Cuantificación de complejos mieloperoxidasa-ADN y neutrófilos elastasa-ADN a partir de trampas extracelulares de neutrófilos mediante el uso de un ELISA sándwich modificado

Los TNE han atraído la atención recientemente, pero cuantificarlos in vivo ha demostrado ser un desafío. Este protocolo proporciona un método deseable, altamente sensible y valioso para investigar las características de los TNE en entornos clínicos. Esta técnica debe extenderse para evaluar la gravedad de la sepsis o SDRA séptico, síndrome de dificultad respiratoria aguda.

Es ampliamente aceptado que la regulación de los vertederos o los patrones moleculares asociados al daño es clave para mejorar el estado clínico de la sepsis. La mayor ventaja de este método incluye la cuantificación precisa de los restos de NET circulantes como la mieloperoxidasa-ADN y la elastasa de neutrófilos-ADN en poco tiempo. Es aconsejable centrifugar las muestras antes del ensayo y evitar la descongelación repetida.

Es importante seguir los tiempos de incubación indicados en el protocolo. Comience diluyendo neutrófilos polimorfonucleares recién aislados a 10.000 células por mililitro en RPMI 1640 libre de rojo de fenol. Tamizarlos en placas de cultivo de 35 milímetros.

Para inducir trampas extracelulares de neutrófilos o NETs, primero hay que estimular los neutrófilos polimorfonucleares con PMA 25 nanomolares. A continuación, digiere parcialmente las trampas extracelulares añadiendo 0,6 microgramos por mililitro de DNasa I, e incuba la mezcla durante 50 minutos a temperatura ambiente. Ahora, agregue cinco milimolares de EDTA para detener la actividad de la DNasa y recoja el medio que contiene los NET sintetizados.

Centrifugar para eliminar los restos de la célula. Recoja los sobrenadantes de cuatro controles sanos. Mézclalos y guárdalos a menos 80 grados centígrados para su uso posterior.

Pipetear 100 microlitros de antimieloperoxidasa diluida que contenga 0,05 microgramos del anticuerpo en una placa ELISA. Ahora, cubra la placa con una cubierta de plástico adhesiva para evitar la evaporación de la muestra e incube la muestra durante la noche a cuatro grados centígrados para permitir la unión de los anticuerpos de captura. Al día siguiente, deseche la solución de anticuerpos diluida de los pocillos y pipetee 300 microlitros de solución de lavado en cada pocillo.

Seque el plato con una toalla de papel para eliminar el exceso de PBS. Bloquee cada pocillo de la placa con 200 microlitros del tampón de bloqueo. Cúbralo con una cubierta de plástico adhesiva y obstruya los pocillos incubándolo.

Después de desechar la solución de bloqueo de los pocillos y lavar el plato tres o cuatro veces, séquelo con una toalla de papel. A continuación, pipetee 25 microlitros de plasma en todos los pocillos excepto en el blanco. Y diluirlo con 75 microlitros de PBS, haciendo que el volumen final del pocillo sea de 100 microlitros.

Luego agregue 100 microlitros de PBS al pocillo en blanco. Mezcle las muestras colocando la placa en un agitador durante 10 segundos a 250 rpm a temperatura ambiente. Agregue dos microlitros de 100 DNasa I completamente diluida a todos los pocillos y coloque la placa sellada en el agitador durante 10 segundos para mezclar bien las muestras.

Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Agregue un microlitro de EDTA 0.5 molar a cada pocillo para detener la reacción de la DNasa. A continuación, coloque la placa sellada en el agitador durante 15 segundos para mezclar bien las muestras.

Finalmente, incube la placa durante la noche a cuatro grados centígrados para permitir que los componentes proteicos de los NET se unan a los anticuerpos de captura. Al día siguiente, deseche la solución de los pozos. Después de varios lavados de pocillos, pipetee 100 microlitros del anticuerpo de detección de ADN conjugado con peroxidasa diluida en cada pocillo.

Incube la placa durante 1 1/2 horas y luego deseche la solución en los pocillos. Después de lavar los pocillos tres veces, pipetee 100 microlitros de solución de sustrato ABTS en cada pocillo e incube la placa sellada en un agitador en la oscuridad. Detenga la reacción agregando 50 microlitros de ácido sulfúrico bimolar.

Mezcle el contenido del pocillo golpeando con cuidado los lados del plato. A continuación, conecte el lector de microplacas a la computadora e inicie la aplicación de software. En la barra de estado, cree un nuevo experimento y asígnele un nombre.

A continuación, establezca los parámetros de lectura de la placa seleccionando Absorbancia como tipo de lectura, Punto final como modo de lectura y dos como longitudes de onda. A continuación, establezca lambda uno como 405 nanómetros, lambda dos como 490 nanómetros. Ahora, seleccione el estado Desactivado tanto para la mezcla automática como para el borrado mientras mantiene la calibración automática activada.A continuación, seleccione Leer toda la placa en Tiras.

Por último, establezca la Prioridad de longitud de onda de columna con Normal como velocidad de carro y, a continuación, seleccione Desactivado en Autolectura. Coloque bien la placa en el cajón de instrumentos y ciérrelo. Haga clic en Leer para que la placa se lea inmediatamente.

Lea la absorbancia de cada pocillo a 405 nanómetros y realice la sustracción automática de la absorbancia del medio de ensayo de todas las muestras desconocidas. Se obtuvieron curvas de calibración estándar fiables tanto para el ADN-MPO como para el ADN NE cuando los valores de absorbancia no superaron 0,93 y 0,9, respectivamente. La mayor DO se obtuvo cuando se aplicaron 0,6 microgramos por mililitro de DNasa I.

Los coeficientes de variabilidad entre ensayos para los complejos en controles sanos fueron de 1,871 y 0,987, respectivamente, mientras que los pacientes con COVID-19 mostraron coeficientes de variabilidad de 2,532 y 2,010, respectivamente. Los coeficientes medios de variabilidad entre ensayos para MPO-DNA y NE-DNA fueron de 6,524 y 4,389, respectivamente. La especificidad de los anticuerpos de captura a los complejos MPO-ADN y NE-ADN mostró que los anticuerpos de control de isotipo reaccionaron poco a los complejos.

El porcentaje de ambos complejos fue mayor en el plasma de pacientes con COVID-19 en relación con los controles sanos. Se debe optimizar el tiempo de digestión de la DNasa, de lo contrario, una digestión excesiva reducirá la absorbancia.