Diferenciación e imagen de adipocitos marrones de la fracción vascular estromal de tejido adiposo interescapular de ratones recién nacidos
3 de febrero de 2023
Los preadipocitos se aíslan de la fracción vascular estromal del tejido adiposo marrón interescapular de ratones recién nacidos y se diferencian en células que acumulan gotas de lípidos, expresan marcadores moleculares y muestran la morfología mitocondrial de los adipocitos marrones maduros. Estas células se analizan posteriormente mediante inmunofluorescencia y microscopía electrónica de transmisión.
Este protocolo permite la diferenciación eficiente y reproducible de adipocitos marrones que expresan factores de transcripción adipogénicos clave, marcadores de adipocitos maduros y tienen potencial termogénico y fenotipo morfológico de adipocitos marrones maduros. Se trata de un procedimiento de diferenciación en dos fases sencillo y replicable para obtener células con características de adipocitos marrones maduros a partir de tejido adiposo marrón interescapular de ratones recién nacidos. Este protocolo permite estudiar los mecanismos de activación del tejido adiposo marrón como diana para el tratamiento de la obesidad.
Ha sido un modelo para determinar los mecanismos implicados en la fisiopatología de la lipodistrofia. Se espera que realizar esta técnica por primera vez sea un desafío. Es fundamental tener un protocolo detallado y enfatizar los puntos críticos para tener resultados exitosos.
Para comenzar, coloque al ratón sacrificado en posición prona y haga una incisión en la piel de un centímetro de largo en el nivel medio de la espalda del animal con unas tijeras afiladas. Retire la piel con cuidado, separe quirúrgicamente el iBAT de la carcasa con unas tijeras pequeñas. Coseche ambos lóbulos de iBAT con unos alicates de punta curva para eliminar los lóbulos de forma independiente.
Coloque los dos lóbulos en un tubo de plástico con 1,5 mililitros de PBS estéril a temperatura ambiente. Incubar los tejidos iBAT en un tampón de digestión de colagenasa tipo dos durante 45 minutos a 37 grados centígrados con una agitación suave y continua a 800 RPM. Interrumpe mecánicamente la suspensión tisular en el tampón de digestión de colagenasa tipo dos pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una micropipeta P1000 y puntas de filtro.
Utilice una nueva punta para cada muestra. Pase los tejidos desegregados a través de filtros de células individuales de 100 micrómetros a nuevos tubos de 1,5 mililitros. Agregue 500 microlitros de tampón ACK a las muestras de tejido filtradas.
Invierta los tubos de cuatro a cinco veces e incube a temperatura ambiente durante cuatro minutos. A continuación, pase las suspensiones a través de un filtro de células de 40 micrómetros a nuevos tubos de 1,5 mililitros utilizando una micropipeta P1000 y puntas filtradas. La centrifusión resuspende el pellet como se describe en el manuscrito del texto.
A continuación, siembre cada muestra en seis pocillos de una placa de cultivo de 24 pocillos añadiendo un mililitro de la suspensión a cada pocillo. Los preadipocitos indiferenciados presentaron niveles muy bajos o indetectables de ppar-gamma, C/ebp-alfa, perilipina 1 y CD36. Por el contrario, estos marcadores fueron significativamente más altos en el séptimo día de diferenciación.
La acumulación de múltiples gotas de lípidos en los preadipocitos marrones fue consistente con los resultados publicados previamente. Se observó un aumento significativo en los niveles del marcador de masa mitocondrial TOM 20 y de la proteína del complejo de fosforilación oxidativa al séptimo día de diferenciación. UCP1, un marcador de buena fe de este tipo de células, no se detectó en preadipocitos indiferenciados, mientras que se expresó sustancialmente en adipocitos marrones maduros en el séptimo día de diferenciación.
Las mitocondrias evolucionaron de una forma tubular alargada en el día cero a una forma redondeada o similar a un frijol en el día siete. La estructura interna mitocondrial también fue modificada por la adipogénesis, lo que resultó en una mayor densidad de las crestas empaquetadas paralelamente. Es importante destacar que las mitocondrias estaban íntimamente asociadas con las gotas de lípidos en los adipocitos marrones diferenciados, por lo que no se pudo detectar una distancia discernible entre la membrana externa de las mitocondrias y las superficies de las gotas de lípidos, incluso con microscopía electrónica de transmisión de alta resolución.
La extirpación quirúrgica del tejido adiposo interescapular es fundamental. Una cantidad ineficiente de tejido limita la disponibilidad de células que se diferenciarán. Esta técnica de imagen ayuda a caracterizar la morfología de los adipocitos marrones diferenciados in vitro.
Es posible realizar ensayos para la función mitocondrial, la activación beta-androgénica y la inhibición autofágica.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este estudio proporciona un protocolo detallado para la diferenciación de preadipocitos en adipocitos marrones maduros utilizando tejido adiposo marrón interscapular obtenido de ratones recién nacidos. Las células diferenciadas muestran acumulación característica de lípidos, expresan marcadores adipogénicos clave y presentan adaptaciones mitocondriales indicativas de funcionalidad termogénica.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Biología del adipocito
- Investigación sobre obesidad
- Mecanismos de termogénesis
Antecedentes
- Estudio del papel del tejido adiposo pardo en el metabolismo energético
- Modelado de condiciones relacionadas con la obesidad y la lipodistrofia
- Importancia de la diferenciación de preadipocitos para el estudio de la adipogénesis
Métodos Utilizados
- Inmunofluorescencia y microscopía electrónica de transmisión
- Tejido adiposo marrón interscapular de ratones recién nacidos
- Protocolos de diferenciación celular y ensayos para características mitocondriales
Resultados principales
- Diferenciación exitosa de preadipocitos en adipocitos maduros marcada por la acumulación de gotas lipídicas
- Expresión mejorada de factores de transcripción adipogénicos y marcadores termogénicos en el día siete de diferenciación
- Caracterización de los cambios en la morfología mitocondrial asociados con la adipogénesis
Conclusiones
- Este protocolo permite el estudio reproducible de la diferenciación y funciones de adipocitos marrones.
- Relevancia para comprender la obesidad y posibles objetivos terapéuticos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La diferenciación e imagenología eficientes de adipocitos marrones a partir del tejido adiposo interscapular de ratones recién nacidos permite un modelado in vitro robusto de la biología del tejido adiposo termogénico. Esta capacidad respalda la validación temprana de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en carteras de investigación de enfermedades metabólicas, particularmente en estudios sobre obesidad y lipodistrofia. La reproducibilidad del protocolo y la preservación de características clave del tejido adiposo marrón facilitan una confianza predictiva en los ensayos funcionales posteriores.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar los mecanismos de activación de adipocitos marrones relevantes para los objetivos relacionados con enfermedades metabólicas.
- Apoya la desactivación biológica al confirmar la expresión de marcadores termogénicos y adipogénicos.
- Facilita la validación funcional de objetivos mediante fenotipos mitocondriales y lipídicos cuantificables.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona un sistema estandarizado para preparar adipocitos marrones maduros destinados a la selección de compuestos.
- Asegura la reproducibilidad y la evaluación cuantitativa de marcadores de diferenciación y función mitocondrial.
- Permite lecturas basadas en imágenes para evaluar los efectos de los compuestos sobre la morfología y función del adipocito.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Alinea los fenotipos de adipocitos in vitro con la biología del tejido adiposo marrón (BAT) relevante para enfermedades, garantizando continuidad traslacional.
- Apoya el avance ajustado al riesgo de programas para enfermedades metabólicas mediante la modelización de la activación y disfunción del BAT.
- Facilita la alineación de biomarcadores mediante la cuantificación de UCP1 y adaptaciones mitocondriales.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este protocolo se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica al proporcionar un sistema validado para pruebas de hipótesis, cribado y estudios mecanicistas de la biología de los adipocitos marrones.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la activación del tejido adiposo pardo y las vías de diferenciación adipogénica.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos reproducibles para la evaluación de compuestos en adipocitos pardos maduros.
- Análisis: Permite la medición de la expresión de factores de transcripción, la masa mitocondrial y la asociación de gotas lipídicas.
- Investigación Traducional: Conecta los hallazgos in vitro con la función in vivo del tejido adiposo pardo y los modelos de enfermedades metabólicas.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para iniciativas continuas de investigación metabólica y sobre la obesidad.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en el descubrimiento dirigido al tejido adiposo pardo (BAT) y reduce la ambigüedad mecanicista.
- Valor operativo: Estandariza los protocolos de diferenciación y de obtención de imágenes para garantizar la reproducibilidad entre diferentes equipos.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción de objetivos relacionados con enfermedades metabólicas al permitir ensayos funcionales robustos.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de programas terapéuticos relacionados con el tejido adiposo pardo (BAT).
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en disección de tejidos, cultivo celular y técnicas avanzadas de imagen.
- Exige acceso a infraestructura de microscopía de inmunofluorescencia confocal y microscopía electrónica de transmisión.
- Necesita la estandarización de protocolos para garantizar la reproducibilidad entre distintos equipos de investigación.
- Puede requerir adaptaciones para diferentes cepas de ratón o etapas del desarrollo.
- El rendimiento celular y la eficiencia de diferenciación dependen del manejo y procesamiento preciso del tejido.
![Visualización y cuantificación de tejidos adiposos marrones y beige en ratones utilizando [18F]FDG Micro-PET/MR Imaging](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F62460.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A22.161Z&w=384&q=75)
