Name: Cuantificación de complejos mieloperoxidasa-ADN y neutrófilos elastasa-ADN a partir de trampas extracelulares de neutrófilos mediante el uso de un ELISA sándwich modificado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Aprenda a cuantificar complejos MPO-ADN y NE-ADN de trampas extracelulares de neutrófilos mediante un ELISA sándwich modificado. Este método sensible permite evaluar la gravedad de la sepsis en entornos clínicos.

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Los autores agradecen al Dr. Huq Muhammad Aminul por su ayuda en la revisión del manuscrito.

Este estudio se llevó a cabo de conformidad con la Declaración de Helsinki y fue aprobado por las juntas de revisión institucional de la Universidad Médica de Aichi (2017-H341, 2019-H137). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada participante.
1. Preparación de reactivos
NOTA: Para realizar el ensayo ELISA sándwich, los reactivos se preparan como se describe a continuación.
<ol><li>Tampón de recubrimiento:<ol><li>Para hacer un tampón de carbonato-bicarbonato de 0,1 mol/L, pesar 10,6 g de carbonato de sodio anhidro (peso molecular, 106 g/mol) y 8,4 g de bicarbonato de sodio (peso molecular, 84 g/mol).</li>
		<li>Añádalo a aproximadamente 900 ml de agua destilada en un vaso de precipitados.</li>
		<li>Ajuste el pH del tampón a 9,6 añadiendo la cantidad necesaria de ácido clorhídrico diluido o hidróxido de sodio.</li>
		<li>Compruebe el pH con un medidor de pH.</li>
		<li>Luego, agregue el volumen requerido de agua destilada para lograr un volumen total de 1,000 mL.</li>
		<li>Conservar este tampón carbonato-bicarbonato 0,1 mol/L en el frigorífico a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Búfer de bloqueo:<ol><li>Añadir aproximadamente 250 μL de azida sódica al 20% y 1 g de albúmina sérica bovina (BSA) a 70 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) compuesta por 137 mmol/L de NaCl, 8,1 mmol/L deNa2HPO 4, 2,68 mmol/L de KCl y 1,47 mol/L de KH2PO 4 (pH 7,4), y mezclar suavemente.</li>
		<li>Agregue agua destilada para lograr un volumen total de 100 ml. Las concentraciones finales de albúmina sérica bovina y azida sódica son del 1% y 0,05%, respectivamente. Espere 10 minutos y luego la solución estará lista para usar.</li>
	</ol></li>
	<li>Solución de lavado: Preparar t-octilfenoxipolietoxietanol al 0,5%, éter de terc-octilfenilo de polietilenglicol (Triton X-100) en agua destilada.<ol><li>Diluya Triton X-100 al 100 % al 10 % con agua destilada y deje reposar la solución al 10 % durante 1 día antes de usarla.</li>
		<li>A continuación, vuelva a diluir la solución de Triton X-100 al 10% 20 veces con agua destilada para lograr una concentración del 0,5%.</li>
	</ol></li>
	<li>Dilución de anticuerpos:<ol><li>Diluir el anticuerpo de captura (anticuerpo anti-MPO [1 mg/ml] o anticuerpo anti-NE [1 mg/ml]) a 1:2.000 en el tampón de recubrimiento (pH 9,6) antes de su uso en el día 1 del ensayo (ver más abajo) y el anticuerpo de detección (anticuerpo anti-ADN conjugado con peroxidasa) a 1:40 con PBS antes de su uso en el día 3 del ensayo (ver más abajo). NOTA: Para el experimento preliminar, diluir los anticuerpos de tipo ISO (IgG de conejo [5 mg/mL] e IgG1 clon de ratón Ci4 [0,5 mg/mL]) a 1:10.000 y 1:1.000 en el tampón de recubrimiento (pH 9,6).</li>
	</ol></li>
	<li>Solución de sustrato ABTS: Dependiendo del número de muestras, disuelva una, dos o tres tabletas de 2,2'-azino-bis (3 ácido etilbenzotiazolina-6-sulfónico (ABTS) en 5 ml, 10 ml o 15 ml de tampón ABTS (que contiene perborato de sodio, ácido cítrico e hidrogenofosfato disódico); se necesitan 100 μL por muestra. Conservar la solución preparada a 2-8 °C protegida de la luz. La solución es estable hasta por 3 meses.</li>
</ol>2. Recogida y almacenamiento de muestras
<ol><li>Aislamiento de plasma:<ol><li>Recoger 4 ml de muestras de sangre periférica en un tubo de extracción de sangre de heparina de litio mediante venopunción con una jeringa de 22 g y centrifugar a 1.600 x g durante 10 min a 4 °C.</li>
		<li>Transfiera el sobrenadante a un tubo de muestra con cierre seguro de 2 ml.</li>
		<li>Vuelva a centrifugar el sobrenadante a 16.000 x g durante 10 minutos a 4 °C para eliminar las células residuales.</li>
		<li>Recoja el sobrenadante en un nuevo tubo de muestra con cierre seguro sin alterar el gránulo en la parte inferior del tubo.</li>
		<li>Almacenar el plasma obtenido a -80 °C hasta su uso posterior. NOTA: Para obtener resultados de alto rendimiento con este ensayo, se requieren muestras de buena calidad. Si se utilizan muestras de plasma, realice una segunda centrifugación para eliminar las células residuales. Evite la descongelación repetida de las muestras. Use heparina como anticoagulante porque el EDTA afecta la actividad de la DNasa.</li>
	</ol></li>
	<li>Aislamiento de neutrófilos polimorfonucleares<ol><li>Recoger las muestras de sangre periférica en un tubo de extracción de sangre con heparina de litio mediante venopunción con una jeringa de 22 G.</li>
		<li>Coloque 6 ml de sangre en 6 ml de polimorfos de un solo paso y centrifugue los tubos a 1.000 x g durante 45 minutos a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Coseche la tercera capa de capa leucocitaria que contiene neutrófilos y lávela tres veces en rojo de fenol RPMI-1640 a 400 x g durante 10 min a RT.</li>
		<li>Resuspender los neutrófilos en RPMI-1640 libre de rojo de fenol que contiene 2 mM de L-glutamina suplementada con suero fetal bovino inactivado por calor al 6%, y contar las células en el campo del microscopio con un hemocitómetro. NOTA: Este método produce una pureza del 96 % al 98 % con una viabilidad superior al 95 %, según lo evaluado mediante la exclusión del colorante azul de tripano.</li>
	</ol></li>
	<li>Activación de neutrófilos polimorfonucleares y NETosis in vitro
	<ol><li>Diluir neutrófilos polimorfonucleares recién aislados a 1 × 105 células/ml en RPMI-1640 libre de rojo de fenol que contenga 2 mM de L-glutamina suplementada con suero fetal bovino inactivado por calor al 6%, y sembrarlos en placas de cultivo de 35 mm.</li>
		<li>Para inducir NETs, estimular neutrófilos polimorfonucleares con PMA de 25 nM durante 4 h a 37 °C en aire con 5% de CO2/95%.</li>
		<li>Después de 4 h de incubación, digiera parcialmente los NETs añadiendo 0,6 μg/mL de DNasa I directamente a las placas de cultivo durante 15 min a RT, y detenga la actividad de la DNasa I añadiendo 5 mM de EDTA.</li>
		<li>Recoger el medio que contiene los NET sintetizados y centrifugar a 400 x g durante 10 min a 4 °C para eliminar los restos celulares.</li>
		<li>Obtener los sobrenadantes de cuatro controles sanos, mezclar y almacenar a -80 °C hasta su uso. NOTA: Los neutrófilos estimulados por PMA digeridos por DNasa obtenidos de cuatro controles sanos se utilizan como estándar NET 1,14,15. Genere una curva de calibración a partir de un patrón NET diluido en serie con PBS y asigne los valores de densidad óptica (OD) obtenidos de un patrón NET sin diluir como 100% NET.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Método de ensayo
NOTA: Los pasos para realizar el ensayo se describen en detalle a continuación.
<ol><li>Día 1<ol><li>Aplique un total de 100 μL de anticuerpo anti-MPO o anti-NE diluido que contenga 0,05 μg de anticuerpo a cada pocillo de la placa, incluido el pocillo en blanco. NOTA: El tampón de recubrimiento no debe contener ningún tipo de detergente porque, de lo contrario, es posible que los anticuerpos no se unan de manera uniforme y suave a las paredes de cada pocillo. Para evitar el efecto gancho, la concentración de proteína de recubrimiento no debe ser superior a 20 μg/mL, ya que las concentraciones por encima de ese nivel saturarán la mayoría de los sitios disponibles en la placa de microtitulación. El rango de concentración típico de las soluciones de recubrimiento de proteínas es de 2-10 μg/mL. Para el experimento preliminar, se utilizó un anticuerpo de control de tipo IgG diluido para el recubrimiento en lugar de anticuerpos monoclonales específicos contra MPO. Utilice el anticuerpo de control de tipo IgG1 diluido en ratones para el recubrimiento en lugar de anticuerpos monoclonales específicos contra NE.</li>
		<li>Cubrir la placa con una cubierta adhesiva de plástico para evitar la evaporación de la muestra, e incubar durante la noche a 4 °C para permitir la unión de los anticuerpos de captura.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 2<ol><li>Deseche la solución de anticuerpos diluida de los pocillos y, a continuación, pipetee 300 μL de solución de lavado por pocillo y repita este procedimiento de lavado de tres a cuatro veces.</li>
		<li>Retire el exceso de PBS golpeando el plato para secarlo con una toalla de papel.</li>
		<li>Bloquee cada pocillo de la placa ELISA con 200 μL del tampón de bloqueo.</li>
		<li>Cubra bien la placa con una cubierta de plástico adhesiva e incube durante 1,5-2 h a RT para obstruir los pocillos.</li>
		<li>Deseche completamente la solución de bloqueo de los pocillos y luego pipetee 300 μL de solución de lavado por pocillo y repita este procedimiento de lavado tres o cuatro veces.</li>
		<li>Retire el exceso de PBS golpeando el plato para secarlo con una toalla de papel.</li>
		<li>Aplique un total de 25 μL de plasma o medio a cada pocillo, excepto al pocillo en blanco, y agregue 75 μL de PBS como diluyente para que el volumen final sea de 100 μL; añadir 100 μL de PBS al pocillo en blanco.</li>
		<li>A continuación, mezcle las muestras a RT durante 10 s colocando la placa en un agitador a 250 rpm.</li>
		<li>Aplique 2 μL de DNasa I diluida 100 veces (0,03 mg/mL) a cada pocillo, incluido el pocillo en blanco (concentración final de DNasa I en la mezcla de reacción: 0,6 μg/mL).</li>
		<li>Selle la placa con una cubierta de plástico adhesiva y mezcle bien las muestras a RT durante 10 s colocando la placa en un agitador a 250 rpm. NOTA: Para evaluar las condiciones óptimas para la digestión del ADN, al desarrollar el ensayo, incubamos muestras que contenían ADN asociado a MPO de pacientes con COVID-19 con 0-0,9 μg/ml de DNasa I durante 15 min en RT y utilizamos placas recubiertas con un anticuerpo de captura específico para MPO o un anticuerpo de control de isotipo emparejado con la especie.</li>
		<li>Incubar las muestras durante 15 min en RT.</li>
		<li>Retire la cubierta de plástico adhesiva y aplique 1 μL de EDTA 0,5 M a cada pocillo para detener la reacción de la DNasa.</li>
		<li>Vuelva a sellar la placa con una cubierta de plástico adhesiva y agítela a RT durante 15 s colocándola en un agitador a 250 rpm.</li>
		<li>A continuación, incubar la placa durante la noche a 4 °C para permitir que los componentes proteicos de los NET se adhieran a los anticuerpos de captura.</li>
	</ol></li>
	<li>Día 3<ol><li>Retire la cubierta adhesiva de plástico y deseche la solución de los pocillos.</li>
		<li>Deseche completamente la solución de los pocillos y, a continuación, pipetee 300 μL de la solución de lavado por pocillo y repita este procedimiento de lavado tres o cuatro veces.</li>
		<li>Aplique un total de 100 μL del anticuerpo de detección de ADN conjugado con peroxidasa diluida a cada pocillo.</li>
		<li>Selle la placa herméticamente con una cubierta de plástico adhesiva e incube durante 1,5 h a RT.</li>
		<li>Deseche la solución completamente de los pocillos y, a continuación, pipetee 300 μL de solución de lavado por pocillo y repita este procedimiento de lavado tres o cuatro veces.</li>
		<li>Retire con cuidado la solución residual.</li>
		<li>Aplique un total de 100 μL de solución de sustrato ABTS a cada pocillo y cubra la placa con una cubierta de plástico adhesiva.</li>
		<li>Incubar la placa en la oscuridad a RT durante 20-30 min en una coctelera a 250 rpm. NOTA: Supervise la placa a intervalos de 5 minutos hasta que se obtengan las lecturas de OD deseadas.</li>
		<li>Añadir un total de 50 μL de ácido sulfúrico 2 M para detener la reacción.</li>
		<li>Mezcle el contenido líquido de los pocillos golpeando con cuidado el costado del plato.</li>
		<li>Encienda el lector de microplacas y conéctelo a la computadora.</li>
		<li>Abra la aplicación de software en la computadora.</li>
		<li>En la barra de estado, cree un nuevo experimento y asígnele un nombre.</li>
		<li>Configure todos los siguientes parámetros para la lectura de placas: Tipo de lectura, Absorbancia; Modo de lectura, Endpoint; Longitudes de onda, 2; Lm-1, 405 nm; Lm-2, 490 nm; Mezcla automática y supresión antes, desactivada; Placa de prelectura, apagado; Calibración automática, activada; Tiras, lea todo el plato; Prioridad de longitud de onda de columna, Prioridad de columna; Velocidad de carro, Normal; y Lectura automática, Desactivado.</li>
		<li>Luego, coloque la placa de 96 pocillos que contiene las muestras en el cajón y ciérrelo.</li>
		<li>Por último, seleccione el botón Leer para que la placa se lea inmediatamente.</li>
		<li>Lea la absorbancia de cada pocillo a una longitud de onda de 405 nm utilizando un lector de microplacas (en esta etapa, use una longitud de onda de 490 nm como referencia).</li>
		<li>Realice la sustracción automática del valor de absorbancia del medio de ensayo solo de todas las muestras desconocidas y guarde los datos. NOTA: Utilice una curva patrón obtenida a partir de un patrón NET diluido en serie para calcular la concentración relativa de NET en la muestra 1,14,15. Aquí, los resultados finales se presentan como "complejos de ADN MPO o NE (% del estándar NET)". El límite de detección (LOD) se calculó a partir de la desviación estándar (DE) y la pendiente de la curva de calibración (S) de la siguiente manera: LOD = 3,3(DE/S).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Estadísticas
<ol><li>Realizar todos los análisis estadísticos utilizando un software de análisis estadístico adecuado. Aquí se utilizó SigmaPlot v14.5. Los porcentajes y las variables continuas se muestran como la mediana con el rango intercuartílico debido a la distribución sesgada de la mayoría de los parámetros.</li>
	<li>Compare los niveles plasmáticos de MPO-DNA y NE-DNA entre pacientes con COVID-19 y controles sanos mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. Utilice el análisis de correlación para explorar la relación entre la densidad óptica y el porcentaje de NET-estándar.</li>
</ol>

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</ol>

Todos los datos generados y/o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado. Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Hemos descrito un método ELISA sándwich en el que MPO o NE se une a un sitio del anticuerpo de captura durante la incubación inicial de muestras que contienen complejos MPO-ADN o NE-ADN. Después del lavado, el "sándwich" se completa incubando las muestras con un anticuerpo monoclonal anti-ADN asociado a la peroxidasa. Después de la eliminación del anticuerpo secundario no unido, el conjugado de peroxidasa unido se detecta mediante la adición de un sustrato cromogénico de peroxidasa ABTS, que produce un producto final sol...

Este artículo describe un método para cuantificar la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET) en fluidos biológicos mediante el uso de un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas sándwich (ELISA) para detectar complejos de mieloperoxidasa (MPO) y elastasa de neutrófilos (NE) con ADN 1,2. Los TNE están compuestos por una columna vertebral de ADN decorada con proteasas antimicrobianas que se originan a partir de gránulos de neutrófilos 3,4. Tanto los complejos MPO-ADN como NE-ADN son componentes importantes y específicos de los TNE y se liberan en el espacio extracelular como productos de degradación de los TNE 3,4.
Además de su importante papel fisiológico en la defensa antimicrobiana3, los TNE también tienen varios efectos patológicos4,5, incluyendo la promoción de la trombogénesis6 y el empeoramiento de la sepsis7. En consecuencia, las NET han ido ganando atención recientemente. Sin embargo, la cuantificación in vivo de los NET ha demostrado ser un reto debido a la falta de un método de ensayo cuantitativo sensible y fiable.
Existen algunos métodos, incluida la medición directa de los NET mediante microscopía de fluorescencia8,9 y citometría de flujo 10 y la medición indirecta del ADN libre de células circulantes, los nucleosomas y la histona C3 citrulinada, pero cada método tiene sus propias ventajas y limitaciones11. Aunque el método microscópico de inmunofluorescencia es específico de los tumores neuroendocrinos y muestra claramente la localización y el grado de formación de los tumores neuroendocrinos, las muestras se limitan al tejido de la biopsia y a los materiales secretados. Además, este método debe ser realizado por investigadores calificados y requiere mucho tiempo para obtener resultados. La medición de los niveles circulantes de componentes relacionados con NET mediante citometría de flujo es fácil y proporciona resultados rápidamente; sin embargo, el método no es específico de las NET12.
Nosotros13 y otros1,2 hemos desarrollado un ensayo altamente sensible y confiable para medir los componentes circulantes de NET, ADN conjugado con MPO o conjugado con NE, en plasma humano con una técnica ELISA modificada que utiliza anticuerpos específicos para MPO o NE como anticuerpos de captura y un anticuerpo de detección específico de ADN. Este ensayo también se puede utilizar ex vivo para identificar los componentes de NET en los sobrenadantes de cultivo celular liberados por los neutrófilos activados en respuesta a la estimulación del forbol 12-miristato 13-acetato (PMA).

<table><tbody><tr><td>Polimorfos de 1 paso</td><td>Precise Chemical and Scientific Corporation</td><td>AN221725</td><td>el aislamiento de PMN de sangre humana.</td></tr><tr><td>Placa de microtitulación de 96 pocillos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>467466</td><td></td></tr><tr><td>solución tampón ABTS</td> de fondo plano <td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>11 204 530 001</td><td>Contiene perborato de sodio, ácido cítrico y fosfato de hidrógeno disódico.</td></tr><tr><td>Comprimidos ABTS</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>11 204 521 001&nbsp;</td><td>Cada comprimido contiene 5 mg de sustrato ABTS y 60 mg de sustancias vegetales.</td></tr><tr><td>Cubierta adhesiva de plástico, Axygen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14222348</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-MPO</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>&nbsp; 07-496-I</td><td>Almacene a 2-8 &deg;C. estable durante 1 año. La especie huésped es el conejo.</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-NE, clon AHN-10</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>MABS461</td><td>Almacene a 2-8 &deg;C. estable durante 1 año. La especie huésped es el ratón.</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Ciencia Biomédica</td><td>BR-220700081</td><td>Albúmina de fracción bovina V. Tienda en 2&ndash; 8 &deg;C. estable durante 2 años.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>New England BioLabs</td><td>M0303M Tienda</td><td>a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>IgG, conejo, Control de isotipos</td><td>GENETEX, Inc.</td><td>GTX35035</td><td>Almacene como solución concentrada en 2&ndash; 8 &deg;C.</td></tr><tr><td>IgG1, control de isotipo de ratón, clon Ci4</td><td>Merck&nbsp;</td><td>MABC002</td><td>Almacene como solución concentrada en 2&ndash; 8 &deg;C.</td></tr><tr><td>Tubo de recolección de sangre de heparina de litio</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mezclador de microplacas</td><td>Como una corporación</td><td>NS-P</td><td></td></tr><tr><td>Lector de microplacas</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax 190&nbsp;</td><td>Cualquier lector de placas de microplacas capaz de leer longitudes de onda de 405 &ndash; 490 nm puede usar.</td></tr><tr><td>Aplicación de lector de microplacas</td><td>Molecular Devices</td><td>SoftMax pro</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-ADN conjugado con peroxidasa, Detección de muerte celular ELISA</td><td>Roche Diagnostics</td><td>1154467500</td><td>&nbsp; Botella 2. Tienda en 2&ndash; 8 &deg;C. estable durante 1 año.</td></tr><tr><td>Forbol 12-miristato 13-acetato</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>P8139</td><td>Activación de PMN's de sangre humana.</td></tr><tr><td>Solución tamponada de fosfato</td><td>Takara Bio</td><td>T9181</td><td>Conservar a temperatura ambiente. Estable durante 6 meses.</td></tr><tr><td>SigmaPlot v14.5</td><td>&nbsp; Systat Software Inc. San José, CA, EE. UU</td><td></td><td></td></tr><tr>.<td>Azida de sodio</td><td>Fujifilm Wako Chemicals</td><td>190-14901</td><td>Almacenar a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>t-octilfenoxipolietoxietanol, polietilenglicol terc-octilfenil éter</td><td>Fujifilm Wako Chemicals</td><td>9002-93-1</td><td>Almacenar a temperatura ambiente.</td></tr></tbody></table>

cuantificación de complejos mieloperoxidasa-adn y neutrófilos elastasa-adn a partir de trampas extracelulares de neutrófilos mediante el uso de un elisa sándwich modificado

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Ciertos estímulos, como los microorganismos, hacen que los neutrófilos liberen trampas extracelulares de neutrófilos (NET), que son básicamente estructuras en forma de red compuestas de ADN con proteínas granulosas, como la mieloperoxidasa (MPO) y la elastasa de neutrófilos (NE), y proteínas citoplasmáticas y citoesqueléticas. Aunque el interés en los TNE ha aumentado recientemente, no se dispone de un método de ensayo sensible y fiable para medir los TNE en entornos clínicos. En este artículo se describe un ensayo de inmunoabsorción enzimática en sándwich modificado para medir cuantitativamente dos componentes de los TNE circulantes, los complejos MPO-ADN y NE-ADN, que son componentes específicos de los TNE y se liberan en el espacio extracelular como productos de degradación de los TNE. El ensayo utiliza anticuerpos monoclonales específicos para MPO o NE como anticuerpos de captura y un anticuerpo de detección específico de ADN. MPO o NE se une a un sitio del anticuerpo de captura durante la incubación inicial de muestras que contienen complejos MPO-DNA o NE-ADN. Este ensayo muestra una buena linealidad y una alta precisión entre ensayos e intraensayos. Lo utilizamos en 16 pacientes con COVID-19 con síndrome de dificultad respiratoria aguda acompañante y encontramos que las concentraciones plasmáticas de MPO-DNA y NE-DNA eran significativamente más altas que en el plasma obtenido de controles sanos. Este ensayo de detección es un método fiable, altamente sensible y útil para investigar las características de los NET en plasma humano y sobrenadantes de cultivo.

Este método utilizó un ELISA sándwich con anticuerpos monoclonales anti-MPO, anti-NE y anti-ADN para medir el ADN asociado a MPO y al NE (Figura 1). En este método, los pocillos de una placa de microtitulación se recubrieron con un anticuerpo monoclonal específico de MPO o NE específico para capturar MPO asociada al ADN y NE asociada al ADN, así como MPO y NE no asociadas al ADN. Para calcular el coeficiente de variabilidad (CV) intraensayo, se realizaron mediciones duplicadas dentro de la m...

Presentamos un protocolo para una técnica modificada de ensayo de inmunoadsorción enzimática sándwich para medir cuantitativamente dos componentes de los remanentes de trampas extracelulares de neutrófilos, los complejos de ADN conjugado con mieloperoxidasa y ADN conjugado con elastasa de neutrófilos, derivados de neutrófilos activados.

Cuantificación de complejos mieloperoxidasa-ADN y neutrófilos elastasa-ADN a partir de trampas extracelulares de neutrófilos mediante el uso de un ELISA sándwich modificado

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Los TNE han atraído la atención recientemente, pero cuantificarlos in vivo ha demostrado ser un desafío. Este protocolo proporciona un método deseable, altamente sensible y valioso para investigar las características de los TNE en entornos clínicos. Esta técnica debe extenderse para evaluar la gravedad de la sepsis o SDRA séptico, síndrome de dificultad respiratoria aguda.Es ampliamente aceptado que la regulación de los vertederos o los patrones moleculares asociados al daño es clave para mejorar el estado clínico de la sepsis. La mayor ventaja de este método incluye la cuantificación precisa de los restos de NET circulantes como la mieloperoxidasa-ADN y la elastasa de neutrófilos-ADN en poco tiempo. Es aconsejable centrifugar las muestras antes del ensayo y evitar la descongelación repetida.Es importante seguir los tiempos de incubación indicados en el protocolo. Comience diluyendo neutrófilos polimorfonucleares recién aislados a 10.000 células por mililitro en RPMI 1640 libre de rojo de fenol. Tamizarlos en placas de cultivo de 35 milímetros.Para inducir trampas extracelulares de neutrófilos o NETs, primero hay que estimular los neutrófilos polimorfonucleares con PMA 25 nanomolar

quantifying-myeloperoxidase-dna-neutrophil-elastase-dna-complexes

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Las trampas de neutrófilos extracelular (TNE) es un importante mecanismo de inmunidad innata para luchar contra las bacterias patógenas, hongos y parásitos. A continuación se describen los métodos para aislar a los granulocitos neutrófilos de la sangre humana y para activarlos para formar NET. Se presentan las técnicas de preparación para visualizar NET en la microscopía óptica y electrónica.

Las trampas de neutrófilos extracelular: Cómo generar y visualizarlas

Este video demuestra la inducción y visualización de trampas extracelulares de neutrófilos o NETs en neutrófilos premarcados utilizando suero del paciente que contiene anticuerpos anti-citoplasma de neutrófilos. Además, el uso de un tinte de ADN impermeable y la microscopía de fluorescencia permite la visualización de los NET.

Inducción y visualización de trampas extracelulares de neutrófilos en neutrófilos premarcados

Se presentan ensayos de alto rendimiento que, en combinación, proporcionan excelentes herramientas para cuantificar la liberación neta de neutrófilos humanos.

Alto Rendimiento de medición de ADN extracelular de salida y la formación neta cuantitativa en neutrófilos humanos<em&gt; In Vitro</em

Los lípidos se sabe que juegan un papel importante en las funciones celulares. A continuación, describimos un método para determinar la composición lipídica de los neutrófilos, con énfasis en el nivel de colesterol, mediante el uso de ambos HPTLC y HPLC para obtener una mejor comprensión de los mecanismos subyacentes de la formación trampa extracelular de neutrófilos.

Métodos para el estudio de lípidos Las alteraciones en neutrófilos y la posterior formación de los neutrófilos extracelular Trampas

trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) son redes de ADN, histonas y proteínas de neutrófilos. Aunque un componente de la respuesta inmune innata, redes están implicados en la autoinmunidad y la trombosis. Este protocolo describe un método simple para el aislamiento de neutrófilos canino y cuantificación de los TNE utilizando un ensayo de fluorescencia de microplacas.

Un simple ensayo de fluorescencia para la cuantificación de los neutrófilos extracelular canina Trampa de lanzamiento

Se describen métodos para aislar caninas neutrófilos de la sangre entera y visualizar la formación neta en vivo neutrófilos mediante microscopía de fluorescencia. También se describe son protocolos para cuantificar la formación neta y citrulinado histona H3 (citH3) expresión usando microscopia de la inmunofluorescencia.

In Vitro Formación de la trampa extracelular neutrófilo canino: Análisis dinámico y cuantitativo por microscopía de fluorescencia

Aquí, presentamos un protocolo para generar trampas extracelulares de neutrófilos (NET) y operar NETQUANT, una opción de software totalmente automática para la cuantificación de NETs en imágenes de inmunofluorescencia.

Cuantificación automatizada basada en imágenes de trampas extracelulares de neutrófilos mediante NETQUANT

Este protocolo describe un ensayo de neutrófilos trampa extracelular (red) altamente sensible y de alto rendimiento para la cuantificación semiautomática de ex vivo red formación por microscopia confocal tridimensional de la inmunofluorescencia. Este protocolo puede utilizarse para evaluar la red formación y degradación después de diferentes estímulos y se puede utilizar para estudiar terapias potenciales orientada en la red.

Un análisis de alto rendimiento para evaluar y cuantificar la formación de neutrófilos trampa extracelular

Aquí se presenta un protocolo para la inducción y análisis de trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) in vitro . La cuantificación del ADN, la catelicidina (LL37) y la actividad enzimática arrojó datos que muestran la variabilidad en la composición y morfología de los NET inducidos por estímulos microbianos y químicos en condiciones controladas similares.

Análisis morfológico y composicional de trampas extracelulares de neutrófilos inducidas por estímulos microbianos y químicos

Presentamos un método automatizado de alto rendimiento para cuantificar las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) utilizando el sistema de análisis de células vivas, junto con un enfoque de doble colorante dependiente de la permeabilidad de la membrana.

Técnica de alto rendimiento en tiempo real para cuantificar la formación de trampas extracelulares de neutrófilos en neutrófilos humanos

Este protocolo definido describe un enfoque de microscopía de alto rendimiento en tiempo real para visualizar y cuantificar la liberación de trampas extracelulares (NET) de neutrófilos humanos in vitro. El método reproducible permite la investigación de las características y la cinética de la liberación de NET tras la estimulación con distintos inductores de NETosis y permite la evaluación de la farmacología de los antagonistas de NETosis.

Cuantificación microscópica en tiempo real y de alto rendimiento de la liberación de trampas extracelulares de neutrófilos humanos y evaluación de la farmacología de los antagonistas

Aprenda a cuantificar complejos MPO-ADN y NE-ADN de trampas extracelulares de neutrófilos mediante un ELISA sándwich modificado. Este método sensible permite evaluar la gravedad de la sepsis en entornos clínicos.

Cuantificación de complejos mieloperoxidasa-ADN y neutrófilos elastasa-ADN a partir de trampas extracelulares de neutrófilos mediante el uso de un ELISA sándwich modificado (Video) | JoVE Journal

Cuantificación de complejos mieloperoxidasa-ADN y neutrófilos elastasa-ADN a partir de trampas extracelulares de neutrófilos mediante el uso de un ELISA sándwich modificado

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