Name: Diferenciación e imagen de adipocitos marrones de la fracción vascular estromal de tejido adiposo interescapular de ratones recién nacidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T13:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 46 s
Description: Aprende a diferenciar adipocitos marrones a partir de tejido adiposo interescapular de ratones recién nacidos. Este protocolo permite estudiar la adipogénesis y la termogénesis con aplicaciones en investigación sobre obesidad y metabolismo energético.

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El financiamiento fue aportado por FONDECYT (1181214 y 1221146) y Anillos (ACT210039) para las becas de VC y doctorado ANID 21171743 a AMF y ANID 21150665 a FS. Agradecemos a Alejandro Munizaga por su ayuda en el procesamiento de las muestras y el asesoramiento técnico para la microscopía electrónica de transmisión. Las ilustraciones fueron producidas usando BioRender.

Los procedimientos con animales fueron aprobados por la Comisión Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Pontificia Universidad Católica de Chile. Para este estudio se utilizaron ratones recién nacidos P0,5 de ambos sexos, derivados de un fondo mixto de cepas C57BL/6J y 129J.
1. Extracción de tejidos
<ol><li>Limpie y desinfecte el banco de trabajo con una solución de etanol al 70% y utilice material quirúrgico estéril.</li>
	<li>Eutanasiar a los cachorros recién nacidos P0.5 por decapitación con tijeras quirúrgicas siguiendo el protocolo aprobado institucionalmente.</li>
	<li>Coloque al ratón en posición prona (boca abajo) y haga una incisión de 1 cm de largo en la piel a la altura media de la espalda del animal con unas tijeras afiladas. Retire la piel con cuidado. NOTA: Este paso es crítico porque si la piel no se elimina bien, podría desgarrarse y dañar el iBAT e impedir la preparación óptima de la SVF.</li>
	<li>Separe quirúrgicamente el iBAT de la carcasa con unas tijeras pequeñas. NOTA: El iBAT se visualiza como dos lóbulos grasos que se pueden extirpar de forma independiente.</li>
	<li>Coseche ambos lóbulos de iBAT utilizando alicates de punta curva para eliminar los lóbulos de forma independiente.</li>
	<li>Coloque los dos lóbulos en un tubo de plástico con 1,5 mL de PBS estéril a temperatura ambiente. Mantenga los tejidos en sus tubos individuales hasta que se complete la extracción de tejido para todas las crías necesarias.</li>
</ol>2. Digestión de tejidos
<ol><li>Alícuota 300 μL de tampón de digestión colagenasa tipo II (colagenasa tipo II al 0,2% en tampón [25 mM KHCO3, 1,2 mM MgSO4, 120 mM NaCl, 5 mM glucosa, 12 mM KH2PO4, 4,8 mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 2,5% BSA y 1% penicilina/estreptomicina, a pH 7,4]) (Tabla 1) en tubos de 1,5 mL en una cabina de bioseguridad. NOTA: Prepare suficientes tubos para el número de tejidos individuales que se van a extraer. En el presente estudio se utilizaron siete tubos, correspondientes a una camada de siete crías.</li>
	<li>Muévase al banco y coloque los lóbulos de iBAT en el tampón de digestión de colagenasa tipo II para degradar la matriz extracelular.</li>
	<li>Incubar los tejidos iBAT durante 45 min a 37 °C con una agitación suave y continua a 800 rpm (Figura 1).</li>
</ol>3. Procesamiento de tejidos
NOTA: Después de la digestión, realice todos los pasos siguientes en una campana de cultivo de tejidos de flujo laminar de clase II.
<ol><li>Prepare y etiquete dos juegos de tubos de plástico de 1,5 ml para cada muestra individual.</li>
	<li>Interrumpa mecánicamente la suspensión tisular en el tampón de digestión de colagenasa tipo II pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una micropipeta P1.000 y puntas filtradas. Utilice una nueva punta para cada muestra. NOTA: Este es un paso crítico. Asegúrese de desagregar mecánicamente el tejido con la punta y pipetear hacia arriba y hacia abajo hasta que se complete la homogeneización macroscópica.</li>
	<li>Pase los tejidos disgregados a través de filtros de células individuales de 100 μm (consulte la Tabla de materiales) a nuevos tubos de 1,5 mL.</li>
	<li>Añada 500 μL de tampón ACK (consulte la Tabla de materiales) a las muestras de tejido filtradas, invierta los tubos 4-5 veces e incube a temperatura ambiente durante 4 minutos. NOTA: No exceda el tiempo de incubación, ya que esto puede dañar las celdas de interés.</li>
	<li>Centrifugar las muestras de tejido a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante invirtiendo el tubo y vuelva a suspender el pellet en 1 mL de medio de cultivo (DMEM-F12 con 10% de FBS, 1% antibiótico antimicótico, pH 7,2) (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Pase las suspensiones a través de un filtro de células de 40 μm a nuevos tubos de 1,5 ml utilizando una micropipeta P1.000 y puntas filtradas.</li>
	<li>Centrifugar las muestras a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente. NOTA: El pellet corresponde a la SVF que contiene preadipocitos.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante invirtiendo el tubo y vuelva a suspender el pellet en 1 mL de medio de cultivo mediante pipeteo.</li>
	<li>Prepare un tubo de 15 mL para cada muestra añadiendo 5 mL de medio de cultivo.</li>
	<li>Agregue cada pellet resuspendido a su tubo correspondiente de 15 mL que contenga 5 mL de medio de cultivo. Invierta el tubo 4-5 veces para mezclar el contenido de la celda.</li>
	<li>Siembre cada muestra en seis pocillos de una placa de cultivo de 24 pocillos agregando 1 mL de la suspensión a cada pocillo (Figura 1).</li>
</ol>4. Cultivo de fracción vascular estromal (FSV)
<ol><li>Cambie el medio de cultivo cada dos días hasta que las células alcancen el 100% de confluencia. NOTA: Durante este período, se eliminan las células adherentes no plásticas, lo que da como resultado un cultivo primario enriquecido con una SVF que contiene preadipocitos.</li>
	<li>Cuando las células sean 100% confluentes, retire el medio de cultivo y lave las células con 800 μL de PBS estéril.</li>
	<li>Añadir 150 μL de tripsina-EDTA al 0,25% (ver la Tabla de Materiales) a cada pocillo, y colocar la placa de cultivo durante 3 min en la incubadora para el desprendimiento de las células. NOTA: Verifique que las células estén separadas utilizando un microscopio óptico de contraste de fase.</li>
	<li>Inactivar la tripsina añadiendo 850 μL de medio de cultivo a cada pocillo.</li>
	<li>Recoja las células de los seis pocillos sembrados en el paso 3.12 y transfiéralas a un tubo de 15 ml.</li>
	<li>Haga que el volumen total sea de hasta 12 mL agregando 6 mL de medio de cultivo. Invierta el tubo 4-5 veces para mezclar el contenido.</li>
	<li>Siembre 1 mL de la muestra en cada pocillo de una placa de 12 pocillos. Cambie el medio de cultivo cada dos días hasta que las células alcancen la confluencia.</li>
	<li>Cuando las células sean 100% confluentes, separarlas con 150 μL de tripsina-EDTA al 0,25% siguiendo las mismas condiciones de incubación que en el paso 4.3, y sembrarlas de acuerdo con la superficie del pocillo requerida para el experimento.</li>
	<li>Realice imágenes de alta resolución después de fijar las celdas siguiendo el paso 8. NOTA: Se recomienda una densidad de 35.000 células/cm² para experimentos posteriores (extracción de proteínas y ARN total, 330.000 células [un pocillo de una placa de 6 pocillos]; inmunofluorescencia [IF], 10.500 células [un pocillo de una placa de 96 pocillos]).</li>
</ol>5. Diferenciación adipogénica
<ol><li>Incubar las células con medio de inducción (DMEM-F12 con 10% de FBS, 1% antibiótico antimicótico, pH 7,2, suplementado con 500 nM de dexametasona, 125 nM de indometacina, 0,5 mM de 3-isobutil-1-metilxantina [IBMX], 5 μM de rosiglitazona, 1 nM de T3 y 20 nM de insulina) (Tabla 1) durante 72 h (día 0 a día 2) (Figura 2). NOTA: El medio de cultivo debe cambiarse cada dos días; Por lo tanto, el primer cambio de medio debe ocurrir el día 2 después de la inducción inicial.</li>
	<li>Cambio a medio de mantenimiento (DMEM-F12 con 10% de FBS, 1% antibiótico antimicótico, pH 7,2, suplementado con 5 μM de rosiglitazona, 1 nM T3 y 20 nM de insulina) (Tabla 1) al día 3, y mantener este medio de mantenimiento hasta el día 7 (Figura 2). NOTA: El medio de mantenimiento debe cambiarse el día 5 y el día 7. Pequeñas gotas de lípidos se pueden visualizar mediante microscopía de contraste de fase a partir del día 3 de diferenciación. Las gotas lipídicas grandes son evidentes en el día 7 de diferenciación. Los procedimientos de diferenciación de más de 7 días dan lugar a la pérdida de células por desprendimiento, probablemente debido a la alta flotabilidad de las células cargadas de lípidos.</li>
</ol>6. Preparación de homogeneizado celular
<ol><li>Retirar el medio de cultivo en el día 0 y el día 7 de diferenciación, y lavar las células 3 veces con PBS estéril.</li>
	<li>Después de la última limpieza, agregue 1,3 mL de PBS estéril a cada pocillo. NOTA: Mantenga las celdas en hielo hasta la limpieza de la última placa.</li>
	<li>Coseche las células mecánicamente de un pocillo de una placa de 6 pocillos (~330.000 células) con un raspador de células y coloque la suspensión celular en un tubo de 1,5 ml.</li>
	<li>Centrifugar las muestras a 2.800 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Retire el PBS con una micropipeta y mantenga los tubos en hielo.</li>
	<li>Resuspender el pellet celular en tampón RIPA con inhibidores de la proteasa y la fosfatasa (ver la Tabla de Materiales), e incubar durante 30 min en hielo. NOTA: Para lisar el pellet celular, 70-80 μL son suficientes.</li>
	<li>Centrifugar las muestras a 21.000 x g durante 15 min a 4 °C.</li>
	<li>Retire con cuidado el sobrenadante a un tubo de 1,5 ml y deseche el pellet. NOTA: El sobrenadante representa el homogeneizado celular.</li>
	<li>Determinar la concentración proteica del homogeneizado celular utilizando ácido bicinconínico (BCA) para la detección colorimétrica y cuantificación de la proteína total18,19.</li>
</ol>7. Western blot
<ol><li>Prepare 30 μg del homogeneizado celular (a partir del paso 6.8) y añada el tampón de carga de muestras SDS-PAGE disponible en el mercado (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Resolución en electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS20 (PAGE-SDS) según el peso molecular de cada proteína. NOTA: Utilice un 10 % de PAGE-SDS para PPARγ, C/EBPα, PLIN1, CD36 y UCP1, un 12 % de PAGE-SDS para OXPHOS y un 15 % de PAGE-SDS para TOM20 (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Electrotransferir las proteínas a la membrana de PVDF (ver la Tabla de Materiales) a 350 mA durante 2 h. NOTA: El recipiente de hielo debe cambiarse después de 1 h. Durante todo el proceso, mantenga la cámara en hielo.</li>
	<li>Bloquear las membranas con BSA al 5% o leche descremada en solución salina tamponada Tris (TBS) 0,1% Tween 20 (TBS-T) durante 2 h siguiendo las recomendaciones de las fichas técnicas de los anticuerpos.</li>
	<li>Incubar con los anticuerpos primarios (los anticuerpos utilizados en este estudio se detallan en la Tabla de Materiales) durante la noche a 4 °C. NOTA: Todos los anticuerpos utilizados en este estudio se diluyeron a 1:1.000 en solución bloqueante.</li>
	<li>Lavar las membranas 3 veces con TBS-T al 0,1% e incubarlas con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (ver la Tabla de Materiales) durante 2 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar las membranas 3 veces con 0,1%. TBS-T. Realice un último lavado con 1x TBS. Guarde las membranas en 1x TBS hasta la visualización. Se recomienda almacenar durante un máximo de 1 h.</li>
	<li>Visualice las membranas por quimioluminiscencia20 o cualquier otro método preferido.</li>
</ol>8. Imágenes de alta resolución
<ol><li>Realice el ensayo de inmunofluorescencia siguiendo los pasos que se indican a continuación.<ol><li>Siembre y diferencie los cultivos primarios de preadipocitos marrones de ratones recién nacidos P0.5 (siguiendo el paso 4.8) en placas de 96 pocillos con fondo óptico (consulte la Tabla de materiales).</li>
		<li>Fijar las células en el día 0 y el día 7 de diferenciación con PFA al 4% durante 20 min, y lavar 3 veces con PBS estéril.</li>
		<li>Permeabilizar las células con Triton X-100 al 0,1% durante 15 min, y bloquearlas con gelatina de pescado al 3% (ver la Tabla de Materiales) durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lavar 3 veces con PBS estéril e incubar con el anticuerpo PLIN1 (1:400, ver la Tabla de Materiales) en BSA/PBS al 1% durante la noche a 4 °C en una cámara húmeda.</li>
		<li>Lavar 3 veces con PBS estéril e incubar con anticuerpo secundario conjugado con fluoróforos a 1:1.000 (1% BSA/PBS) (ver la Tabla de Materiales) durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Teñir los núcleos con 1 μg/mL de Hoechst 33342 y las gotas de lípidos con 1 μg/mL de BODIPY durante 30 min a temperatura ambiente. NOTA: Las imágenes de fluorescencia se adquirieron utilizando un sistema de imágenes celulares (consulte la Tabla de materiales). En total, se adquirieron 9 o 16 fotos por pocillo con dos o tres canales con un aumento de 20x.</li>
	</ol></li>
	<li>Realice la microscopía electrónica de transmisión siguiendo los pasos que se indican a continuación.<ol><li>Cultivar y diferenciar los preadipocitos marrones en placas de cultivo celular de 35 mm x 10 mm.</li>
		<li>En el día 0 y el día 7 de diferenciación, retire el medio y fije las células durante 1 h con glutaraldehído al 2,5% en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M, pH 7,0 (ver la Tabla de Materiales).</li>
		<li>Lavar las células 3 veces con tampón de cacodilato de sodio 0,05 M durante 10 min, y tratarlas con tetróxido de osmio acuoso al 1% (ver la Tabla de Materiales) durante 15 min.</li>
		<li>Lave las células 3 veces con agua bidestilada durante 5 minutos y trátelas con acetato de uranilo acuoso al 1% (consulte la Tabla de materiales) durante 15 minutos.</li>
		<li>Deshidrate las células con un gradiente de etanol del 30%, 50%, 70%, 95% y 100% durante 5 minutos cada vez.</li>
		<li>Pre-embobe las celdas en epon/etanol 1:1 durante 30 min y luego en epon durante 1 h (ver la Tabla de Materiales). NOTA: La inclusión de las células se realiza directamente en la placa mediante la adición de epón fresco para cubrir toda la monocapa del cultivo celular. Deje que el epón polimerice en un horno a 60 °C durante 24 h.</li>
		<li>Sumerja la placa de cultivo celular en nitrógeno líquido durante 2 minutos y luego rómbrala con unos alicates para aflojar la inclusión de plástico.</li>
		<li>Pegar los segmentos de inclusión con celdas a un bloque de resina para obtener cortes finos (80 nm) paralelos a la superficie en un ultramicrótomo (ver la Tabla de Materiales).</li>
		<li>Teñir los cortes con acetato de uranilo acuoso al 1% durante 4 min y citrato de plomo durante 5 min, según Reynolds et al.21.</li>
		<li>Visualice las rejillas en un microscopio electrónico (consulte la Tabla de materiales).</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Fayyad, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosiglitazone+enhances+browning+adipocytes+in+association+with+MAPK+and+PI3-K+pathways+during+the+differentiation+of+telomerase-transformed+mesenchymal+stromal+cells+into+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Rosiglitazone enhances browning adipocytes in association with MAPK and PI3-K pathways during the differentiation of telomerase-transformed mesenchymal stromal cells into adipocytes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), 1618-1633 (2019).</li>
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<li>Guennoun, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+characterization+of+human+adipocytes+reveals+a+transient+brown+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular characterization of human adipocytes reveals a transient brown phenotype.</a> Journal of Translational Medicine. 13, 135(2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El presente protocolo es un procedimiento de diferenciación en dos fases simple y replicable (Figura 2) para generar células con las características moleculares y morfológicas de los adipocitos marrones maduros. La extracción quirúrgica del iBAT es el primer paso crítico, ya que el desgarro del tejido limita gravemente la viabilidad del material de partida. El procesamiento de tejidos también es clave porque una suspensión celular homogénea que está libre de residuos aumenta en gran medida l...

El tejido adiposo blanco y marrón difiere en su ubicación anatómica, origen celular, función, morfología y masa total. El tejido adiposo blanco (WAT) es el principal reservorio de energía fisiológica del cuerpo y almacena grandes cantidades de triacilglicerol (TAG) en células altamente especializadas que tienen una sola gota de lípidos gigante que ocupa la mayor parte desu volumen celular. La lipólisis de TAG libera ácidos grasos libres, que entran en la circulación sistémica para satisfacer las demandas energéticas durante el ayuno u otros estados de balance energético negativo. Además, el WAT segrega proteínas y productos lipídicos, llamados adipocinas e lipoquinas, respectivamente, que tienen funciones reguladoras metabólicas, inmunológicas y reproductivas, lo que convierte al WAT en el tejido endocrino más grandedel cuerpo.
El tejido adiposo marrón (BAT) es un órgano mucho más pequeño cuya principal función fisiológica es la termogénesis sin escalofríos para prevenir la hipotermia. En ratones y humanos recién nacidos, BAT es un órgano bien definido ubicado en el espacio interescapular. Los seres humanos adultos carecen de BAT interescapular (iBAT); sin embargo, desarrollan grupos de células pardas similares a los adipocitos integradas en depósitos que, de otro modo, comprenden principalmente WAT. Estos adipocitos "marrones en blanco" (brite) comparten características morfológicas y moleculares con los adipocitos iBAT clásicos, pero tienen un origen celular diferente 3,4.
A diferencia de los adipocitos blancos, los adipocitos marrones tienen múltiples gotas lipídicas pequeñas y abundantes mitocondrias5. La proteína de desacoplamiento 1 (UCP1, también conocida como termogenina) se expresa de manera única por los adipocitos marrones y britos y media la fuga de protones en la membrana mitocondrial interna (IMM), desacoplando así el transporte de electrones de la síntesis de ATP y generando calor. La termogénesis sin escalofríos en BAT es activada por la norepinefrina (NE), que se libera de los terminales simpáticos en el BAT en respuesta a la estimulación del frío6. La NE se une a los receptores beta-adrenérgicos (principalmente beta 3) en la superficie de los adipocitos marrones y desencadena una cascada de señalización intracelular mediada por AMPc. Esto da lugar a la lipólisis de TAG, la beta-oxidación de los ácidos grasos mitocondriales y la generación de calor tras la activación de UCP13. La estrecha relación funcional entre las gotas de lípidos y las mitocondrias en los adipocitos marrones tiene paralelismos estructurales, como la interacción entre estos orgánulos en áreas que son grandes y tienen un contacto físico muy estrecho 7,8.
El iBAT tiene abundantes vasos sanguíneos y terminales simpáticos9. Estas estructuras, junto con los preadipocitos, las células inmunitarias, los fibroblastos y las moléculas de la matriz extracelular, componen la fracción vascular del estroma adiposo (FSV)10. Se ha reportado que muchos protocolos generan adipocitos maduros a partir de preadipocitos 11,12,13,14,15 (Tabla Suplementaria 1); Sin embargo, muestran variaciones extremas en el procesamiento de los tejidos y en la composición de los medios de cultivo de diferenciación. El protocolo descrito en este documento permite la diferenciación eficiente y reproducible de adipocitos marrones que (1) expresan los factores de transcripción adipogénicos clave receptor gamma activado por proliferador de peroxisomas (PPARγ) y CCAAT/proteína de unión al potenciador alfa (C/EBPα), (2) expresan los marcadores de adipocitos maduros perilipina1 (PLIN1) y el determinante del clúster 36 (CD36), (3) acumulan abundantes gotas de lípidos, (4) tienen una alta masa mitocondrial y una alta abundancia de complejos OXPHOS, (5) tienen potencial termogénico, determinado por altos niveles de UCP1, y (6) tienen cambios morfológicos mitocondriales asociados con el fenotipo de los adipocitos marrones maduros. Esta metodología se utiliza para el estudio de los mecanismos moleculares que subyacen a la lipodistrofia generalizada 15,16,17.

<table><tbody><tr><td>10x Tampón de Tris/Glicina</td><td>BioRad</td><td>1610734</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehído Solución acuosa</td> Ciencias <td>de la Microscopía Electrónica</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Tratado TC Estilo Fácil Agarre Placa de cultivo celular</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>3-isobutil-1-metilxantina (IBMX)</td><td>Calbiochem</td><td>410957</td><td></td></tr><tr><td>40% Solución de acrilamida/Bis, 37,5:1</td><td>BioRad</td><td>1610148</td><td></td></tr><tr><td>placa de 6 pocillos&nbsp;</td><td>SPL Ciencias de la Vida&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr>Escalera de proteínas preteñida <tr><td>Thermo Scientific</td><td>165305</td><td></td>AccuRuler RGB Plus <td>estéril de 96 pocillos ópticos con cultivo de células estériles</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Maestrogen</td><td>02102-250</td><td></td></tr><tr><td>ACK tampón de lisado&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1610700</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-antimicótico</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>15240062</tr><tr><td>Anti-ratón IgG, anticuerpo ligado a HRP</td><td>Señalización</td> celular <td>7076</td><td></td></tr><tr><td>Anti-conejo IgG, anticuerpo ligado a HRP&nbsp; &nbsp;</td><td>Cell Signaling</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>Bloqueador de grado secante&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>BODIPY 493/503&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>D3922</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1470</td><td></td></tr><tr><td>C/EBP&alpha; anticuerpo</td><td>Señalización Celular</td><td>2295</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Calbiochem&nbsp;</td><td></td><td></td>208291</tr><tr><td>anticuerpo CD36</td><td>Invitrogen</td><td>PA1-16813</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 100 &micro; m, nylon</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 40 &micro; m, nylon</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa tipo II</td><td>Gibco</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>Citación 5 Lector multimodo de imágenes celulares</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, polvo</td><td>Gibco</td><td>12500062</td><td></td></tr><tr><td>EMBed-812 KIT DE INCRUSTACIÓN (Epon)</td><td>Ciencias de Microscopía Electrónica</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Merck&nbsp;</td><td>100983&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de piel de pescado de agua fría</td><td>Sigma</td><td>G7041</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15023-021</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído 25% Solución acuosa</td><td>Ciencias de Microscopía Electrónica</td><td>16210</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario de adsorción cruzada IgG (H + L) anti-conejo de cabra, Alexa Fluor 594</td><td>Life Technologies</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidor de fosfatasa Halt 100X&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>78427</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasa Halt 100X&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Invitrogen</td><td>H1398</td><td></td></tr><tr><td>Immun-Blot Membrana PVDF&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1620177</td><td></td></tr><tr><td>Indometacina&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>I7378&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Insulina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I3536</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Calbiochem&nbsp;</td><td></td><td></td>529552</tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Calbiochem</td><td>529568</td><td></td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma</td><td>60339</td><td></td></tr><tr><td>Tampón reductor de muestras de marcador de carril&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>39000</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ estéril de agua&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Mitoprofile Total OXPHOS Roedor WB anticuerpo Cóctel</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>MS604</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck&nbsp;</td><td></td><td></td>1064041000</tr><tr><td>OmniPur&nbsp; 10x Concentrado líquido PBS</td><td>Calbiochem</td><td>6505-OP</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de osmio&nbsp;</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>19100</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de perilipina 1</td><td>Señalización celular</td><td>9349</td><td></td></tr><tr><td>PPAR&gamma; (81B8) anticuerpo</td><td>Cell Signaling</td><td>2443</td><td></td></tr><tr><td>RIPA tampón lysis&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Merck</td><td>557366</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Cacpdilato de Sodio</td><td>Ciencias de Microscopía Electrónica</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sodio &nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1610301</td><td></td></tr><tr><td>T3</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Talos F200C G2</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEMED&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1610800</td><td></td></tr><tr><td>TOM20 anticuerpo</td><td>Señalización celular</td><td>42406</td><td></td></tr><tr><td>Tris solución salina tamponada (TBS-10X)</td><td>Señalización celular</td><td>12498</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20, Grado de Biología Molecular</td><td>Promega&nbsp;</td><td>H5152</td><td></td></tr><tr><td>UCP1 anticuerpo</td><td>Señalización celular</td><td>14670</td><td></td></tr><tr><td>Ultracut R</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciencias de la microscopía electrónica de</td> <td>acetato de uranilo</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Westar Sun&nbsp;</td><td>Cyanagen</td><td>XLS063</td><td></td></tr><tr><td>Supernova de Westar&nbsp;</td><td>Cyanagen</td><td>XLS3</td><td></td></tr></tbody></table>

diferenciación e imagen de adipocitos marrones de la fracción vascular estromal de tejido adiposo interescapular de ratones recién nacidos

Differentiation and Imaging of Brown Adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice

El tejido adiposo marrón (BAT) solo está presente en los mamíferos y tiene una función termogénica. Los adipocitos marrones se caracterizan por un citoplasma multilocular con múltiples gotas de lípidos, un núcleo central, un alto contenido mitocondrial y la expresión de la proteína de desacoplamiento 1 (UCP1). El BAT se ha propuesto como una posible diana terapéutica para la obesidad y sus trastornos metabólicos asociados debido a su capacidad para disipar la energía metabólica en forma de calor. Para investigar la función y regulación de las MTD, es indispensable el cultivo de adipocitos marrones. El presente protocolo optimiza el procesamiento de tejidos y la diferenciación celular para el cultivo de adipocitos marrones de ratones recién nacidos. Además, se muestran los procedimientos para la obtención de imágenes de adipocitos diferenciados con inmunofluorescencia confocal y microscopía electrónica de transmisión. En los adipocitos marrones diferenciados con las técnicas descritas en este trabajo, se conservan las principales características definitorias de la MTD clásica, incluidos los niveles altos de UCP1, el aumento de la masa mitocondrial y el contacto físico muy estrecho entre las gotas de lípidos y las mitocondrias, lo que convierte a este método en una herramienta valiosa para los estudios de BAT.

La adipogénesis está regulada por una red de factores de transcripción que son responsables tanto de la expresión de proteínas clave que inducen la formación y el funcionamiento de los adipocitos marrones22, incluyendo reguladores adipogénicos clásicos como PPARγ y C/EBPα 23,24,25, así como marcadores de adipocitos maduros 26,27. A través de la pr...

Los preadipocitos se aíslan de la fracción vascular estromal del tejido adiposo marrón interescapular de ratones recién nacidos y se diferencian en células que acumulan gotas de lípidos, expresan marcadores moleculares y muestran la morfología mitocondrial de los adipocitos marrones maduros. Estas células se analizan posteriormente mediante inmunofluorescencia y microscopía electrónica de transmisión.

Diferenciación e imagen de adipocitos marrones de la fracción vascular estromal de tejido adiposo interescapular de ratones recién nacidos

Brown adipose tissue (BAT) is only present in mammals and has a thermogenic function. Brown adipocytes are characterized by a multilocular cytoplasm with ...

Este protocolo permite la diferenciación eficiente y reproducible de adipocitos marrones que expresan factores de transcripción adipogénicos clave, marcadores de adipocitos maduros y tienen potencial termogénico y fenotipo morfológico de adipocitos marrones maduros. Se trata de un procedimiento de diferenciación en dos fases sencillo y replicable para obtener células con características de adipocitos marrones maduros a partir de tejido adiposo marrón interescapular de ratones recién nacidos. Este protocolo permite estudiar los mecanismos de activación del tejido adiposo marrón como diana para el tratamiento de la obesidad.Ha sido un modelo para determinar los mecanismos implicados en la fisiopatología de la lipodistrofia. Se espera que realizar esta técnica por primera vez sea un desafío. Es fundamental tener un protocolo detallado y enfatizar los puntos críticos para tener resultados exitosos.Para comenzar, coloque al ratón sacrificado en posición prona y haga una incisión en la piel de un centímetro de largo en el nivel medio de la espalda del animal con unas tijeras afiladas. Retire la piel con cuidado, separe quirúrgicamente el iBAT de la carcasa con unas tijeras pequeñas. Coseche ambos lóbulos de iBAT con unos alicates de punta curva para eliminar los lóbulos de forma independiente.Coloque los dos lóbulos en un tubo de plástico con 1,5 mililitros de PBS estéril a temperatura ambiente. Incubar los tejidos iBAT en un tampón de digestión de colagenasa tipo dos durante 45 minutos a 37 grados centígrados con una agitación suave y continua a 800 RPM. Interrumpe mecánicamente la suspensión tisular en el tampón de digestión de colagenasa tipo dos pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una micropipeta P1000 y puntas de filtro.Utilice una nueva punta para cada muestra. Pase los tejidos desegregados a través de filtros de células individuales de 100 micrómetros a nuevos tubos de 1,5 mililitros. Agregue 500 microlitros de tampón ACK a las muestras de tejido filtradas.Invierta los tubos de cuatro a cinco veces e incube a temperatura ambiente durante cuatro minutos. A continuación, pase las suspensiones a través de un filtro de células de 40 micrómetros a nuevos tubos de 1,5 mililitros utilizando una micropipeta P1000 y puntas filtradas. La centrifusión resuspende el pellet como se describe en el manuscrito del texto.A continuación, siembre cada muestra en seis pocillos de una placa de cultivo de 24 pocillos añadiendo un mililitro de la suspensión a cada pocillo. Los preadipocitos indiferenciados presentaron niveles muy bajos o indetectables de ppar-gamma, C/ebp-alfa, perilipina 1 y CD36. Por el contrario, estos marcadores fueron significativamente más altos en el séptimo día de diferenciación.La acumulación de múltiples gotas de lípidos en los preadipocitos marrones fue consistente con los resultados publicados previamente. Se observó un aumento significativo en los niveles del marcador de masa mitocondrial TOM 20 y de la proteína del complejo de fosforilación oxidativa al séptimo día de diferenciación. UCP1, un marcador de buena fe de este tipo de células, no se detectó en preadipocitos indiferenciados, mientras que se expresó sustancialmente en adipocitos marrones maduros en el séptimo día de diferenciación.Las mitocondrias evolucionaron de una forma tubular alargada en el día cero a una forma redondeada o similar a un frijol en el día siete. La estructura interna mitocondrial también fue modificada por la adipogénesis, lo que resultó en una mayor densidad de las crestas empaquetadas paralelamente. Es importante destacar que las mitocondrias estaban íntimamente asociadas con las gotas de lípidos en los adipocitos marrones diferenciados, por lo que no se pudo detectar una distancia discernible entre la membrana externa de las mitocondrias y las superficies de las gotas de lípidos, incluso con microscopía electrónica de transmisión de alta resolución.La extirpación quirúrgica del tejido adiposo interescapular es fundamental. Una cantidad ineficiente de tejido limita la disponibilidad de células que se diferenciarán. Esta técnica de imagen ayuda a caracterizar la morfología de los adipocitos marrones diferenciados in vitro.Es posible realizar ensayos para la función mitocondrial, la activación beta-androgénica y la inhibición autofágica.

differentiation-imaging-brown-adipocytes-from-stromal-vascular

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Un método de obtención de imágenes funcionales de tejido de ratón adiposo marrón (BAT) se describe en frío que estimula la captación de 18F-fluorodeoxiglucosa (FDG) en la MTD es evaluar de forma no invasiva con un protocolo estandarizado micro-PET/CT. Este método es robusto y sensible para detectar diferencias en las actividades de BAT en modelos de ratón.

Imagen funcional de grasa marrón en ratones con FDG micro-PET/CT

Preadipocitos primarios blancas aisladas de tejidos adiposos blancos en ratones se pueden diferenciar en células beige / brite. Se presenta aquí un sistema fiable modelo celular para estudiar la regulación molecular de "color" de la grasa blanca.

Aislamiento y diferenciación de las células del estroma vascular a células Beige / Brite

En este reportaje de vídeo, mostramos la aplicación de la Luminiscencia de Cerenkov para el tejido adiposo marrón interescapular en ratones en condiciones activadas y deprimidas.

Cerenkov Luminiscencia Imaging de interescapular tejido adiposo marrón

El método presentado aquí utiliza 18 F-fluorodesoxiglucosa (18F-FDG) tomografía por emisión de positrones / tomografía computarizada (PET-TC) y la resonancia magnética separada grasa-agua (MRI), cada escaneado tras 2 horas de exposición a temperatura neutra (24 ° C ) y las condiciones de frío (17 ° C) para mapear el tejido adiposo marrón (BAT) en sujetos humanos adultos.

Depósitos de tejido adiposo humano Marrón segmentada automáticamente por Tomografía por Emisión de Positrones / Tomografía Computada y Resonancia Registrado Imágenes Magnéticas

Este informe describe un protocolo para el aislamiento simultáneo de preadipocytes marrones y blancos primarios de ratones recién nacidos. Las células aisladas se pueden cultivar en cultivo e inducir a diferenciarse en adipocitos blancos y marrones completamente maduros. El método permite la caracterización genética, molecular y funcional de las células de grasa primarias en cultivo.

Aislamiento Y Diferenciación De Preadipocitos Blancos Y Marrones Primarios De Ratones Recién Nacidos

Este estudio describe un nuevo método para aislar adipocitos marrones murinos para el análisis de expresión génica y proteica.

Aislar adipocitos marrones del tejido adiposo marrón interescapular murino para el análisis de expresión génica y proteica

Imágenes funcionales y cuantificación de depósitos adiposos termogénicos en ratones utilizando un enfoque basado en imágenes micro-PET / MR.

Visualización y cuantificación de tejidos adiposos marrones y beige en ratones utilizando [18F]FDG Micro-PET/MR Imaging

Aquí, presentamos un protocolo para medir la actividad del tejido adiposo marrón después de una comida en humanos y animales de laboratorio.

Termografía infrarroja para la detección de cambios en la actividad del tejido adiposo marrón

Este protocolo describe el aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal (SVF) del tejido adiposo murino para obtener preadipocitos y lograr la diferenciación de los adipocitos in vitro. El uso de un disociador de tejidos para la digestión de la colagenasa reduce la variación experimental y aumenta la reproducibilidad.

Aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal del tejido adiposo blanco murino utilizando un disociador tisular

Aquí, proporcionamos un procedimiento práctico para diseccionar y realizar análisis histológicos y de expresión génica del tejido adiposo marrón supraclavicular murino.

Disección, procesamiento histológico y análisis de expresión génica del tejido adiposo marrón supraclavicular murino

Aprende a diferenciar adipocitos marrones a partir de tejido adiposo interescapular de ratones recién nacidos. Este protocolo permite estudiar la adipogénesis y la termogénesis con aplicaciones en investigación sobre obesidad y metabolismo energético.

Diferenciación e imagen de adipocitos marrones de la fracción vascular estromal de tejido adiposo interescapular de ratones recién nacidos (Video) | JoVE Journal

Diferenciación e imagen de adipocitos marrones de la fracción vascular estromal de tejido adiposo interescapular de ratones recién nacidos

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