Una microsonda de radiometría intratisular para medir la radiación in situ en tejido vivo

Este protocolo es significativo porque simplifica y permite mediciones de radiancia en materiales gruesos, lo que nos permite recopilar información importante al estudiar sistemas vivos. La principal ventaja de esta técnica es que permite mediciones espectrales resueltas espacialmente en materiales altamente absorbentes utilizando equipos que se pueden construir y experimentos que se pueden ejecutar en laboratorios de campo. Este método se puede adaptar y aplicar a cualquier sistema vivo.

La técnica de hacer las sondas es matizada, pero la práctica hace al maestro. Ajuste la técnica de medición dependiendo del material que se está sondeando y realice cambios que resulten en una posición más segura del tejido y una menor fricción de la sonda. Para comenzar a construir la funda de vidrio con una pipeta Pasteur de 5,75 pulgadas.

Con una pinza de cocodrilo montable, monte la pipeta de vidrio por el extremo ancho de modo que el extremo cónico quede hacia el suelo y la orientación de la pipeta sea perpendicular al suelo. Coloque una almohadilla de cinta aislante en una empuñadura de plástico de 50 gramos para ayudar a evitar el deslizamiento y cuelgue la empuñadura del extremo cónico de la pipeta. Con una pequeña antorcha de butano, caliente el extremo cónico de la pipeta como se describe en el manuscrito.

Cuando la longitud de la pipeta haya aumentado en aproximadamente cinco pulgadas, retire inmediatamente la llama. A continuación, use tijeras pequeñas o un cortador de vidrio para recortar el extremo tirado de la pipeta. Lima cualquier área afilada del extremo recortado con papel de carborundo y enjuaga cualquier pequeño fragmento de vidrio o polvo con alcohol isopropílico seguido de aire comprimido.

Use una cuchilla de afeitar para cortar la fibra óptica y retire un conector SMA de una fibra óptica terminada en SMA. Asegúrese de cortar cerca de una de las terminaciones SMA. Luego retire los siguientes cinco centímetros de revestimiento de plástico y fibra de vidrio para que la fibra óptica desnuda quede expuesta y sobresalga del resto de todo el conjunto.

Use la antorcha de butano para quemar el recubrimiento de polímero de poliamida de la fibra de vidrio. Enjuague con isopropanol y limpie la fibra de vidrio desnuda con una toallita sin pelusa. Ahora monte el extremo desnudo de la fibra óptica directamente en una abrazadera de alicates en el borde de una mesa o estante, dejando que el extremo de la fibra con terminación SMA cuelgue hacia el piso.

Alrededor de cuatro a seis pulgadas de donde se sostiene la fibra óptica desnuda en la abrazadera de alicate, agregue los pesos para tirar usando dos abrazaderas pequeñas en el extremo encamisado de la fibra. Para tirar de la fibra, comience con la llama de la antorcha de butano encendida. Sostenga la antorcha de butano a un centímetro de la fibra desnuda como se describe en el manuscrito.

Y permita que la fibra se estire, tire, se separe y caiga al suelo. Revise la fibra bajo el microscopio y recorte el extremo de la fibra con tijeras de disección pequeñas si es necesario. Utilice un bolígrafo opaco de espuma para oscurecer los lados de la fibra y evitar la entrada de luz parásita.

Tire suavemente de la punta de la pluma a través de la fibra, dejando solo una pequeña área en la punta descubierta. Bajo un microscopio estéreo, inserte cuidadosamente la fibra óptica cónica en el extremo ancho de la pipeta de vidrio alterada y empuje la fibra hasta que sobresalga aproximadamente un milímetro de fibra desnuda del extremo cónico de la pipeta. Con cinta aislante, fije el extremo encamisado de la fibra óptica al extremo ancho de la pipeta.

Ponga una gota de adhesivo de cianoacrilato en una aguja de calibre pequeño. Toque con cuidado la gota de adhesivo en el borde cortado de la pipeta tirada, evitando el extremo desnudo de la fibra tirada. Para modificar la punta de fibra con una esfera de dispersión, cree la materia prima mezclando una gota de adhesivo curable UV con polvo de dióxido de titanio en una proporción igual.

Fije la sonda a un micromanipulador con un soporte de varilla de montaje de modo que la sonda esté en orientación horizontal. Prepare un depósito de trabajo del material de dispersión sumergiendo la punta de un alambre o aguja en la mezcla preparada de tal manera que se forme una gota de adhesivo. Monte el alambre o la aguja con la gota cerca de la punta de la sonda horizontal.

Deposite una esfera de dispersión en la punta de la sonda. Utilice el micromanipulador para empujar la punta de la fibra óptica de la sonda lenta y cuidadosamente en la mezcla preparada. Luego, rápidamente retiraría la punta del pegamento y vería la bola de dispersión en un microscopio.

Repita hasta que se deposite una gota esférica de adhesivo del tamaño deseado en la punta de la fibra óptica. Preparar los platos para montar las muestras. Con una antorcha de butano, caliente el extremo grande de una pipeta Pasteur para derretir un orificio de 0,5 centímetros de diámetro en el fondo de una placa de Petri de plástico.

Selle el agujero en la parte inferior del plato con cinta aislante o cinta de laboratorio. Luego llene una placa de Petri un cuarto del camino y una segunda placa de Petri completamente con la gelatina líquida y déjela enfriar a temperatura ambiente justo antes de la gelificación. En un plato, coloque la biopsia en el cojín de gelatina viscosa que se formó en el orificio en el fondo del plato.

Con una pipeta Pasteur, agregue suavemente gelatina a temperatura ambiente alrededor de la biopsia hasta que la placa de Petri esté llena. Para la muestra en blanco, use el plato lleno de gelatina solamente. Fije la sonda a un soporte orientado verticalmente de modo que apunte hacia la fuente de luz y asegure la sonda con abrazaderas, abrazaderas de manguera o cinta a un poste de mesa óptico.

Conecte el extremo terminado en SMA de la fibra óptica de la sonda a un espectrómetro de fibra óptica USB y conecte el espectrómetro a la computadora con un cable USB. Mantenga la sonda y los manipuladores en la posición exacta alineada donde se recopilarán los datos. Use un hisopo de algodón, una aguja de calibre fino o un gotero para aplicar cuidadosamente una pequeña cantidad de lubricante de silicona en la parte de la sonda que se insertará en el tejido para reducir la fricción entre los lados de la sonda y la muestra de tejido.

Ahora, retire la cinta que cubre el orificio en la placa de Petri de muestra y colóquela en el soporte de muestra, asegurándose de que se mantenga firmemente en su lugar por fricción. Utilice el micromanipulador para bajar la muestra sobre la sonda y permitir que la sonda entre en la gelatina a través del orificio en la parte inferior de la placa de Petri. Continúe hasta que la sonda esté aproximadamente a cinco milímetros de la parte inferior de la capa de gelatina.

Encienda la fuente de luz. Usando el software del espectrómetro, ajuste el tiempo de integración del espectrómetro hasta que la señal sea lo más alta posible, pero no saturada. Establezca el número de escaneos promedio entre dos y cinco, y el valor de los píxeles de suavizado en seis.

Los tiempos de integración utilizables en esta etapa pueden variar entre uno y 15 milisegundos para esta línea base. Verifique que el tiempo de integración sea apropiado para la medición asegurándose de que el espectro no sea demasiado ruidoso ni saturado. Cambie el tiempo de integración si es necesario.

Mueva la muestra hacia abajo una distancia especificada utilizando el micromanipulador y realice las mediciones. Continúe guardando los espectros en cada posición vertical dentro del tejido. Se visualiza la apariencia microscópica de la sonda que sube a través del tejido.

Se muestra el porcentaje de luz a diferentes profundidades de tejido en relación con la línea de base. Lo más importante que debe recordar es que estas sondas son frágiles, así que tómese su tiempo y asegúrese de que las uniones de la sonda sean seguras antes de continuar. Después de hacer la sonda, se pueden adaptar las técnicas de medición.

Por ejemplo, sin la bola de dispersión, las sondas se pueden usar para medir la radiación que llega al detector desde una sola dirección. Después de desarrollar esta sonda, los investigadores pudieron medir la luz dentro del cerebro y el tejido adiposo en ratones utilizando una variación en nuestro aparato de medición. Esto ayudó a responder a la pregunta de si había suficiente luz para activar los fotorreceptores presentes en lo profundo del tejido.