noche a 65 grados centígrados. Recoger la muestra restante por centrifugación a 10.000 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante.Resuspenda el pellet en 90 microlitros de mezcla maestra Micro-C recién preparado e incube en un ThermoMixer a 37 grados Celsius, 800 RPM durante 15 minutos. Añadir 10 microlitros de cinco unidades por fragmento de microlitro de Klenow e incubar en un ThermoMixer. Luego agregue 100 microlitros de mezcla maestra Micro-C recién preparada.Incubar durante 45 minutos a 25 grados Celsius, 800 RPM, y apagar la reacción enzimática con EDTA como se describe en el texto. Incubar en una termomezcladora durante 20 minutos a 65 grados centígrados, 800 RPM. Recoger la muestra por centrifugación a 10.000 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, y desechar el sobrenadante.Vuelva a suspender la muestra en 500 microlitros de mezcla maestra Micro-C recién preparada e incube durante 2,5 horas a temperatura ambiente a 15 a 20 RPM. Repita la centrifugación y retire el sobrenadante. A continuación, vuelva a suspender la muestra en 200 microlitros de Micro-C master mix four recién preparados, e incube en un ThermoMixer ajustado a 37 grados centígrados durante 15 minutos a 800 RPM.Para la reticulación inversa y la desproteinación, agregue 25 microlitros de 20 miligramos por microlitro de proteinasa K y 25 microlitros de SDS al 10% a la muestra, e incube a 65 grados Celsius durante la noche con mezcla intermitente. Agregue 500 microlitros de PCI a las muestras y al control de entrada, luego mezcle por vórtice. Separar las fases por centrifugación a 19,800 G durante cinco minutos, y transferir la fase acuosa superior a un tubo nuevo.Concentrar el ADN y eluir las muestras en 30 microlitros, y los controles de entrada en 15 microlitros. Aplica un gel de agarosa al 1,5% para separar los mononucleosomas y los dinucleosomas. Extirpar los fragmentos de ADN que tienen un tamaño dinucleosomal y extraer el ADN como se describe en el texto.Agregue 150 microlitros de perlas preparadas previamente a 150 microlitros de la muestra e incube a temperatura ambiente. Coloque los tubos en un imán apropiado y espere hasta que la solución se aclare. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las perlas en 300 microlitros de 1X TBW, y repita este paso.Repita la separación magnética y, después de que la solución se aclare, retire el sobrenadante y vuelva a suspender las perlas en 100 microlitros de 0,1X TE. Repetir y resuspender en 50 microlitros de 0,1X TE. Transfiera la solución a tubos de PCR y realice la manipulación del ADN como se describe en el texto. Una vez completada la ligadura del adaptador, lavar la muestra en 1X TBW, desechar el sobrenadante y volver a suspender las perlas en 20 microlitros de 0,1X TE. Optimice el número de ciclos de PCR y amplíe las bibliotecas de secuencias como se describe en el texto. La cromatina de 250.000 células por reacción se digirió con una dilución cuádruple de MNasa.La concentración más alta, 10 unidades, mostró cromatina sobredigerida que consistía casi exclusivamente en ADN mononucleosomal. La digestión de 250.000 células madre embrionarias de ratón con 0,625 unidades de MNasa ofreció el punto de partida más prometedor para las digestiones preparativas en experimentos de Micro-C. Sin embargo, se debe considerar una concentración intermedia de MNasa entre las condiciones mostradas en los carriles tres y cuatro, correspondiente a cinco unidades por 1 millón de células.La banda de mononucleosoma ligada por proximidad tenía un tamaño aproximado de 300 pares de bases, similar al de los dinucleosomas. Por lo tanto, la relación de señal de banda mono a dinucleosomal cambió de predominantemente mononucleosomas a dinucleosomas. La calidad y la cantidad de la biblioteca de secuenciación preparada se evaluaron mediante PCR mínima.La visualización mostró una banda distinta en 420 pares de bases, y ninguna banda para los dímeros adaptadores. Si bien ambas muestras en este estudio mostraron altas tasas de mapas, la muestra buena tuvo una fracción más alta de lecturas cis. Una alta tasa de interacciones transcromosómicas indica eventos de ligadura aleatorios, aunque algunas interacciones transcromosómicas pueden ser importantes.Además, la buena muestra tenía una tasa moderada de pares de lectura de mapeo hacia adelante-atrás, con distancias inferiores a 500 pares de bases. Esto indicó una baja tasa de dinucleosomas no escindidos por la MNasa que tienen un tamaño similar a dos nucleosomas ligados por proximidad. Un grado adecuado de digestión de la MNasa es crucial para este experimento.Los nucleosomas sobredigeridos están ligados de manera ineficiente, y la cromatina subdigerida tiene una gran fracción de dinucleosomas no digeridos que pueden contaminar la biblioteca de secuenciación. Micro-C se puede combinar con un enfoque de captura para mapear la organización del genoma específico del locus con una resolución enormemente alta.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

El método de Hi-C permite la identificación imparcial de todo el genoma de las interacciones entre la cromatina (1). Hi-C parejas ligadura de proximidad y de secuenciación masiva en paralelo. Los datos resultantes se pueden utilizar para estudiar arquitectura genómica a diferentes escalas, los resultados iniciales identificaron características tales como los territorios de cromosomas, la segregación de la cromatina abierta y cerrada, y la estructura de la cromatina en la escala de megabase.

Hi-C: Un método para estudiar la arquitectura tridimensional de los genomas.

La trampa de cromosoma asociados (ACT) de ensayo es un nuevo método imparcial para la identificación de largo alcance interacciones ADN. La caracterización de las interacciones de largo alcance de ADN nos permitirá determinar la relación de la arquitectura nuclear de la expresión génica en la fisiología normal y en estados de enfermedad.

Cromosómicas asociadas trampa para la identificación de largo alcance Interacciones ADN

Se describe un protocolo robusto y versátil para el análisis de la arquitectura nuclear por FISH 3D DNA usando sondas fluorescentes marcados directamente.

Robusto PESCADO ADN 3D utilizando sondas marcadas directamente

La identificación de los blancos directos de moléculas del genoma de metas sigue siendo un reto importante. Para entender cómo las moléculas de unión al ADN involucran el genoma, hemos desarrollado un método que se basa en la reticulación de moléculas pequeñas para aislar la cromatina (cósmica).

Mapeo de todo el genoma de la droga-ADN interacciones en células con COSMIC (reticulación de pequeñas moléculas para aislar la cromatina)

Este trabajo describe un protocolo para la generación de alta resolución en situ Hi-C bibliotecas de bien escenifica la gastrulación Drosophila melanogaster embriones.

Generación de bibliotecas de captura de conformación de genoma cromatina desde etapas bien tempranas embriones de Drosophila

3D multicolor DNA FISH representa una herramienta para visualizar múltiples loci genómicos dentro de núcleos conservados 3D, definiendo inequívocamente sus interacciones recíprocas y localización dentro del espacio nuclear a un solo nivel de célula. Aquí, se describe un protocolo paso a paso para un amplio espectro de células primarias humanas.

Herramienta 3D Multicolor DNA FISH para estudiar la arquitectura nuclear en células primarias humanas

La determinación precisa de las ubicaciones de unión a proteínas en todo el genoma es importante para entender la regulación genética. Aquí describimos un método de mapeo genómico que trata el ADN inmunoprecipitado con cromatina con digestión exonucleasa (ChIP-exo) seguido de secuenciación de alto rendimiento. Este método detecta interacciones proteína-ADN con resolución cartográfica de par base cercano y alta relación señal-ruido en las neuronas de mamíferos.

Mapeo de alta resolución de interacciones proteína-ADN en neuronas derivadas de células madre del ratón utilizando inmunoprecipitación de cromatina-exonucleasa (ChIP-Exo)

Hi-C 3.0 es un protocolo Hi-C mejorado que combina reticulantes de formaldehído y glutarato de disuccinimidil con un cóctel de enzimas de restricción DpnII y DdeI para aumentar la relación señal-ruido y la resolución de la detección de interacción de cromatina.

Captura de la conformación cromosómica a través de escalas de longitud

Este protocolo describe el método Capture Hi-C utilizado para caracterizar la organización 3D de regiones genómicas específicas de tamaño megabasado en alta resolución, incluidos los límites de los dominios de asociación topológica (TAD) y las interacciones de cromatina de largo alcance entre los elementos reguladores y otros elementos de secuencia de ADN.

Descifrando la organización de la cromatina 3D de alta resolución a través de Capture Hi-C

Aquí, presentamos una adaptación de la técnica de captura de conformación cromosómica (3C) en detalle con énfasis en la participación y el aprendizaje de pregrado.

Obtener una A con las 3C: Captura de conformación cromosómica para estudiantes universitarios

La expresión génica está regulada por interacciones de promotores génicos con elementos reguladores distales. Aquí, describimos cómo la baja entrada de Capture Hi-C (liCHi-C) permite la identificación de estas interacciones en tipos de células raras, que antes no se podían medir.

Un flujo de trabajo integrado para estudiar la arquitectura del genoma espacio-temporal centrada en el promotor en poblaciones celulares escasas

Aprende a mapear la organización tridimensional del genoma con resolución de nucleosoma usando Micro-C-XL en células de mamíferos. Este método permite estudiar interacciones cromatínicas de corto alcance con alta señal.

Mapeo de las interacciones del genoma 3D de los mamíferos con Micro-C-XL

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