Name: Modelo murino espontáneo de cáncer anaplásico de tiroides (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T13:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: Aprenda a generar tumores de carcinoma anaplásico de tiroides en ratones mediante modelos genéticamente modificados. Este método permite estudiar la dinámica tumoral y facilita el descubrimiento de fármacos.

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Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de Desarrollo de Investigación Clave de China (2021YFA1301203); la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82103031, 82103918, 81973408, 82272933); el Proyecto de Incubación de Investigación Clínica, Hospital de China Occidental, Universidad de Sichuan (22HXFH019); el Proyecto de Cooperación Internacional de la Oficina Municipal de Ciencia y Tecnología de Chengdu (2020-GH02-00017-HZ); Fundación de Ciencias Naturales de Sichuan, 2022NSFSC1314; el "1.3.5 proyecto para disciplinas de excelencia, Hospital de China Occidental, Universidad de Sichuan" (ZYJC18035, ZYJC18025, ZYYC20003, ZYJC18003); y Programa de Ciencia y Tecnología de Sichuan (2023YFS0098).

Los procedimientos con animales descritos aquí se realizaron con la aprobación del Comité de Ética Animal del Hospital de China Occidental, Universidad de Sichuan, Chengdu, Sichuan, China.
1. Inducción de ratones TBP
<ol><li>Identificar el genotipo de los ratones<ol><li>Alrededor de las 3 semanas, separe los ratones hembra de los ratones machos. Al mismo tiempo, use una abrazadera de marca auricular para arreglar una marca auricular. Coloque las marcas auriculares en la mitad inferior y en el tercio medio de la oreja, asegurándose de evitar el área con la mayor concentración de capilares.</li>
		<li>Sujete suavemente pero con seguridad a los ratones. Agarre firmemente la base de la cola del ratón. Coloque los ratones sobre una superficie que les permita agarrarse.</li>
		<li>Coloque suavemente pero con firmeza la mano libre sobre los hombros, luego agarre rápidamente el cuello entre el pulgar y el índice. Sostenga la cola con el dedo meñique.</li>
		<li>Frotar la cola con alcohol. Use tijeras estériles para cortar la muestra de piel <5 mm y colóquela en un recipiente de muestra limpio con una etiqueta. No es necesario quitar el pelaje de los ratones. Comprimir la cola con esponjas estériles para lograr la hemostasia.</li>
		<li>A continuación, lisar la cola murina y realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para identificar el genotipo. NOTA: Después de cortar una cola murina, la superficie de las tijeras debe limpiarse con algodón alcohólico para evitar la contaminación mutua de genes entre las colas murinas. Después de colocarlos en su jaula, los ratones deben ser observados durante 5 minutos para buscar cualquier signo de sangrado en el sitio de la herida. Consulte la Tabla 1 para obtener la lista de cebadores y los ajustes de PCR utilizados en este estudio.</li>
	</ol></li>
	<li>Ratones TBP inducidos por tamoxifeno<ol><li>Pesar 0,3 g de tamoxifeno y disolverlo en 15 ml de aceite de maíz por ultrasonido (potencia = 20%, duración = 20 min, temperatura = 4 °C), a una concentración de 20 mg / ml. Conservar a 4 °C. NOTA: El tamoxifeno es sensible a la luz y debe colocarse en un recipiente marrón.</li>
		<li>Alrededor de las 8 semanas, pesar a los ratones con balanzas electrónicas y administrarles una inyección i.p. de tamoxifeno a una dosis de 150 mg / kg, administrada dos veces con un intervalo de 1 semana.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Disección e imágenes de tumores tiroideos de ratón y tumores metastásicos
<ol><li>Preparación<ol><li>Prepare las herramientas de disección: tijeras y pinzas estériles, cuchilla estéril, botella de spray de alcohol al 75%, borde recto de 20 cm, pinzas vernier, toallas de papel y algodón con alcohol.</li>
		<li>Solución de fijación de tejido de ratón: prepare una solución de fijación de tejido de paraformaldehído al 4%.</li>
		<li>Limpie un plato de 10 cm lleno de aproximadamente 10 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) para el almacenamiento temporal de tejido, y lave la sangre en la superficie del tejido.</li>
	</ol></li>
	<li>Extracción de tiroides<ol><li>Eutanasia a los ratones con dióxido de carbono a un caudal de 2,0 L/min durante 5 min. Retire los ratones de la jaula y realice la dislocación cervical.</li>
		<li>Coloque el ratón en la tabla de disección con el lado ventral hacia arriba y la cabeza alejada del experimentador, y fije las extremidades en la tabla de disección con agujas de jeringa estériles. Para una extracción más conveniente del tejido tiroideo, use otra aguja de jeringa estéril para fijar la cabeza.</li>
		<li>Desinfecte el cuello con tres rondas alternas de un exfoliante de clorhexidina o povidona yodada seguido de alcohol al 75%. Luego, haga una pequeña incisión por encima del centro de la clavícula con tijeras y fórceps estériles.</li>
		<li>Continúe la incisión en la línea media hasta la boca. Encuentre la glándula submandibular y retírela para exponer la ubicación anatómica de la tiroides, que se coloca cerca del cartílago tiroides y la tráquea.</li>
		<li>Encuentre la tiroides, diseccione cuidadosamente la tiroides del resto de la región del cuello con tijeras estériles, luego coloque la tiroides extirpada en un plato de 10 cm lleno de 10 ml de PBS estéril. NOTA: Durante la extirpación de la glándula tiroides, sea suave y lento y evite cortar los vasos sanguíneos del cuello. Si se cortan los vasos del cuello, el cuello se llenará inmediatamente de sangre, y la sangre debe eliminarse rápidamente con esponjas de alcohol para exponer la ubicación anatómica de la tiroides. Antes de extraer el tejido tiroideo, observe cuidadosamente las características de los lóbulos izquierdo y derecho de la tiroides (tamaño, forma, etc.) para evitar no poder distinguir entre los lóbulos izquierdo y derecho de la tiroides después de la extracción.</li>
		<li>En PBS estéril, retire la sangre de la superficie del tejido tiroideo con tijeras estériles y corte cuidadosamente la tráquea. Luego, coloque el tejido tiroideo en un paño estéril y mida el tamaño de los lóbulos izquierdo y derecho de la glándula tiroides con calibradores vernier.</li>
		<li>Divida los lóbulos izquierdo y derecho de la glándula tiroides en dos partes con una cuchilla estéril. Ponga una parte en 2 ml de solución de paraformaldehído al 4% para la fijación, y ponga la otra parte en nitrógeno líquido para su conservación.</li>
	</ol></li>
	<li>Extracción de pulmón e hígado<ol><li>Desinfecte el abdomen con tres rondas alternas de un exfoliante de clorhexidina o povidona yodada y alcohol al 75%. Luego, pellizque justo por encima del pene del ratón y haga una pequeña incisión, corte a lo largo de la línea media del abdomen hasta el hueso subclavio y exponga la cavidad abdominal.</li>
		<li>Encuentra el hígado en la parte superior del abdomen y retíralo con cuidado. Coloque el hígado en PBS estéril.</li>
		<li>Corte con cuidado el diafragma a lo largo de las costillas para exponer la cavidad torácica. A continuación, agarre el esternón y tire hacia arriba para ampliar aún más el espacio. Encuentra el pulmón y extráigalo. Coloque el pulmón extirpado en PBS estéril.</li>
		<li>Observe groseramente si hay metástasis en el pulmón y el hígado. Cuente el número de metástasis y tome un registro digital. Después de eso, use una cuchilla estéril para dividir los tejidos pulmonares y hepáticos en dos partes. Ponga una parte en 3 ml de solución de paraformaldehído al 4% para la fijación y otra parte en nitrógeno líquido para su conservación.</li>
		<li>Deshidratación tisular<ol><li>Coloque los pañuelos en la caja de deshidratación. Coloque la caja de deshidratación en la cesta en el degradado de deshidratación de alcohol de la siguiente manera: 70% de alcohol durante 1 h; 80% de alcohol durante 1 h; 95% de alcohol durante 30 min; 95% de alcohol durante 30 min; etanol anhidro I durante 30 min; etanol anhidro II durante 30 min; xileno I durante 20 min; xileno II durante 20 min; cera de parafina I durante 30 min; cera de parafina II durante 1 h; cera de parafina III durante 30 min.</li>
		</ol></li>
		<li>Incruste los tejidos impregnados de cera en la máquina de incrustación.<ol><li>Coloque primero la cera derretida en el marco de incrustación. Antes de que la cera se solidifique, retire el tejido de la caja de deshidratación y colóquelo en el marco de incrustación, luego coloque la etiqueta.</li>
			<li>Dejar enfriar la cera a -20 °C en la mesa de congelación. Después de que la cera se solidifique, retire el bloque de cera del marco de incrustación y recórtelo.</li>
		</ol></li>
		<li>Coloque el bloque de cera recortado en una cortadora de parafina, fijada a un grosor de 5 μm y un tamaño de 2 cm x 2 cm. Después de seccionar, deje que las secciones floten en un esparcidor con agua tibia a 45 ° C para aplanar el tejido. Recoger el pañuelo con un portaobjetos y hornear las rodajas en un horno a 65 °C durante 2 h.</li>
		<li>Después de que el agua se seque y la cera se derrita, retire el portaobjetos con el tejido y úselo para la tinción de hematoxilina y eosina (HE) e inmunohistoquímica (IHC)16. Asegúrese de que las secciones estén adheridas a las diapositivas para teñirlas.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Tinción HE del tumor primario y pulmón
<ol><li>Desparafinado<ol><li>Coloque las diapositivas con las secciones en xileno durante 10 min.</li>
		<li>Pase al alcohol anhidro (100%) (dos botellas) durante aproximadamente 3 minutos cada una.</li>
		<li>Pase al 95% de alcohol (dos botellas) durante aproximadamente 3 minutos cada una.</li>
		<li>Pase al 80% de alcohol durante unos 3 minutos.</li>
		<li>Pasar al 50% de alcohol durante unos 3 minutos.</li>
		<li>Muévase al agua del grifo y lave el alcohol durante aproximadamente 1 minuto.</li>
	</ol></li>
	<li>Tinción<ol><li>Mueva los portaobjetos a hematoxilina durante 8 min.</li>
		<li>Mueva los portaobjetos en el agua durante 1 minuto para lavar la hematoxilina; El tejido cambia de azul a rojo.</li>
		<li>Mueva los portaobjetos en alcohol de ácido clorhídrico al 1% durante aproximadamente 30 s.</li>
		<li>Mueva los toboganes al agua, lavando durante 5 minutos.</li>
		<li>Mueva los portaobjetos a eosina durante 90 s, luego lávelos con agua durante 5 minutos.</li>
		<li>Mueva las diapositivas al 50% de alcohol, 80% de alcohol, 95% de alcohol (dos botellas) y alcohol anhidro (100%) (dos botellas), durante 1 minuto cada una.</li>
		<li>Mueva los portaobjetos al xileno durante 5 minutos.</li>
		<li>Después de que los portaobjetos estén secos, séllelos con resina neutra.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Pasos críticos dentro del protocolo para la disección de tumores tiroideos Durante la disección, la ubicación anatómica de la glándula tiroides debe entenderse correctamente. La glándula tiroides es una glándula en forma de mariposa ubicada en el lado dorsal de la glándula submandibular cerca del cartílago tiroides y la tráquea. Durante el procedimiento, se evitó cuidadosamente cortar las arterias sanguíneas en ambos lados del cuello.
Modificación y solución de prob...

El cáncer de tiroides es una de las neoplasias endocrinas más comunes1, que se origina en el epitelio tiroideo. En los últimos años, la incidencia de cáncer de tiroides ha aumentado rápidamente en todo el mundo2. El cáncer de tiroides se puede dividir en distintos tipos según el grado de diferenciación de las células tumorales. Sobre la base del comportamiento clínico y la histología, los carcinomas de tiroides se dividen en carcinomas bien diferenciados, incluyendo carcinoma papilar de tiroides (PTC) y carcinoma folicular de tiroides (FTC), carcinoma pobremente diferenciado (PDTC) y carcinoma indiferenciado o anaplásico de tiroides (ATC)3. A diferencia del PTC, que es un tipo común con comportamiento leve y mejor pronóstico4, el ATC es una neoplasia maligna rara y altamente agresiva que representa del 2% al 3% de todos los tumores tiroideos5. Aunque el ATC es raro, es responsable de aproximadamente el 50% de las muertes relacionadas con el cáncer de tiroides, con una supervivencia sombría (6-8 meses)6,7. Más del 50% de los casos de ATC se diagnostican como metástasis pulmonar8. Además de la naturaleza agresiva del ATC, se ha desarrollado un tratamiento efectivo limitado en la clínica. Por lo tanto, los pacientes con ATC tienen un pronóstico sombrío 9,10,11. Esto sugiere que se necesitan urgentemente más estudios en profundidad sobre los mecanismos moleculares subyacentes al desarrollo del ATC y el tratamiento.
La tumorigénesis del ATC es un proceso dinámico desdiferenciado. La dificultad para recolectar muestras de tumores humanos en cada etapa de los estudios clínicos ha dificultado la comprensión del mecanismo de desarrollo de carcinomas bien diferenciados a indiferenciados. En contraste, el uso de modelos murinos de ATC (mATC) favorece la recolección de muestras de mATC en todo el curso de la tumorigénesis. Por lo tanto, podemos comprender mejor los mecanismos de formación de tumores analizando el proceso dinámico desdiferenciado. Además, la heterogeneidad de las muestras clínicas de ATC también ha contribuido a la dificultad de comprender el mecanismo molecular. Sin embargo, los ratones compartían los mismos antecedentes genéticos y se mantuvieron en entornos de vida similares, asegurando la consistencia de cada tumor. Esto facilita explorar el papel generalizado del desarrollo de ATC12,13,14. Además, mATC es un modelo tumoral in situ que puede restaurar la influencia de la ubicación anatómica y el microambiente específico del tejido. Como tal, en comparación con los ratones inmunodeficientes de uso común, mATC es un modelo murino espontáneo con un sistema inmune intacto y un microambiente inmune.
Por lo tanto, construimos mATC inducido condicionalmente con la cepa C57BL/6, que es un modelo murino capaz de reproducir las características patológicas del carcinoma tiroideo desdiferenciado. Con base en este modelo, dimos una breve descripción de las bases moleculares, ideas de construcción, características patológicas y aplicaciones de mATC. Además, observamos e informamos el crecimiento tumoral, el tiempo de supervivencia, la metástasis y las características patológicas de mATC. Creemos que esta será una visión general informática para ayudar a otros investigadores a usar este modelo más fácilmente.
Construimos un modelo mATC inducible condicional, como se informó por primera vez en McFadden15; inicialmente, construimos ratones: TPO-cre / ERT2, Braf flox / wt y Trp53flox / wt. Específicamente, los ratones TPO-cre / ERT2 incluyeron el promotor de la peroxidasa tiroidea humana (TPO) (un promotor específico de la tiroides), impulsando la expresión de un gen de fusión cre-ERT2 (una recombinasa cre fusionada a un dominio de unión al ligando del receptor de estrógeno humano). Cre-ERT2 generalmente se limita al citoplasma y entra en el núcleo solo cuando se expone al tamoxifeno, que induce a cre a ejercer actividad enzimática recombinante. Cuando los ratones se cruzan con ratones portadores de secuencias flanqueadas por loxP, después de la inducción de tamoxifeno, la recombinación mediada por cre elimina las secuencias floxed en las células tiroideas para lograr el propósito de eliminar o golpear genes específicos.
Además, los ratones Braf flox/wt son un alelo knock-in de Braf humano basado en el sistema cre-loxP. La transcripción murina Brafflox/wt está codificada por los exones endógenos 1-14 y los exones humanos flanqueados por loxP 15-18. Después de la escisión mediada por cre de las regiones floxed, el exón mutante 15 (modificado con una sustitución de aminoácidos V600E vinculada con BrafV600E constitutivamente activo en cánceres humanos) y los exones endógenos 16-18 se utilizan para generar las transcripciones. Además, los ratones Trp53 flox/wt son alelos knockout de Trp53 humano y tienen sitios loxP flanqueando los exones 2-10 de Trp53. Cuando se cruza con ratones con una recombinasa cre, la recombinación mediada por cre elimina la secuencia floxed para eliminar Trp53. Luego, se cruzaron ratones TPO-cre/ERT2, Braf flox/w y Trp53flox/wt para obtener TB (TPO-cre/ERT2; Brafflox/wt) ratones y TBP (TPO-cre/ERT2; Brafflox/wt; Trp53flox/wt) ratones, que podrían usarse para generar PTC y ATC. Después de aproximadamente 8 semanas, los ratones fueron inducidos por una administración intraperitoneal (i.p.) de 150 mg / kg de tamoxifeno disuelto en aceite de maíz durante dos administraciones. El crecimiento tumoral podría controlarse mediante ecografía de alta frecuencia (el primer punto de tiempo de la ecografía se registró como el Día 0). La ecografía inicial se realizó 40 días después de la introducción del tamoxifeno.

<table><tbody><tr><td>100x&nbsp; Solución de recuperación de antígeno de citrato (PH 6.0)</td><td>MXB</td><td>Cat# MVS-0101</td><td></td></tr><tr><td>50x Solución de recuperación de antígeno EDTA (pH 9.5)</td><td>ZSGB-GIO</td><td>Cat# ZLI-9071</td><td></td></tr><tr><td>Brafflox/wt ratones</td><td>Colaboración con el Instituto de Ciencias de la Vida, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caspasa-3</td><td>Beyotime</td><td>Cat# AC033</td><td></td></tr><tr><td>Tecnología de señalización celular</td> <td>CD8</td><td>Cat # 98941; Tecnología de señalización celular RRID:AB_2756376</td><td></td></tr><tr><td>CD206</td><td></td><td>Cat# 24595; RRID:AB_2892682</td><td></td></tr><tr><td>Cámara para inducción de anestesia</td><td>RWDlifescience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit cromogénico DAB mejorado</td><td>MXB</td><td>Cat# DAB-2031</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tinción de eosina</td><td>ZSGB-GIO</td><td>Cat# ZLI-9613</td><td></td></tr><tr><td>F4/80</td><td>Abcam</td><td>Cat# 100790; Tecnología de señalización celular RRID:AB_10675322</td><td></td></tr><tr><td>Foxp3</td><td></td><td>Cat# 12653; RRID:AB_2797979</td><td></td></tr><tr><td>Deshidratador de tejidos completamente cerrado</td><td>Leica Biosystems</td><td>ASP300S</td><td></td></tr><tr><td>solución de tinción de hematoxilina</td><td>ZSGB-GIO</td><td>Cat# ZLI-9610</td><td></td></tr><tr><td>HistoCore Arcadia máquina de inclusión de tejidos totalmente automática</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ki67</td><td>Beyotime</td><td>Cat# AF1738</td><td></td></tr><tr><td>Cortadora giratoria</td><td>RWDlifescience</td><td>&nbsp; Kits de detección Minux S700</td><td></td></tr><tr><td>SPlink (Sistemas de detección de biotina-estreptavidina HRP)</td><td>ZSGB-GIO</td><td>Cat# SP-9001</td><td></td></tr><tr><td>TPO-cre/ERT2 ratones</td><td>Colaboración con el Instituto de Ciencias de la Vida, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trp53flox/wt mice</td><td>Colaboración con el Instituto de Ciencias de la Vida, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trituradora de células ultrasónicas</td><td>Ningbo Xinyi Ultrasound Equipment Co., Ltd</td><td>JY92-IIN</td><td></td></tr><tr><td>Gel de ultrasonido</td><td>Keppler</td><td>KL-250</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de ultrasonido</td><td>VisualSonics</td><td>Vevo 3100</td><td></td></tr></tbody></table>

modelo murino espontáneo de cáncer anaplásico de tiroides

Spontaneous Murine Model of Anaplastic Thyroid Cancer

El cáncer anaplásico de tiroides (ATC) es una neoplasia maligna rara pero letal con un pronóstico sombrío. Existe una necesidad urgente de una investigación más profunda sobre la carcinogénesis y el desarrollo de ATC, así como métodos terapéuticos, ya que los tratamientos estándar se agotan esencialmente en pacientes con ATC. Sin embargo, la baja prevalencia ha obstaculizado estudios clínicos exhaustivos y la recolección de muestras de tejido, por lo que se ha avanzado poco en la creación de tratamientos efectivos. Utilizamos ingeniería genética para crear un modelo murino ATC condicionalmente inducible (mATC) en un fondo C57BL/6. El modelo murino ATC fue genotipado por TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Trp53 ex2-10/ex2-10 e inducido por inyección intraperitoneal con tamoxifeno. Con el modelo murino, investigamos la dinámica tumoral (el tamaño del tumor varió de 12,4 mm 2 a 32,5 mm2 después de 4 meses de inducción), la supervivencia (la mediana del período de supervivencia fue de 130 días) y metástasis (las metástasis pulmonares ocurrieron en el 91,6% de los ratones) curvas y características patológicas (caracterizadas por tinción inmunohistoquímica Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67 y Caspasa-3). Los resultados indicaron que el mATC espontáneo posee una dinámica tumoral y un microambiente inmunológico muy similares a los tumores ATC humanos. En conclusión, con una alta similitud en las características fisiopatológicas y genotipos unificados, el modelo mATC resolvió la escasez de tejido clínico ATC y la heterogeneidad de la muestra hasta cierto punto. Por lo tanto, facilitaría el mecanismo y los estudios traslacionales de ATC y proporcionaría un enfoque para investigar el potencial de tratamiento de fármacos moleculares pequeños y agentes de inmunoterapia para ATC.

Inducimos mATC para investigar el crecimiento tumoral, el tiempo de supervivencia del ratón y las características patológicas. Después de la inducción, los ratones fueron sacrificados inmediatamente y se recolectaron muestras (tiroides, pulmón e hígado) una vez que se encontró una de las siguientes afecciones: 1) dificultad respiratoria causada por compresión tumoral; 2) disminución del apetito y vocalización anormal; 3) letargo inusualmente irritable; y 4) pérdida de peso corporal de más del 20%. Durante el proceso de m...

Aquí, presentamos una tubería estándar para obtener tumores murinos ATC mediante modelos espontáneos de ratón genéticamente modificados. Además, presentamos la dinámica tumoral y la información patológica sobre las lesiones primarias y metastástasis. Este modelo ayudará a los investigadores a comprender la tumorigénesis y facilitar los descubrimientos de fármacos.

Modelo murino espontáneo de cáncer anaplásico de tiroides

Anaplastic thyroid cancer (ATC) is a rare but lethal malignancy with a dismal prognosis. There is an urgent need for more in-depth research on the ...

Presentamos un pipeline estándar para obtener tumores MATC y presentamos la dinámica tumoral y la información patológica. Este módulo ayudará a los investigadores a comprender la oncogénesis tumoral y facilitar los descubrimientos de fármacos. El MATC facilita la recolección de muestras de MATC en todo el curso de oncogénesis tumoral, y cada uno es un modelo de espejo espontáneo, con el sistema inmune completo y el microambiente inmune.MATC se puede utilizar para estudiar los efectos de funciones genéticas específicas en ATC, comprender los mecanismos de progresión del tumor tiroideo y, en última instancia, mejorar el pronóstico de los pacientes con ATC. Para comenzar, pese el tamoxifeno y disuélvalo en 15 mililitros de aceite de maíz por ultrasonido a una concentración de 20 miligramos por mililitro. Luego guárdelo en un recipiente marrón a cuatro grados centígrados.Alrededor de las ocho semanas, pesar los ratones con balanzas electrónicas y luego administrar tamoxifeno por vía intraperitoneal dos veces en un intervalo de una semana. Después de preparar las herramientas de disección y la solución de fijación de tejido de ratón, llene un plato limpio de 10 centímetros con aproximadamente 10 mililitros de PBS estéril para el almacenamiento temporal de tejidos y para lavar la sangre de la superficie del tejido. Para la extracción de la tiroides, coloque el ratón sacrificado en el tablero de disección.Después de desinfectar el área del cuello, use tijeras y fórceps estériles. Haga una pequeña incisión por encima del centro de la clavícula y continúe en la línea media hasta la boca. Localice la glándula submandibular y retírela para exponer la ubicación anatómica de la tiroides, que está cerca del cartílago tiroides y la tráquea.Una vez localizada la glándula tiroides, diseccionar cuidadosamente del resto de la región del cuello con tijeras estériles, y ponerla en el plato previamente preparado que contiene PBS estéril. Retire la sangre de la superficie del tejido tiroideo y, con tijeras estériles, corte cuidadosamente la tráquea. Luego coloque el tejido tiroideo en el paño estéril y mida el tamaño de los lóbulos izquierdo y derecho de la glándula tiroides usando calibradores Vernier.Con una cuchilla estéril, divida los lóbulos izquierdo y derecho de la glándula tiroides en dos partes. Ponga una parte en dos mililitros de solución de paraformaldehído al 4% para la fijación y otra en nitrógeno líquido para su conservación. Para extraer el pulmón y el hígado, pellizque justo por encima del pene del ratón después de desinfectar el área.Luego haga una pequeña incisión y corte a lo largo de la línea media del abdomen hasta el hueso subclavio. Exponga la cavidad abdominal. Después de localizar el hígado en la parte superior del abdomen, retírelo con cuidado y colóquelo en un nuevo plato que contenga PBS estéril.Observe y cuente groseramente la metástasis en el pulmón y el hígado, seguido de la obtención de una imagen. Con una cuchilla estéril, divida los tejidos pulmonares y hepáticos en dos partes. Como se demostró anteriormente, fije una parte y conserve la otra parte en nitrógeno líquido.La curva de crecimiento tumoral se trazó para observar la alteración dinámica del tamaño del tumor. Los tumores crecieron lentamente en la etapa temprana y se volvieron dramáticamente más rápidos en la etapa tardía. Por otro lado, se trazó una curva de supervivencia basada en el tiempo de supervivencia registrado.La mediana de supervivencia de MATC fue de 130 días. Además, se encontró aproximadamente un 92% de metástasis pulmonar en la mayoría de los MATC. En la tinción HE de los tumores primarios y tejidos pulmonares metastásicos de MATC, los tejidos inducibles de un mes mostraron características solidificadas incompletas y la coexistencia de estructuras foliculares y células malignas, mientras que las estructuras foliculares tiroideas desaparecieron y el tumor se solidificó completamente después de una inducción de dos meses.El tumor primario reveló que las células tumorales eran morfológicamente diversas, con células gigantes pleomórficas y células en forma de huso. Además, la tinción HE de tejidos pulmonares metastásicos mostró que el tejido pulmonar normal era una estructura reticular con estructuras alveolares claras y espacios aéreos. Sin embargo, las metástasis pulmonares mostraron una pérdida de la estructura reticular normal, engrosamiento de la cavidad aérea y parénquima pulmonar.Mientras tanto, la tinción inmunohistoquímica del tumor MATC con diferentes anticuerpos mostró células tumorales altamente proliferativas, infiltración de linfocitos, una infiltración extensa de células mieloides, que fue consistente con muestras clínicas. Durante la disección, la ubicación anatómica de la glándula tiroides debe entenderse correctamente. La glándula tiroides se coloca cerca del cartílago tiroides y la tráquea.

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