Name: Uso de microscopía de lapso de tiempo y agotamiento nuclear de proteínas en etapa específica para estudiar la meiosis en S. cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-11T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Aprende a estudiar la meiosis en Saccharomyces cerevisiae mediante microscopía de lapso de tiempo y agotamiento nuclear de proteínas en etapas específicas. Este método revela funciones proteicas distintas durante la segregación cromosómica.

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Agradecemos al Centro de Imágenes de Microscopía Óptica de la Universidad de Indiana. Este trabajo fue apoyado por una subvención de los Institutos Nacionales de Salud (GM105755).

<ol><li>Tsuchiya, D., Gonzalez, C., Lacefield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spindle+checkpoint+protein+Mad2+regulates+APC%2FC+activity+during+prometaphase+and+metaphase+of+meiosis+I+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">The spindle checkpoint protein Mad2 regulates APC/C activity during prometaphase and metaphase of meiosis I in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (16), 2848-2861 (2011).</li>
<li>Cairo, G., MacKenzie, A. M., Lacefield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+requirement+for+Bub1+and+Bub3+in+regulation+of+meiotic+versus+mitotic+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential requirement for Bub1 and Bub3 in regulation of meiotic versus mitotic chromosome segregation.</a> Journal of Cell Biology. 219 (4), 201909136(2020).</li>
<li>van Werven, F. J., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+entry+into+gametogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+London+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Regulation of entry into gametogenesis.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 366 (1584), 3521-3531 (2011).</li>
<li>Carlile, T. M., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis+I+is+established+through+division-specific+translational+control+of+a+cyclin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Meiosis I is established through division-specific translational control of a cyclin.</a> Cell. 133 (2), 280-291 (2008).</li>
<li>Benjamin, K. R., Zhang, C., Shokat, K. M., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+landmark+events+in+meiosis+by+the+CDK+Cdc28+and+the+meiosis-specific+kinase+Ime2%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Control of landmark events in meiosis by the CDK Cdc28 and the meiosis-specific kinase Ime2.</a> Genes and Development. 17 (12), 1524-1539 (2003).</li>
<li>Xu, L., Ajimura, M., Padmore, R., Klein, C., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NDT80%2C+a+meiosis-specific+gene+required+for+exit+from+pachytene+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">NDT80, a meiosis-specific gene required for exit from pachytene in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6572-6581 (1995).</li>
<li>Chu, S., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gametogenesis+in+yeast+is+regulated+by+a+transcriptional+cascade+dependent+on+Ndt80%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Gametogenesis in yeast is regulated by a transcriptional cascade dependent on Ndt80.</a> Molecular Cell. 1 (5), 685-696 (1998).</li>
<li>Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anchor-away+technique%3A+rapid%2C+conditional+establishment+of+yeast+mutant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes.</a> Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).</li>
<li>Borek, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proteomic+landscape+of+centromeric+chromatin+reveals+an+essential+role+for+the+Ctf19%28CCAN%29+complex+in+meiotic+kinetochore+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The proteomic landscape of centromeric chromatin reveals an essential role for the Ctf19(CCAN) complex in meiotic kinetochore assembly.</a> Current Biology. 31 (2), 283-296 (2021).</li>
<li>Mehta, G. D., Agarwal, M., Ghosh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+kinetochore+protein%2C+Ctf19+in+meiosis+I%3A+an+implication+of+differential+impact+of+Ctf19+on+the+assembly+of+mitotic+and+meiotic+kinetochores+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of kinetochore protein, Ctf19 in meiosis I: an implication of differential impact of Ctf19 on the assembly of mitotic and meiotic kinetochores in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Microbiology. 91 (6), 1179-1199 (2014).</li>
<li>Ortiz, J., Stemmann, O., Rank, S., Lechner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+putative+protein+complex+consisting+of+Ctf19%2C+Mcm21%2C+and+Okp1+represents+a+missing+link+in+the+budding+yeast+kinetochore%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">A putative protein complex consisting of Ctf19, Mcm21, and Okp1 represents a missing link in the budding yeast kinetochore.</a> Genes and Development. 13 (9), 1140-1155 (1999).</li>
<li>Hyland, K. M., Kingsbury, J., Koshland, D., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ctf19p%3A+A+novel+kinetochore+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae+and+a+potential+link+between+the+kinetochore+and+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ctf19p: A novel kinetochore protein in Saccharomyces cerevisiae and a potential link between the kinetochore and mitotic spindle.</a> Journal of Cell Biology. 145 (1), 15-28 (1999).</li>
<li>Fernius, J., Marston, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+cohesion+at+the+pericentromere+by+the+Ctf19+kinetochore+subcomplex+and+the+replication+fork-associated+factor%2C+Csm3%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Establishment of cohesion at the pericentromere by the Ctf19 kinetochore subcomplex and the replication fork-associated factor, Csm3.</a> PLoS Genetics. 5 (9), 1000629(2009).</li>
<li>Meyer, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ipl1%2FAurora-B+is+necessary+for+kinetochore+restructuring+in+meiosis+I+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Ipl1/Aurora-B is necessary for kinetochore restructuring in meiosis I in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (17), 2986-3000 (2015).</li>
<li>Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+sporulation+conditions+for+different+Saccharomyces+cerevisiae+strain+backgrounds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds.</a> Methods in Molecular Biology. 557, 21-26 (2009).</li>
<li>Deutschbauer, A. M., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+trait+loci+mapped+to+single-nucleotide+resolution+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative trait loci mapped to single-nucleotide resolution in yeast.</a> Nature Genetics. 37 (12), 1333-1340 (2005).</li>
<li>Ben-Ari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+linked+genes+participate+in+controlling+sporulation+efficiency+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Four linked genes participate in controlling sporulation efficiency in budding yeast.</a> PLoS Genetics. 2 (11), 195(2006).</li>
<li>Primig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+core+meiotic+transcriptome+in+budding+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The core meiotic transcriptome in budding yeasts.</a> Nature Genetics. 26 (4), 415-423 (2000).</li>
<li>Spencer, F., Gerring, S. L., Connelly, C., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+chromosome+transmission+fidelity+mutants+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mitotic chromosome transmission fidelity mutants in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 124 (2), 237-249 (1990).</li>
<li>Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+source+dependent+promoters+in+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Carbon source dependent promoters in yeasts.</a> Microbial Cell Factories. 13, 5(2014).</li>
<li>Byers, B., Goetsch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+pachytene+arrest+of+Saccharomyces+cerevisiae+at+elevated+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+General+Genetics%22%5BJournal%5D)">Reversible pachytene arrest of Saccharomyces cerevisiae at elevated temperature.</a> Molecular and General Genetics. 187 (1), 47-53 (1982).</li>
<li>Winter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sum1%2FNdt80+transcriptional+switch+and+commitment+to+meiosis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (1), 1-15 (2012).</li>
<li>Neiman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).</li>
<li>Robinett, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+al.+In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator%2Frepressor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">C. al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> Journal of Cell Biology. 135, 1685-1700 (1996).</li>
<li>Straight, A. F., Belmont, A. S., Robinett, C. C., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP+tagging+of+budding+yeast+chromosomes+reveals+that+protein-protein+interactions+can+mediate+sister+chromatid+cohesion%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">GFP tagging of budding yeast chromosomes reveals that protein-protein interactions can mediate sister chromatid cohesion.</a> Current Biology. 6 (12), 1599-1608 (1996).</li>
<li>Sym, M., Engebrecht, J. A., Roeder, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZIP1+is+a+synaptonemal+complex+protein+required+for+meiotic+chromosome+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ZIP1 is a synaptonemal complex protein required for meiotic chromosome synapsis.</a> Cell. 72 (3), 365-378 (1993).</li>
<li>Scherthan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+mobility+during+meiotic+prophase+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chromosome mobility during meiotic prophase in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16934-16939 (2007).</li>
</ol>

Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.

Este protocolo combina el sistema NDT80-in para sincronizar células, la técnica de anclaje para agotar las proteínas del núcleo y la microscopía de lapso de tiempo de fluorescencia para obtener imágenes de las células de levadura en ciernes durante la meiosis. El sistema NDT80-in es un método para la sincronización del ciclo celular meiótico que utiliza una profase I de detención y liberación 4,8. Aunque las células individuales variarán ligeram...

La microcopia de fluorescencia time-lapse es una herramienta valiosa para estudiar la dinámica de la segregación cromosómica meiótica en levaduras en ciernes 1,2. Las células de levadura en ciernes pueden ser inducidas a someterse a meiosis a través de la inanición de nutrientes clave3. Durante la meiosis, las células se someten a una ronda de segregación cromosómica seguida de dos divisiones para crear cuatro productos meióticos que se empaquetan en esporas (Figura 1). Las células individuales se pueden visualizar a lo largo de cada etapa de la meiosis, lo que genera datos espaciales y temporales que pueden pasarse por alto fácilmente mediante imágenes de células fijas. Este protocolo muestra cómo la combinación de microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo con dos métodos previamente establecidos, el sistema NDT80 inducible (NDT80-in) y la técnica de anclaje, se puede utilizar para estudiar la función de proteínas específicas en distintas etapas meióticas.
El sistema NDT80-in es una poderosa herramienta para la sincronización del ciclo celular meiótico que se basa en la expresión inducible del factor de transcripción de meiosis media NDT80 4,5. La expresión de NDT80 es necesaria para la salida 6,7 de la profase I. Con el sistema NDT80-in, NDT80 está bajo el control del promotor GAL1-10 en células que expresan el factor de transcripción Gal4 fusionado a un receptor de estrógeno (Gal4-ER)4,5. Debido a que Gal4-ER solo ingresa al núcleo cuando se une al β-estradiol, las células NDT80-in se detienen en la profase I en ausencia de β-estradiol, lo que permite la sincronización de las células en la profase I (Figura 1). β-estradiol promueve la translocación del factor de transcripción Gal4-ER en el núcleo, donde se une a GAL1-10 para impulsar la expresión de NDT80, lo que lleva a la entrada sincrónica en las divisiones meióticas. Aunque la microscopía de lapso de tiempo se puede realizar sin sincronización, la ventaja de usar la sincronización es la capacidad de agregar un inhibidor o un medicamento mientras las células se encuentran en una etapa específica de la meiosis.
La técnica de anclaje es un sistema inducible por el cual una proteína puede ser agotada del núcleo con la adición de rapamicina8. Esta técnica es ideal para estudiar las proteínas nucleares durante la división celular en levadura en ciernes porque las células de levadura sufren mitosis cerrada y meiosis, en las que la envoltura nuclear no se descompone. Además, esta técnica es muy útil para proteínas que tienen múltiples funciones a lo largo de la meiosis. A diferencia de las deleciones, alelos mutantes o alelos nulos meióticos, la eliminación de una proteína diana del núcleo en una etapa específica no compromete la actividad de la proteína diana en etapas anteriores, lo que permite una interpretación más precisa de los resultados. El sistema de anclaje utiliza el desplazamiento de subunidades ribosómicas entre el núcleo y el citoplasma que ocurre en la maduración ribosómica8. Para agotar la proteína diana del núcleo, la proteína diana se marca con el dominio de unión a rapamicina FKBP12 (FRB) en una cepa en la que la subunidad ribosómica Rpl13A se marca con FKBP12. Sin rapamicina, FRB y FKBP12 no interactúan, y la proteína marcada con FRB permanece en el núcleo. Tras la adición de rapamicina, la rapamicina forma un complejo estable con FKBP12 y FRB, y el complejo es expulsado del núcleo debido a la interacción con Rpl13A (Figura 1). Para prevenir la muerte celular tras la adición de rapamicina, las células albergan la mutación tor1-1 del gen TOR1 . Además, estas células contienen fpr1Δ , un alelo nulo de la proteína FKBP12 de S. cerevisiae , que evita que Fpr1 endógeno supere a Rpl13A-FKBP12 para la unión de FRB y rapamicina. Las mutaciones de fondo de anclaje, tor1-1 y fpr1Δ, no afectan a los tiempos meióticos ni a la segregación cromosómica2.
Para demostrar la utilidad de esta técnica, la proteína cinetocoro Ctf19 se agotó en diferentes puntos de tiempo a lo largo de la meiosis. Ctf19 es un componente del cinetocoro que es prescindible en la mitosis pero necesario para la segregación cromosómica adecuada en la meiosis 9,10,11,12,13. En la meiosis, el cinetocoro se desprende en la profase I, y Ctf19 es importante para el reensamblaje del cinetocoro 9,14. Para este protocolo, las células con el sistema NDT80-in se sincronizaron, y se utilizó la técnica de anclaje para agotar la proteína diana Ctf19 del núcleo antes y después de la liberación de la profase I, y después de la segregación del cromosoma I de la meiosis (Figura 1). Este protocolo se puede adaptar para agotar otras proteínas de interés en cualquier etapa de la meiosis y la mitosis.

<table><tbody><tr><td>&beta;-estradiol</td><td>Millipore Sigma</td><td>E8875</td><td>Fabrica 1 mM de existencias en 95% EtOH</td></tr><tr><td>0,22 uM Filtro roscado con tapa de botella</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2GPT02RE</td><td></td></tr><tr><td>100% EtOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-601</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399500</td><td>Diluir 1:10 para usar como disolvente para ConA</td></tr><tr><td>24 mm x 50 mm cubreobjetos n.º 1.5</td><td>VWR Portaobjetos de</td> microscopio <td>de 48393241</td><td></td>norteamericano</tr> de <tr><td>25 mm x 75 mm</td><td>VWR North American</td><td>48300-026</td><td></td></tr><tr><td>Sal de hemisulfato de adenina</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9126</td><td>Para complementar SC, SCA y 1% Kac</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>Concanavialin A</td><td>Mllipore Sigma</td><td>C2010</td><td>Hacer como 1 mg/mL en 1X Cámara CCD PBS</td></tr><tr><td>CoolSNAP HQ2</td><td>Fotometría</td><td></td><td>utilizada en la sección 4.3</td></tr><tr><td>D-glucosa</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-10</td><td></td></tr><tr><td>Difco Levadura Base de nitrógeno sin aminoácidos</td><td>BD</td><td>291920</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Millipore Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti2 micrscopio de objetivo invertido</td><td>Nikon</td><td></td><td>Utilizado en la sección 4.4</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>NIH</td><td></td><td>Descargar de https://fiji.sc/</td></tr> <tr><td>GE Personal DeltaVision Microscopio</td><td>Precisión Aplicada</td><td></td><td>Utilizada en la Sección 4.3</td></tr><tr><td>L-Triptófano&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>T0254</td><td>Para complementar SC, SCA y 1% Kac</td></tr><tr><td>Modeling Clay Crayola</td><td></td><td>&nbsp; 2302880000</td><td>Para asegurar el cubreobjetos en el soporte de portaobjetos</td></tr><tr><td>NIS-Elements AR 5.30.04 Software de imagen</td><td>Nikon</td><td></td><td>utilizado en la sección 4.4</td></tr><tr><td>ORCA-Fustion BT Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C15440-20UP</td><td>utilizado en la sección 4.4</td></tr><tr><td>Soporte de punta de pipeta de plástico</td><td>Dot Scientific</td><td>LTS1000-HR</td><td>Corte una sección de 4 cuadrados x 4 cuadrados de la parte del bastidor de este producto.</td></tr><tr><td>Acetato de potasio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP264</td><td></td></tr><tr><td>Rapamicina Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP29631</td><td>Hacer existencias de 1 mg / mL en DMSO</td></tr><tr><td>Sellador de silicona</td><td>Aqueon</td><td>100165001</td><td>También conocido como pegamento para acuarios.</td></tr><tr><td>SoftWorx7.0.0&nbsp; Software de imagen</td><td>aplicado a la precisión</td><td></td><td>utilizada en la sección 4.3</td></tr><tr><td>Mezcla completa sintética (Kaiser)&nbsp;</td><td>Para aceite de</td><td></td> inmersión DSCK2500 <td></td></tr><tr><td>medio tipo N&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MXA22166</td><td></td></tr></tbody></table>

uso de microscopía de lapso de tiempo y agotamiento nuclear de proteínas en etapa específica para estudiar la meiosis en s. cerevisiae

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

La microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo ha revolucionado la comprensión de los eventos del ciclo celular meiótico al proporcionar datos temporales y espaciales que a menudo no se ven al obtener imágenes de células fijas. La levadura en ciernes ha demostrado ser un organismo modelo importante para estudiar la segregación cromosómica meiótica porque muchos genes meióticos están altamente conservados. La microscopía de lapso de tiempo de la meiosis en levaduras en ciernes permite el monitoreo de diferentes mutantes meióticos para mostrar cómo la mutación interrumpe los procesos meióticos. Sin embargo, muchas proteínas funcionan en múltiples puntos de la meiosis. Por lo tanto, el uso de mutantes nulos meióticos o de pérdida de función puede interrumpir un proceso temprano, bloqueando o perturbando el proceso posterior y dificultando la determinación de los fenotipos asociados con cada rol individual. Para eludir este desafío, este protocolo describe cómo las proteínas pueden agotarse condicionalmente del núcleo en etapas específicas de la meiosis mientras se monitorean los eventos meióticos utilizando microscopía de lapso de tiempo. Específicamente, este protocolo describe cómo se sincronizan las células en la profase I, cómo se utiliza la técnica de anclaje para agotar las proteínas del núcleo en etapas meióticas específicas y cómo se utilizan las imágenes de lapso de tiempo para monitorear la segregación cromosómica meiótica. Como ejemplo de la utilidad de la técnica, la proteína cinetocoro Ctf19 se agotó del núcleo en diferentes puntos de tiempo durante la meiosis, y el número de masas de cromatina se analizó al final de la meiosis II. En general, este protocolo se puede adaptar para agotar diferentes proteínas nucleares del núcleo mientras se monitorean las divisiones meióticas.

Para controlar la segregación de la cromatina, la proteína histona Htb2 se marcó con mCherry. En la profase I, la cromatina aparece como una sola masa Htb2. Después de que los cromosomas homólogos se segregan en la primera división meiótica, la cromatina aparece como dos masas distintas (Figura 3A). Después de que las cromátidas hermanas se segregan, la cromatina aparece como cuatro masas. Si algunos cromosomas no se adhieren a los microtúbulos fusiformes, se pueden ver masas adicionales des...

La microscopía de lapso de tiempo es una herramienta valiosa para estudiar la meiosis en levaduras en ciernes. Este protocolo describe un método que combina la sincronización del ciclo celular, la microscopía de lapso de tiempo y el agotamiento condicional de una proteína diana para demostrar cómo estudiar la función de una proteína específica durante la segregación cromosómica meiótica.

Uso de microscopía de lapso de tiempo y agotamiento nuclear de proteínas en etapa específica para estudiar la meiosis en S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...

Al sincronizar las células en la profase uno y luego agotar la proteína diana en una etapa particular, este método puede identificar temporalmente funciones distintas de proteínas específicas. El agotamiento condicional de proteínas en etapas específicas de la miosis evita los efectos residuales que un mutante miótico tradicional puede tener en etapas posteriores. Este método podría usarse para estudiar la mitosis de levaduras en ciernes y otros organismos que no sufren la descomposición de la envoltura nuclear.Además, este método se puede utilizar en otros organismos para estudiar eventos del ciclo celular antes de la descomposición de la envoltura nuclear. Para comenzar, haga una almohadilla de agar que se utilizará para crear una monocapa de células para obtener imágenes. Corte y deseche la tapa y el fondo de un tercio de un tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros para crear un cilindro que servirá como molde para la almohadilla de agar.Coloque el cilindro del tubo de microcentrífuga cortado en un portaobjetos de vidrio limpio con la parte superior del tubo boca abajo, sentado en el portaobjetos. Haga seis mililitros de una solución de agar al 5% en un vaso de precipitados de 50 mililitros. Corte la punta de la pipeta para hacer una abertura más grande y pipete aproximadamente 500 microlitros de agar fundido en el tubo de microcentrífuga.Déjalo reposar a temperatura ambiente hasta que el agar se solidifique. Para preparar las células de levadura, gire 200 microlitros del cultivo de esporulación a 800 G durante dos minutos en tubos de microcentrífuga de un mililitro. Deseche 180 microlitros del sobrenadante.Vuelva a suspender el pellet en el sobrenadante restante girando y moviendo el tubo. Pipetear seis microlitros de las células concentradas en el cubreobjetos en el centro de la cámara en el lugar con ConA. Sostenga el cilindro con la almohadilla de agar y deslícelo con cuidado fuera del portaobjetos de vidrio.Asegúrese de que el agar esté completamente plano en la parte inferior y, utilizando la parte inferior de la punta de la pipeta, aplique una ligera cantidad de presión al molde de microcentrífuga de modo que la almohadilla de agar se empuje ligeramente por encima del límite del tubo. A continuación, invierta el molde de tal manera que la almohadilla de agar esté mirando hacia abajo hacia la cámara. Use pinzas para colocar suavemente la almohadilla de agar en la parte superior de las celdas y la punta de la pipeta para deslizar suavemente la almohadilla de agar alrededor de la cámara de 10 a 20 veces para crear una monocapa de células en el cubreobjetos.Mantenga la almohadilla de agar en la cámara durante 12 a 15 minutos. A continuación, transfiera dos mililitros de cultivo de esporulación a dos tubos de microcentrífuga y gire a 15, 700 G durante dos minutos. Después de transferir el sobrenadante a tubos de microcentrífuga limpios, gire nuevamente en la misma condición y recoja el sobrenadante para limpiar los tubos de microcentrífuga.Agregue dos mililitros del sobrenadante gota a gota a la cámara que contiene la almohadilla de agar. Una vez que el líquido ha alcanzado la parte superior de la cámara, lo más probable es que la almohadilla de agar flote. Retire la almohadilla de agar suavemente con fórceps y deséchela.Coloque un deslizamiento de cubierta de 24 por 50 milímetros en la parte superior de la cámara para evitar la evaporación durante la obtención de imágenes. Para configurar la película en el microscopio, coloque el cubreobjetos dentro del portaobjetos. Adhiera la arcilla de moldeo al lado del deslizamiento de la cubierta para mantenerla segura en el soporte de la corredera.Abra el software de adquisición de imágenes. Use perillas de ajuste gruesas y finas para enfocar las celdas usando DIC o campo brillante. En el menú principal del software de adquisición de imágenes, haga clic en Archivo, seleccione Adquirir y aparecerán cuatro ventanas.En la ventana llamada Resolve 3D, haga clic en el icono del matraz Erlenmeyer. Esto abrirá una ventana titulada Design Run Experiment, que contiene los controles para configurar un experimento para configurar una película de lapso de tiempo. En la pestaña Diseño, navegue hasta la pestaña etiquetada Secciones.Seleccione la casilla situada junto a Sección Z y establezca el espaciado de la sección óptica en un micrómetro y el número de secciones ópticas en cinco. A continuación, en la pestaña Canales, haga clic en el icono más y seleccione el canal apropiado. Luego, seleccione la casilla junto a Imagen de referencia y establezca la posición Z en el centro de la muestra en el menú desplegable.Seleccione un valor de transmitancia y tiempo de exposición en el menú desplegable. En la pestaña Time-lapse, seleccione la casilla junto a Time-lapse e introduzca valores para minutos y horas para identificar el intervalo de tiempo de adquisición de imágenes. Selecciona la casilla situada junto a Mantener el enfoque con Ultimate Focus para evitar la desviación del escenario durante la película.Y en la pestaña Puntos, seleccione la casilla junto a Lista de puntos de visita. En el menú principal, haga clic en Ver y seleccione Lista de puntos. Mueva el escenario a un área de la cámara que muestre una monocapa de celdas.Haga clic en Marcar punto en la ventana Lista de puntos. Mueva el escenario para seleccionar de 25 a 30 puntos sin ninguna superposición para evitar sobreexponer las celdas y crear una imagen de cada campo durante cada curso de tiempo. En la ventana Lista de puntos, seleccione Calibrar todo para establecer el enfoque definitivo para cada punto.En la pestaña Ejecutar, guarde el archivo en el destino apropiado en el equipo. En la ventana Ejecutar experimento, seleccione el botón Reproducir para iniciar la película. Abra el software Fiji.Abra los canales DIC y mCherry. Obtenga una única proyección de intensidad máxima del canal mCherry haciendo clic en Imagen, seguido de Pilas y Proyecto Z y seleccione Intensidad máxima en el menú desplegable. Para combinar los canales DIC y mCherry en una sola imagen, haga clic en Imagen, Color y seleccione Combinar canales.Siga una sola célula a través de la meiosis. Después de completar la meiosis II, registre el número de masas de ADN. En las células de tipo salvaje con el fondo de anclaje, hay típicamente cuatro masas de ADN al final de la meiosis II, que representan los cuatro productos de la meiosis.Cuando Ctf19-FRB se ancla en el momento de la liberación de la profase I, aproximadamente el 47% de las células muestran más de cuatro masas de ADN al finalizar la meiosis, lo que sugiere un defecto en la unión de cinetocoros y microtúbulos. Con el anclaje de Ctf19-FRB, ya sea después del ensamblaje del cinetocoro pero antes de la meiosis I, o después de la meiosis II, aproximadamente el 16% de las células muestran masas de ADN adicionales. Una de las partes más importantes de este protocolo es agregar el sobrenadante gota a gota a su cámara para evitar interrumpir su monocapa.Además, tenga en cuenta el tiempo requerido para prepararse para las imágenes para considerarlo en su análisis. Al cambiar las proteínas empaquetadas con fluorescencia, este procedimiento se puede utilizar para responder a las preguntas sobre la duración del ciclo celular, la segregación cromosómica, la abundancia de proteínas y la localización de proteínas.

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