Name: Análisis unicelular de la expresión de genes de Pseudomonas syringae dentro del tejido vegetal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Aprende un método optimizado para analizar la expresión génica unicelular de Pseudomonas syringae en el apoplasto vegetal mediante citometría de flujo. Esta técnica minimiza la contaminación con restos de planta.

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Este trabajo fue apoyado por la subvención del proyecto RTI2018-095069-B-I00 financiado por MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ y por "ERDP A way of making Europe". J.S.R. fue financiado por el Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020). N.L.P. fue financiado por la Subvención del Proyecto P18-RT-2398 del Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación.

1. Preparación de la planta
<ol><li>Prepare las plantas de Arabidopsis Col-0 siguiendo los pasos a continuación.<ol><li>Llene una maceta de 10 cm de diámetro con una mezcla de sustrato de planta de vermiculita 1:3 (consulte la Tabla de materiales), previamente regada, y cubra la maceta con una malla metálica de 15 cm x 15 cm con agujeros de 1,6 mm x 1,6 mm. Ajuste la malla metálica al suelo húmedo con una banda elástica (Figura 1A).</li>
		<li>Con un palillo de dientes húmedo, siembre semillas de Arabidopsis en los agujeros de la malla metálica. Coloque de tres a cuatro semillas en posiciones distantes dentro de la maceta (Figura 1B, C).</li>
		<li>Cubra las macetas con una cúpula de plástico para mantener una humedad relativa alta e incube durante 72 h a 4 °C para su estratificación. NOTA: La estratificación (incubación a alta humedad y baja temperatura, como se describe) mejora la tasa de germinación y la sincronía de las semillas.</li>
		<li>Transfiera las macetas a una cámara de crecimiento vegetal en condiciones de días cortos (8 h de luz/16 h de oscuridad a 21 °C, intensidad de luz: 100 μmol·m−2·s−1, humedad relativa: 70%).</li>
		<li>Después de la germinación de la semilla (8-10 días), use las pinzas para eliminar la mayoría de las plántulas, manteniendo una plántula en cada una de las posiciones de la maceta (seis plántulas/maceta) (Figura 1D). Retire la cúpula de plástico para destapar las macetas. NOTA: Las plantas estarán listas para usar 4-5 semanas después de la germinación.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare plantas de frijol Phaseolus vulgaris (cultivar Canadian Wonder).<ol><li>Cubra el fondo de una placa de Petri con un pedazo de papel de toalla húmedo y coloque las semillas de frijol encima. Sellar la placa de Petri con cinta quirúrgica e incubar a 28 °C durante 3-4 días (Figura 2A).</li>
		<li>Transfiera las semillas germinadas a una maceta de 10 cm de diámetro llena de una mezcla húmeda de sustrato de planta de vermiculita 1: 3.</li>
		<li>Incubar en una cámara de crecimiento vegetal en condiciones de día largo (16 h de luz/8 h de oscuridad a 23 °C, intensidad de luz: 100 μmol·m−2·s−1, humedad relativa: 70%). NOTA: Las plantas estarán listas para usar 10 días después de la germinación (Figura 2B).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Inoculación de Arabidopsis y plantas de frijol
NOTA: En este estudio, las cepas P. syringae pv. tomate DC3000 y P. syringae pv. se utilizó phaseolicola 1448A.
<ol><li>Preparar el inóculo de P. syringae.<ol><li>Rayar la cepa de P. syringae de interés de una cepa de glicerol de -80 °C en una placa LB (10 g/L triptona, 5 g/L de NaCl, 5 g/L de extracto de levadura y 16 g/L de agar bacteriológico, ver Tabla de materiales) suplementada con los antibióticos apropiados. Incubar a 28 °C durante 40-48 h. NOTA: Se recomienda el uso de antibióticos si la cepa de interés porta un plásmido o un gen de resistencia genómica. Las concentraciones recomendadas de antibióticos para P. syringae son las siguientes: kanamicina (15 μg/ml), gentamicina (10 μg/ml), ampicilina (300 μg/ml) (ver tabla de materiales).</li>
		<li>Raspar la biomasa bacteriana y resuspender en 5 mL de 10 mM MgCl2. Mida el OD600 y ajuste a 0.1 agregando 10 mM MgCl2. NOTA: Un OD600 de 0,1 de un cultivo de P. syringae corresponde a 5 x 107 UFC·mL−1.</li>
		<li>Realizar diluciones seriadas en 10 mM de MgCl2 para alcanzar una concentración final de inóculo de 5 x 105 UFC·mL−1. Preparar 200 mL de inóculo para las plantas de Arabidopsis y 50 mL para las plantas de frijol.</li>
		<li>Inmediatamente antes de la inoculación, agregue el surfactante Silwett L-77 (ver Tabla de materiales) a una concentración final de 0.02% para la inoculación de frijol y 0.01% para Arabidopsis. Tenga en cuenta que Silwett es algo perjudicial para el tejido de Arabidopsis.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar infiltración de vacío.<ol><li>Para la infiltración de Arabidopsis, coloque dos palos de madera formando una X sobre la olla (Figura 1E) y coloque la olla boca abajo sobre una placa de Petri de 14 cm de diámetro que contenga el inóculo de 200 ml (Figura 1F).</li>
		<li>Para la inoculación de hojas de frijol, introducir la hoja en un tubo de centrífuga cónica de 50 ml que contenga el inóculo (Figura 2C).</li>
		<li>Introducir las plantas sumergidas en la solución de inóculo en una cámara de vacío (Figura 1G y Figura 2D) y dar un pulso de 500 mbar durante 30 s para infiltrarse en las hojas. Repita el pulso de vacío 2-3 veces hasta que la hoja esté completamente infiltrada (Figura 1H y Figura 2E).</li>
		<li>Escurrir el exceso de solución de inóculo con un trozo de papel y devolver las plantas a su cámara de crecimiento correspondiente.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Extracción de bacterias del apoplast
<ol><li>Cuatro días después de la inoculación, cortar la parte aérea de la planta Arabidopsis o la hoja inoculada de la planta de frijol y colocarla en una jeringa de 20 ml sin aguja (Figura 2G). Para las hojas de frijol, enrolle la hoja sobre sí misma, dejando la cara abaxial hacia afuera, como se muestra en la Figura 2F.</li>
	<li>Agregue suficiente volumen de agua destilada para cubrir el tejido (generalmente 10-15 ml).</li>
	<li>Inserte el émbolo y, con la jeringa en posición vertical con la punta apuntando hacia arriba, retire el exceso de aire y las burbujas de aire dentro de la jeringa golpeando suavemente el barril hasta que todo el aire se encuentre cerca de la punta. Deslice entonces el émbolo para sacar el aire. Una vez que haya la menor cantidad de aire posible dentro de la jeringa, cubra la punta del cilindro de la jeringa con una película de parafina.</li>
	<li>Presione con cuidado el émbolo para generar presión positiva hasta que el tejido se oscurezca (Figura 1I y Figura 2H). Luego, tire del émbolo para generar presión negativa (Figura 1J y Figura 2I). Repita este paso 3-5 veces.</li>
	<li>Retire la película de parafina y el émbolo y recoja el líquido que contiene las bacterias extraídas con apoplastos, como se muestra en la Figura 2J.</li>
</ol>4. Análisis unicelular de las bacterias extraídas con apoplastos
<ol><li>Visualice por microscopía confocal siguiendo los pasos a continuación.<ol><li>Prepare una solución de agarosa al 1,5% en agua destilada. Una vez fundido, agregue suficiente volumen para llenar el espacio entre dos portaobjetos de microscopía colocados uno al lado del otro y coloque otro portaobjetos encima sobre él (Figura 3). Déjelos secar durante 15 minutos y retire con cuidado el tobogán colocado en la parte superior. Con una cuchilla, corte la almohadilla de agarosa en trozos de 5 mm x 5 mm justo antes de usarla.</li>
		<li>Paralelamente, centrifugar 1 ml de las bacterias extraídas con apoplasto a 12.000 x g durante 1 minuto a temperatura ambiente, retirar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta y resuspender el pellet en 20 μL de agua para concentrar las células. Coloque una gota de 2 μL de las células concentradas en un cubreobjetos de 0,17 mm y cubra la gota con una pieza de 5 mm x 5 mm de la almohadilla de agarosa obtenida previamente en el paso 1, como se representa en la Figura 3.</li>
		<li>Visualice la preparación bacteriana bajo el microscopio confocal (consulte la Tabla de materiales). Para identificar bacterias verdes-fluorescentes, use el láser de excitación a 488 nm y un filtro de emisión que oscile entre 500 nm y 550 nm. Para identificar todas las bacterias, use el campo brillante y combine ambos campos.</li>
		<li>Procese las imágenes confocales utilizando Fiji (consulte la Tabla de materiales). Para hacer esto, use el complemento MicrobeJ para identificar el contorno de la célula bacteriana y medir la intensidad de fluorescencia en su interior. NOTA: Se recomienda la adquisición de imágenes de bacterias aisladas (no agrupadas) para este análisis.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar análisis por citometría de flujo.<ol><li>Tome una alícuota de las suspensiones de bacterias extraídas con apoplastos para analizar utilizando el citómetro de flujo. Adquiere 100.000 eventos.</li>
		<li>Para discriminar entre bacterias y restos vegetales, analice el apoplast extraído de una planta no inoculada y compare el diagrama de puntos que muestra su tamaño de célula de dispersión directa (FSC) frente al tamaño de célula de dispersión lateral (SSC) con el de la suspensión bacteriana extraída de apoplastos. Para identificar bacterias no fluorescentes, utilice los apoplastos extraídos de las plantas inoculadas con bacterias isogénicas no fluorescentes y compare sus emisiones fluorescentes.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Weigel, W. A., Dersch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+heterogeneity%3A+A+bacterial+virulence+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Phenotypic heterogeneity: A bacterial virulence strategy.</a> Microbes and Infection. 20 (9-10), 570-577 (2018).</li>
<li>Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+technologies+to+study+phenotypic+heterogeneity+and+bacterial+persisters%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters.</a> Microorganisms. 9 (11), 2277(2021).</li>
<li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+10+plant+pathogenic+bacteria+in+molecular+plant+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (6), 614-629 (2012).</li>
<li>Morris, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+history+of+the+plant+pathogen+Pseudomonas+syringae+is+linked+to+the+water+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">The life history of the plant pathogen Pseudomonas syringae is linked to the water cycle.</a> The ISME Journal. 2 (3), 321-334 (2008).</li>
<li>Rufián, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscopy+reveals+in+planta+dynamic+interactions+between+pathogenic%2C+avirulent+and+non-pathogenic+Pseudomonas+syringae+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Confocal microscopy reveals in planta dynamic interactions between pathogenic, avirulent and non-pathogenic Pseudomonas syringae strains.</a> Molecular Plant Pathology. 19 (3), 537-551 (2018).</li>
<li>Macho, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subversion+of+plant+cellular+functions+by+bacterial+type-III+effectors%3A+Beyond+suppression+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Subversion of plant cellular functions by bacterial type-III effectors: Beyond suppression of immunity.</a> New Phytologist. 210 (1), 51-57 (2016).</li>
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<li>Rufián, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+chromosome-located+transcriptional+fusions+to+fluorescent+proteins+for+single-cell+gene+expression+analysis+in+Pseudomonas+syringae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generating chromosome-located transcriptional fusions to fluorescent proteins for single-cell gene expression analysis in Pseudomonas syringae.</a> Methods in Molecular Biology. 1734, 183-199 (2018).</li>
<li>Rufian, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+syringae+differentiates+into+phenotypically+distinct+subpopulations+during+colonization+of+a+plant+host%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas syringae differentiates into phenotypically distinct subpopulations during colonization of a plant host.</a> Environmental Microbiology. 18 (10), 3593-3605 (2016).</li>
<li>Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+thaliana-Pseudomonas+syringae+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction.</a> Arabidopsis Book. 1, 0039(2002).</li>
<li>Fouts, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomewide+identification+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+promoters+controlled+by+the+HrpL+alternative+sigma+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genomewide identification of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 promoters controlled by the HrpL alternative sigma factor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2275-2280 (2002).</li>
<li>Huber, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHuber%2C+PJ+%22Robust+Statistics%22">Robust Statistics</a>. , Wiley. New York, NY. (1981).</li>
<li>Freed, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+screen+to+identify+promoters+conferring+high+levels+of+phenotypic+noise%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A simple screen to identify promoters conferring high levels of phenotypic noise.</a> PLoS Genetics. 4 (12), 1000307(2008).</li>
<li>Hirano, S. S., Upper, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+in+the+leaf+ecosystem+with+emphasis+on+Pseudomonas+syringae-a+pathogen%2C+ice+nucleus%2C+and+epiphyte%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on Pseudomonas syringae-a pathogen, ice nucleus, and epiphyte.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (3), 624-653 (2000).</li>
<li>Lindeberg, M., Myers, C. R., Collmer, A., Schneider, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roadmap+to+new+virulence+determinants+in+Pseudomonas+syringae%3A+Insights+from+comparative+genomics+and+genome+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Roadmap to new virulence determinants in Pseudomonas syringae: Insights from comparative genomics and genome organization.</a> Molecular Plant Microbe Interactions. 21 (6), 685-700 (2008).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+leaf+infiltration+assay+for+fine+characterization+of+plant+defense+responses+using+the+Arabidopsis+thaliana-Pseudomonas+syringae+pathosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae pathosystem.</a> Journal of Visualized Experiments. (104), e53364(2015).</li>
<li>O'Leary, B. M., Rico, A., McCraw, S., Fones, H. N., Preston, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+infiltration-centrifugation+technique+for+extraction+of+apoplastic+fluid+from+plant+leaves+using+Phaseolus+vulgaris+as+an+example%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using Phaseolus vulgaris as an example.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), e52113(2014).</li>
<li>Tornero, P., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+quantifying+growth+of+phytopathogenic+bacteria+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 28 (4), 475-481 (2001).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método presentado aquí describe un procedimiento no invasivo que permite la infiltración de bacterias en el tejido foliar de la planta, lo que permite la inoculación rápida de grandes volúmenes y minimiza la interrupción del tejido. Una de las características del complejo de especies de P. syringae es la capacidad de sobrevivir y proliferar dentro del apoplasto de la planta y en la superficie de la planta como epífita14. Por lo tanto, no se puede descartar la posibilidad de que las bac...

Las bacterias patógenas muestran diferencias en diversos fenotipos, dando lugar a la formación de subpoblaciones dentro de poblaciones genéticamente idénticas. Este fenómeno se conoce como heterogeneidad fenotípica y ha sido propuesto como una estrategia de adaptación durante las interacciones bacteriano-huésped1. Los avances recientes en la resolución óptica de microscopios confocales, citometría de flujo y microfluídica, combinados con proteínas fluorescentes, han fomentado el análisis unicelular de poblaciones bacterianas2.
La Pseudomonas syringae gramnegativa es una bacteria patógena vegetal arquetípica debido a su importancia académica y económica3. El ciclo de vida de P. syringae está ligado al ciclo del agua4. P. syringae entra en los espacios intercelulares entre las células mesófilas, el apoplasto de la hoja de la planta, a través de aberturas naturales como estomas o heridas5. Una vez dentro del apoplasto, P. syringae se basa en el sistema de secreción tipo III (T3SS) y los efectores translocados tipo III (T3E) para suprimir la inmunidad de la planta y manipular las funciones celulares de la planta en beneficio del patógeno6. La expresión de T3SS y T3E depende del regulador maestro HrpL, un factor sigma alternativo que se une a los motivos hrp-box en la región promotora de los genes diana7. 
Al generar fusiones transcripcionales localizadas en cromosomas a genes de proteínas fluorescentes aguas abajo del gen de interés, se puede monitorear la expresión génica en función de los niveles de fluorescencia emitidos a nivel de una sola célula8. Utilizando este método, se ha establecido que la expresión de hrpL es heterogénea tanto dentro de cultivos bacterianos cultivados en el laboratorio como dentro de poblaciones bacterianas recuperadas de la planta apoplast 8,9. Aunque el análisis de la expresión génica a nivel unicelular se realiza típicamente en cultivos bacterianos cultivados en medios de laboratorio, tales análisis también pueden llevarse a cabo en poblaciones bacterianas que crecen dentro de la planta, proporcionando así información valiosa sobre la formación de subpoblaciones en el contexto natural. Una limitación potencial para el análisis de poblaciones bacterianas extraídas de la planta es que los métodos clásicos de inoculación por infiltración de presión de jeringa en el apoplasto, seguidos de extracción bacteriana por maceración del tejido foliar, típicamente generan una gran cantidad de restos celulares de plantas que interfieren con el análisis aguas abajo10. La mayoría de los desechos celulares consisten en fragmentos autofluorescentes de cloroplastos que se superponen con la fluorescencia GFP, lo que resulta en resultados engañosos.
El presente protocolo describe el proceso de análisis de la heterogeneidad de la expresión génica unicelular en dos patosistemas modelo: el formado por P. syringae pv. cepa de tomate DC3000 y Arabidopsis thaliana (Col-0), y la otra por la P. syringae pv. phaseolicola cepa 1448A y plantas de frijol (Phaseolus vulgaris cultivar Canadian Wonder). Se propone un método de inoculación basado en la infiltración al vacío utilizando una cámara de vacío y una bomba, lo que resulta en un método rápido y sin daños para infiltrar hojas enteras. Además, como mejora de los protocolos convencionales, se utiliza un método más suave para extraer la población bacteriana del apoplast que reduce significativamente la alteración tisular, basado en la extracción de líquido apoplástico mediante la aplicación de ciclos de presión positiva y negativa utilizando una pequeña cantidad de volumen dentro de una jeringa.

<table><tbody><tr>Cubreobjetos <td></td><td></td> de <td>0,17 mm</td><td>Sin requisitos especiales Malla</td></tr><tr><td>metálica de 1,6 x 1,6 mm</td><td>Malla de pantalla de fibra de vidrio</td><td>Buzifu</td><td></td></tr><tr><td>Macetas de 10 cm de diámetro</td><td>Sin requisitos especiales</td>Placas <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> de<td>Petri de 140 mm</td><td>Sin requisitos especiales</td></tr><tr><td>Jeringa de</td><td></td><td></td> 20 mL <td>Sin requisitos especiales</td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Merk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina sódica</td><td>GoldBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar bacteriológico</td><td>Roko</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal Stellaris</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSVerse analizador de células</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de gentamicina</td><td>Duchefa</td><td>G-0124</td><td></td></tr><tr><td>Monosulfato de kanamicina</td><td>Fitotecnología</td><td>K378</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Merk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Pechiney Sustrato</td> de la planta de envasado <td></td><td></td>de plástico</tr><tr><td></td> Sin requisitos especiales <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>Cromton Europe Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Palillos de dientes</td><td>Sin requisitos especiales</td>Pinzas <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> de triptona Merk <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sin requisitos especiales</td>Cámara de vacío de 25 cm de diámetro Kartell 554 Bomba de vacío GAST DOA-P504-BN <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vermiculita</td><td></td><td></td><td>Sin requisitos especiales</td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Merk</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

análisis unicelular de la expresión de genes de pseudomonas syringae dentro del tejido vegetal

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

Una gran cantidad de microorganismos patógenos atacan constantemente a las plantas. El complejo de especies de Pseudomonas syringae engloba bacterias fitopatógenas gramnegativas de especial relevancia para un amplio número de hospedadores. P. syringae entra en la planta desde la superficie de la hoja y se multiplica rápidamente dentro del apoplasto, formando microcolonias que ocupan el espacio intercelular. La expresión constitutiva de proteínas fluorescentes por parte de las bacterias permite la visualización de las microcolonias y el seguimiento del desarrollo de la infección a nivel microscópico. Los avances recientes en el análisis de células individuales han revelado la gran complejidad alcanzada por las poblaciones bacterianas isogénicas clonales. Esta complejidad, conocida como heterogeneidad fenotípica, es la consecuencia de las diferencias de célula a célula en la expresión génica (no vinculadas a diferencias genéticas) entre la comunidad bacteriana. Para analizar la expresión de loci individuales a nivel de una sola célula, se han utilizado ampliamente fusiones transcripcionales a proteínas fluorescentes. Bajo condiciones de estrés, como las que ocurren durante la colonización del apoplasto de la planta, P. syringae se diferencia en distintas subpoblaciones basadas en la expresión heterogénea de genes clave de virulencia (es decir, el sistema de secreción Hrp tipo III). Sin embargo, el análisis unicelular de cualquier población dada de P. syringae recuperada del tejido vegetal es un desafío debido a los desechos celulares liberados durante la interrupción mecánica intrínseca a los procesos de inoculación y extracción bacteriana. En el presente informe se detalla un método elaborado para vigilar la expresión de los genes de P. syringae de interés a nivel unicelular durante la colonización de Arabidopsis y plantas de frijol. Se describe la preparación de las plantas y las suspensiones bacterianas utilizadas para la inoculación mediante una cámara de vacío. La recuperación de bacterias endófitas de hojas infectadas por extracción de fluido apoplástico también se explica aquí. Tanto la inoculación bacteriana como los métodos de extracción bacteriana están optimizados empíricamente para minimizar el daño de las células vegetales y bacterianas, lo que resulta en preparaciones bacterianas óptimas para el análisis de microscopía y citometría de flujo.

La expresión del sistema de secreción tipo III es esencial para el crecimiento bacteriano dentro de la planta. La expresión oportuna de los genes T3SS se logra a través de una regulación intrincada, en cuyo centro se encuentra el factor sigma HrpL de función extracitoplasmática (ECF), el activador clave de la expresión de genes relacionados con T3SS11. Previamente se realizó un análisis de la expresión de hrpL utilizando una fusión transcripcional localizada en cromosomas a un gen gfp...

El presente protocolo describe un método que permite el análisis de expresión génica unicelular en poblaciones de Pseudomonas syringae cultivadas dentro del apoplasto vegetal.

Análisis unicelular de la expresión de genes de Pseudomonas syringae dentro del tejido vegetal

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...

Nuestro protocolo proporciona un método suave de inoculación y extracción de plantas que permite recuperar poblaciones bacterianas cultivadas en el apoplasto foliar adecuado para el análisis de expresión génica unicelular, como la citometría de flujo. Este método permite la extracción de una cantidad considerable de bacterias del apoplast sin contaminar significativamente las muestras con restos celulares vegetales. Este método optimizado para la recuperación de bacterias apoplásicas se puede aplicar directamente o con modificaciones menores a una serie de sistemas bacterianos de plantas que comprenden bacterias patógenas de plantas o bacterias endocíticas beneficiosas.Demostrando el procedimiento estará Nieves López-Pagán, estudiante de doctorado de nuestro laboratorio. Para comenzar, llene una maceta de 10 centímetros de diámetro con una mezcla de sustrato vegetal de vermiculita 1: 3 previamente regada. Cubra la maceta con una malla metálica perforada y ajuste la malla metálica al suelo húmedo con una banda elástica.A continuación, siembre semillas de Arabidopsis en los orificios de la malla metálica con un palillo de dientes húmedo. Coloque de tres a cuatro semillas en posiciones distantes dentro de la maceta. Cubra la olla con una cúpula de plástico para mantener alta humedad relativa e incube para la estratificación a cuatro grados centígrados durante 72 horas.Transfiera la maceta a una cámara de crecimiento de plantas en condiciones de días cortos. Para destapar la olla, retire la cúpula de plástico. Una vez germinadas las semillas, usa las pinzas para retirar la mayoría de las plántulas, manteniendo una plántula en cada una de las posiciones de la maceta.Luego prepare las plantas de frijol Phaseolus vulgaris cubriendo el fondo de una placa de Petri con un trozo de toalla de papel húmeda y colocando las semillas de frijol encima. Selle la placa de Petri con cinta quirúrgica e incube a 28 grados centígrados durante tres o cuatro días. Transfiera las semillas germinadas a una maceta de 10 centímetros de diámetro llena con una mezcla húmeda de sustrato vegetal de vermiculita 1: 3 e incube en una cámara de crecimiento de plantas en entornos de día largo.Extraiga el stock de glicerol de la cepa de siringas de Pseudomonas de interés de menos 80 grados centígrados en una placa LB suplementada con los antibióticos apropiados. Incubar la placa a 28 grados centígrados durante 40 a 48 horas. Raspa la biomasa bacteriana y resuspendela en cinco mililitros de cloruro de magnesio de 10 milimolares.Mida la densidad óptica a 600 nanómetros y ajústela a 0.1 agregando cloruro de magnesio de 10 milimolares. Realice diluciones seriadas en cloruro de magnesio 10 milimolares para obtener una concentración final de inóculo de cinco veces 10 a la quinta UFC por mililitro. Luego, prepare 200 mililitros de inóculo para las plantas de Arabidopsis y 50 mililitros para las plantas de frijol.Antes de la inoculación, añadir el tensioactivo Silwet L-77 a una concentración final de 0,02% para la inoculación de frijol y 0,01% para Arabidopsis. Para la infiltración de Arabidopsis, coloque dos palos de madera formando una X sobre la olla y coloque la olla boca abajo sobre una placa de Petri de 14 centímetros de diámetro que contiene 200 mililitros de inóculo. Para la inoculación de hojas de frijol, inserte las plantas y la solución de inóculo en una cámara de vacío e introduzca la hoja en un tubo de centrífuga cónica de 50 mililitros que contiene el inóculo.Dar un pulso de 500 milibares durante 30 segundos para infiltrarse en las hojas. Escurrir el exceso de solución de inóculo con un trozo de papel y devolver los planos a su cámara de crecimiento correspondiente. Cuatro días después de la inoculación, corte la parte aérea de la planta Arabidopsis o la hoja inoculada de la planta de frijol y colóquela en una jeringa de 20 mililitros sin aguja.Para las hojas de frijol, enrolle la hoja sobre sí misma, dejando la cara abaxial hacia afuera. Agregue suficiente volumen de agua destilada para cubrir el tejido. Luego, inserte el émbolo que sostiene la jeringa en posición vertical y retire el exceso de aire y las burbujas de aire dentro de la jeringa golpeando suavemente el barril hasta que todo el aire esté ubicado cerca de la punta y, después de retirar el aire, cubra la punta del cilindro de la jeringa con una película de parafina.Ahora presione cuidadosamente el émbolo para generar presión positiva hasta que el tejido se oscurezca. Luego, tire del émbolo para generar presión negativa. Retire la película de parafina y el émbolo y recoja el líquido que contiene las bacterias extraídas por el apoplasto.Para un análisis de una sola célula, prepare una solución de agarosa al 1,5% en agua destilada. Una vez fundido, agregue suficiente volumen para llenar el espacio entre dos portaobjetos de microscopía colocados uno al lado del otro y coloque otro portaobjetos encima. Déjelos conducir durante 15 minutos y retire el tobogán colocado en la parte superior con cuidado.Con una cuchilla, corte la almohadilla de agarosa en trozos de cinco milímetros por cinco milímetros antes de usarlos. Paralelamente, centrifugar un milímetro de las bacterias extraídas por el apoplasto. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta y vuelva a suspender el pellet en 20 microlitros de agua para concentrar las células.Coloque una gota de dos microlitros de las células concentradas en un cubreobjetos de 0,17 milímetros y cubra la gota con un trozo de almohadilla de agarosa. Visualice la preparación bacteriana bajo el microscopio confocal para identificar bacterias fluorescentes verdes utilizando láseres específicos. Identifique todas las bacterias usando el campo brillante y combine ambos campos.Para realizar el análisis por citometría de flujo, tome una alícuota de las suspensiones de bacterias extraídas con apoplastos. Analice usando el citómetro de flujo y adquiera 100, 000 eventos. La expresión de hrpL GFP es monitoreada por fluorescencia GFP.Los gráficos de diagramas de puntos muestran la distribución de la intensidad de fluorescencia de GFP versus el tamaño celular en la población, mientras que los histogramas muestran la intensidad de fluorescencia de GFP versus recuentos celulares. Los porcentajes de hrpL ON fueron más altos que los porcentajes correspondientes de hrpL OFF. Las imágenes de microscopía de fluorescencia muestran niveles heterogéneos de GFP asociados con la expresión de hrpL.Se observan bacterias que muestran baja o ninguna fluorescencia GFP. Para obtener resultados óptimos, sea suave durante los pasos de extracción de bacterias para evitar dañar el tejido vegetal y así limitar la contaminación del contenido celular de la planta. Las muestras de bacterias obtenidas se pueden utilizar para otros fines en los que la reducción de la contaminación de las plantas es una ventaja, como las extracciones de ácidos nucleicos para su posterior análisis genómico o transcriptómico bacteriano.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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Extracción de bacterias apoplásicas usando un método de presión basado en jeringuilla

Fuente: Rufián, J. S., et al. Análisis unicelular de la expresión de genes de Pseudomonas syringae en el tejido vegetal. J. Vis. Exp. (2022).Este vídeo demuestra un método para analizar la expresión génica en bacterias patógenas extraídas de plantas a nivel unicelular utilizando un factor de transcripción marcado con fluorescencia. La imagen confocal revela heterogeneidad en la expresión génica de virulencia, destacando la diversidad funcional dentro de una población bacteriana clonal.

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