Name: El sistema Zebrafish Tol2: un enfoque de transgénesis modular y flexible basado en pasarelas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-30T14:50:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Aprende a usar el sistema Tol2 para generar peces cebra transgénicos mediante clonación gateway. Este método modular facilita estudios de desarrollo embrionario y trastornos del espectro alcohólico fetal.

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La investigación presentada en este artículo fue apoyada por una subvención de los Institutos Nacionales de Salud/Instituto Nacional sobre el Abuso de Alcohol (NIH/NIAAA) R00AA023560 a C.B.L.

Todos los embriones de pez cebra utilizados en este procedimiento fueron criados y criados siguiendo los protocolos IACUC establecidos12. Estos protocolos fueron aprobados por la Universidad de Louisville.
NOTA: En este estudio se utilizaron la cepa de pez cebra de tipo salvaje, AB, y la línea mutante doble bmp4st72;smad5b1100 . Toda el agua utilizada en este procedimiento era agua estéril de ósmosis inversa. Las imágenes confocales se tomaron bajo un microscopio confocal de escaneo láser. Las mediciones del endodermo se realizaron utilizando la herramienta de medición en ImageJ. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando software estadístico.
1. Hacer las soluciones y los medios
<ol><li>Medios bacterianos: Disuelva el caldo LB o el agar según las instrucciones del fabricante y el autoclave. Antes de verter el medio en placas de Petri de 100 mm, agregue ampicilina (50 μg/ml), kanamicina (50 μg/ml) o una combinación de ampicilina/cloranfenicol (50 μg/ml y 30 μg/ml, respectivamente).</li>
	<li>Para hacer 20 veces el stock de medios embrionarios, disuelva lo siguiente en 1 L de agua: 17,5 g de NaCl, 0,75 g de KCl, 2,9 g de CaCl 2, 0,41 g de K 2 HPO 4, 0,142 g de Na2 HPO 4 y 4,9 g de MgSO4·7H2 O. Esterilizar por filtro la solución madre utilizandoun sistema de filtración al vacío de 0,22 μm, y conservar a 4 °C. NOTA: Ignore el precipitado blanco que se forma; Esto no afectará a los medios de comunicación.</li>
	<li>En 19 L de agua, disolver 1,2 g de NaHCO3 y añadir 1 L del material de medios embrionarios 20x para generar la solución de medios embrionarios de trabajo, y mantener esta solución a 28 °C.</li>
	<li>Para una solución de rojo de fenol al 2%, disuelva 20 mg de sal de sodio rojo fenol en 1 ml de agua libre de RNasa y guárdela a temperatura ambiente.</li>
</ol>2. Moldes de inyección de embriones
<ol><li>Para hacer la placa de inyección de agarosa, disuelva la agarosa en el medio embrionario a una concentración final del 3% calentando hasta hervir.</li>
	<li>Vierta 50 ml de agarosa en placas de Petri de 100 mm, y mientras la agarosa aún esté líquida, coloque suavemente el molde de inyección en la agarosa para evitar la formación de burbujas debajo del molde.</li>
	<li>Deja que los platos de agarosa se enfríen. Una vez que la agarosa esté sólida, retire el molde de inyección y guárdelo a 4 °C hasta que esté listo para usar.</li>
</ol>3. Pipetas de inyección
<ol><li>Tire de los capilares de 1,0 mm (OD) que contienen un filamento en agujas utilizando un extractor de pipeta vertical con el solenoide ajustado a 2,5 y el elemento calefactor ajustado a 14,6. NOTA: Cualquier extractor calentado funcionará si tira de los capilares en dos agujas de manera limpia y uniforme, pero las agujas de inyección deben extraerse dentro de 1 semana de inyectar los embriones de pez cebra para obtener resultados de inyección consistentes.<ol><li>Coloque el capilar en el extractor, apriete la abrazadera en cada extremo y luego active el elemento calefactor.</li>
		<li>Tire de los capilares para crear dos agujas de inyección.</li>
		<li>Retire los capilares del extractor y guárdelos en una placa de Petri vacía con una tira de arcilla para modelar que actúa como soporte de agujas.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Preparación del ARNm de la transposasa
<ol><li>Linealizar el plásmido Tol2Kit que contiene transposasa con una endonucleasa de restricción NotI combinando lo siguiente en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml: 10 μL de plásmido transposasa (150 ng/μL), 1,5 μL de tampón de reacción de endonucleasa de restricción, 0,3 μL de endonucleasa NotI.</li>
	<li>Llene la reacción hasta 20 μL con agua libre de RNasa, y luego mezcle y digiera a 37 °C durante la noche.</li>
	<li>Detenga la digestión de la transposasa agregando 1 μL de 0.5 M EDTA (pH 8.0), 2 μL de 5 M NH4OAc y 80 μL de 100% EtOH a la reacción de digestión, y luego mezcle y enfríe a -20 °C durante la noche.</li>
	<li>Centrifugar la solución a 14.000x g durante 20 min a 4 °C, y luego aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet de ADN en agua libre de RNasa.</li>
	<li>Determine la concentración lineal de plásmidos en nanogramos por microlitro (ng/μL) usando un fluorómetro haciendo correr primero 2 μL de un espacio en blanco de agua libre de RNasa y luego corriendo 2 μL del plásmido linealizado. NOTA: Las concentraciones de plásmidos suelen oscilar entre 100-200 ng/μL</li>
	<li>Configure la producción de ARNm SP6 combinando los siguientes componentes en orden en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml: 10 μL de 2x NTP/CAP, 2 μL de tampón de reacción 10x, 0,1-1 μg de plantilla de ADN lineal y 2 μL de mezcla de enzimas SP6.</li>
	<li>Llenar la reacción hasta 20 μL con agua libre de RNasa, y luego mezclar e incubar a 37 °C durante 2 h.</li>
	<li>Después de incubar durante 2 h, añadir 1 μL de DNasa, mezclar bien e incubar durante 15 min adicionales a 37 °C.</li>
	<li>Para detener la reacción SP6, agregue 30 μL de solución de precipitación de LiCl al tubo de reacción, y luego mezcle y enfríe a -20 ° C durante la noche.</li>
	<li>Centrifugar la solución a 14.000 x g durante 20 min a 4 °C para granular el ARNm, y luego aspirar el sobrenadante y lavar el pellet de ARNm con 1 ml de EtOH al 80% (diluido con agua libre de RNasa).</li>
	<li>Centrifugar la solución a 14.000 x g durante 20 min a 4 °C para granular el ARNm, y luego aspirar el sobrenadante. Deje que el pellet se seque al aire.</li>
	<li>Resuspender el pellet de ARNm en 20 μL de agua libre de RNasa, determinar la concentración de ARNm en nanogramos por microlitro (ng/μL) utilizando un fluorómetro como se describe en el paso 4.5 (debe ser de al menos 100 ng/μL), alícuota 100 ng de ARNm por tubo para un solo uso, y almacenar a -80 °C. NOTA: Para asegurarse de que el ARNm no se degrada, se pueden ejecutar rápidamente 2 μL de ARNm en un gel de electroforesis de ADN para confirmar una sola banda a 1.950 pb.</li>
</ol>5. Clonación de Multisite Gateway para crear vectores de entrada para la transgénesis
NOTA: Este protocolo se modifica de Kwan et al.10, con la reacción LR escrita como una reacción half-LR y con un volumen total de 5 μL. Para generar nuevos elementos de entrada, las reacciones de PA que utilizan vectores donantes de 5', medio y 3' deben usarse10,13.
<ol><li>Para realizar la reacción, reúna 10 fmol cada uno de p5E, pMe y p3E y 20 fmol del vector de destino (pDest). NOTA: La recombinación LR multisitio utiliza cuatro vectores plásmidos diferentes: un vector de entrada 5' (p5E), un vector de entrada medio (pME), un vector de entrada 3' (p3E) y un vector de destino (pDest), para generar una construcción transgénica única flanqueada por repeticiones de Tol2 listas para ser inyectadas en embriones de pez cebra.<ol><li>Identifique el tamaño de los cuatro vectores en pares de bases de la fuente de plásmidos (Tabla 1, Tol2Kit Wiki página14 o Addgene11; ver la Tabla de materiales). NOTA: Para los vectores nuevos, la secuenciación completa del plásmido a través de compañías de secuenciación comercial puede proporcionar el tamaño exacto del plásmido en bps.</li>
		<li>Determinar la concentración de los cuatro vectores en nanogramos por microlitro (ng/μL) utilizando un fluorómetro, como se describe en el paso 4.5.</li>
		<li>Usando el peso del ADN como 660 g/mol y el tamaño del plásmido (en bps), calcule el total de nanogramos (ng) de plásmido necesarios para alcanzar 10 fmol (vectores de entrada) o 20 fmol (vector de destino). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64679/64679eq01.jpg" style="margin: auto;"> NOTA: El laboratorio Mosimann de la Universidad de Colorado, Anschutz Medical Campus, ha generado una hoja de cálculo disponible gratuitamente para calcular la cantidad de plásmido necesario (en ng) y el volumen (en μL) de los vectores necesarios en la reacción LR15.</li>
	</ol></li>
	<li>Para generar la construcción descrita a continuación, sox17: EGFPCAAX, utilice los siguientes vectores: un vector p5E que contiene el promotor sox17 del pez cebra, que es 6.918 pb en tamaño16; un vector pME que contiene el EGFP prenilado, que es de 3.345 pb en tamaño10; un vector p3E que contiene la secuencia de señal poli A tardía SV40, que es de 2.838 pb de tamaño10; y el pDest, que es de 5.883 pb en tamaño10.</li>
	<li>Utilizando la concentración de plásmidos determinada en el paso 5.1.2 y la cantidad en nanogramos (ng) para cada vector (paso 5.1.3), calcule el total de microlitros (μL) de cada plásmido necesario para alcanzar 10 fmol (vectores de entrada) o 20 fmol (vector de destino), y luego divida esto por dos para usarlo en las reacciones de 5 μL half-LR (todos los valores enumerados a continuación se enumeran en la Tabla 2). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/64679/64679eq02v2.jpg" style="margin: auto;"><ol><li>Para generar 10 fmol de p5E-sox17, use 45.66 ng (a una concentración de 140.3 ng / μL) y diluya con agua estéril por un factor de 4 para obtener 0.65 μL.</li>
		<li>Para generar 10 fmol de pME-EGFPCAAX, use 22.08 ng (a una concentración de 213.5 ng / μL) y diluya con agua estéril por un factor de 10 para obtener 0.52 μL.</li>
		<li>Para generar 10 fmol de p3E-poli A, use 15.73 ng (a una concentración de 276.1 ng / μL) y diluya con agua estéril por un factor de 20 para obtener 0.57 μL.</li>
		<li>Para 20 fmol del vector de destino, use 77.66 ng de pDest (a una concentración de 307.3 ng / μL) y diluya con agua estéril por un factor de 5 para obtener 1.63 μL.</li>
	</ol></li>
	<li>Para configurar una reacción semiLR de 5 μL, combine los volúmenes de p5E, pME, p3E y pDest determinados en el paso 5.3 en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml y luego agregue agua estéril para alcanzar un volumen de reacción total de 4 μL.</li>
	<li>Vortex vigorosamente la mezcla de enzimas LR 2x durante 1 min cada una para asegurar una mezcla adecuada, y luego agregue 1 μL a la reacción y mezcle bien.</li>
	<li>Incubar a 25 °C durante la noche (16+ h).</li>
	<li>Detenga la reacción LR añadiendo 0,5 μL de proteinasa K (2 μg/μL), incubar a 37 °C durante 10 min y luego enfriar a temperatura ambiente.</li>
	<li>Transformar 3-4 μL de plásmido en células descongeladas y químicamente competentes añadiendo el plásmido y dejando que las células reposen sobre hielo durante 25-30 min.</li>
	<li>Mientras las células se asientan sobre hielo, caliente dos placas de agar LB-ampicilina a temperatura ambiente.</li>
	<li>Golpee térmicamente las células en un baño de agua a 42 ° C durante exactamente 30 s.</li>
	<li>Después del choque térmico, añadir 250 μL de medios líquidos ricos y libres de antibióticos a las células, e incubar con agitación a 37 °C durante 1,5 h.</li>
	<li>Extienda 300 μL de bacterias en una placa de ampicilina e incube a 37 ° C durante la noche.</li>
	<li>A la mañana siguiente, examinar las colonias para detectar la presencia de dos fenotipos, claro y opaco, recoger las colonias claras (como se describe en Kwan et al.10) una a la vez, inocular el cultivo líquido y luego agitar a 37 °C durante la noche. NOTA: Las colonias claras casi siempre contienen la colonia LR correcta (&gt;85% del tiempo).</li>
	<li>Usando un kit comercial según las instrucciones del fabricante, realice una preparación de plásmido en cada cultivo líquido y digiera diagnósticamente cada plásmido para confirmar el tamaño apropiado de la construcción transgénica, lo que indica que la reacción de la puerta de enlace LR ha funcionado correctamente.</li>
	<li>Vuelva a transformar las construcciones transgénicas correctas utilizando el protocolo estándar de transformación bacteriana como se describe en los pasos 5.4-5.12 utilizando 0.5-1 μL del plásmido, y solo incubar a 37 °C durante 1 h.</li>
	<li>Vuelva a rayar las colonias y confirme que cada una tiene la construcción transgénica LR como en el paso 5.14.</li>
	<li>Determinar la concentración de plásmidos como se describe en el paso 4.5 (se necesitan al menos 150 ng/μL para la inyección del embrión).</li>
</ol>6. Inyección del transgén en los embriones
<ol><li>Descongele una muestra de ARNm transposasa de un solo uso y una construcción transgénica de Tol2 en hielo y advierta previamente una placa de inyección de agarosa a temperatura ambiente.</li>
	<li>Combine lo siguiente en hielo: 150 ng de plásmido, 100 ng de ARNm de transposasa y 2% de rojo de fenol (0,3 μL). Luego, agregue agua sin ARN para compensar el volumen a 3 μL.</li>
	<li>Transfiera embriones en estadio celular utilizando pipetas de transferencia a la placa de inyección (descrita en el paso 2) llena de EM que cubre completamente el agar, y luego presione suavemente aproximadamente 50-75 embriones por ranura de la placa de inyección.</li>
	<li>Agregue la mezcla de ARNm/plásmido/rojo fenol al extremo abierto de una aguja de inyección capilar, coloque la aguja capilar en la armadura del equipo de inyección y encienda el equipo de inyección. NOTA:La plataforma de inyección utiliza gas comprimido, como aire, para pulsar el volumen deseado (descrito en el paso 6.5) de la mezcla de ARNm/plásmido/rojo fenol en el embrión cuando se activa.</li>
	<li>Baje la aguja capilar en la EM de la placa de inyección y rompa la punta con pinzas para permitir que la plataforma de inyección bombee solo una pequeña cantidad de mRNA/plásmido/mezcla de rojo fenol.</li>
	<li>Inyecte los embriones con un pequeño bolo de 3 nL de la mezcla de ARNm/plásmido/rojo fenol en el cuerpo celular del embrión. NOTA: Un bolo de 3 nL es un volumen de mezcla de ARNm/plásmido/rojo fenol en el que siete bolos pueden teóricamente encajar por igual a través de la línea media del embrión.</li>
	<li>Cuando termine de inyectar los embriones, retírelos de la placa de inyección sacándolos suavemente de la ranura y transfiriéndolos pipeteándolos a una placa de Petri de 100 mm con EM fresca (aproximadamente 40 ml), y luego incubar a 28.5 ° C para permitir que los embriones se desarrollen.</li>
</ol>7. Cribado de embriones para inserción transgénica
<ol><li>Para la expresión de proteínas fluorescentes, elija la etapa de desarrollo apropiada cuando se debe expresar el transgén fluorescente y detecte la presencia de fluorescencia bajo un microscopio de disección fluorescente. NOTA: Estos embriones serán mosaicos en su expresión y mostrarán una inserción genómica del constructo transgénico.</li>
	<li>Detectar transgenes no fluorescentes mediante la detección de un marcador transgénico fluorescente (como se describe en el paso 7.1), como GFP impulsado por el promotor específico del corazón para el gen cmlc2 o mCherry impulsado por el promotor específico del cristalino de αcyrstallin, que están contenidos en distintos vectores de destino.</li>
	<li>Permitir que los embriones positivos para la inserción transgénica se desarrollen completamente a las etapas adultas de pez cebra.</li>
	<li>Una vez que los peces transgénicos potenciales alcancen la edad reproductiva, selecciónelos individualmente para detectar tanto la transmisión de la línea germinal como la expresividad transgénica criándolos en peces cebra de tipo salvaje.</li>
	<li>Aquellos adultos cuyos embriones se desarrollan normalmente y dan la expresión transgénica más fuerte y apropiada se mantienen como líneas únicas de pez cebra transgénico para futuros trabajos y análisis. NOTA: Como enfoque alternativo a la detección de la inserción genómica de construcciones transgénicas, diseñe cebadores de PCR que solo amplifiquen la construcción transgénica y no el ADN de tipo salvaje.</li>
</ol>

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<li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li>
<li>Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tol2-mediated+transgenesis%2C+gene+trapping%2C+enhancer+trapping%2C+and+Gal4-UAS+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system.</a> Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El pez cebra es ideal para estudiar el impacto de la exposición al etanol en el desarrollo y los estados de enfermedad 7,8. El pez cebra produce un gran número de embriones translúcidos, fertilizados externamente y genéticamente tratables, lo que permite la obtención de imágenes en vivo de varios tejidos y tipos de células marcados con transgenes simultáneamente en múltiples contextos ambientales19,20. Es...

La exposición prenatal al etanol da lugar a un continuo de déficits estructurales y deficiencias cognitivas denominadas trastornos del espectro alcohólico fetal (TEAF)1,2,3,4. Las complejas relaciones entre múltiples factores hacen que estudiar y comprender la etiología del TEAF en humanos sea un desafío. Para resolver este desafío, se ha utilizado una amplia variedad de modelos animales. Las herramientas biológicas y experimentales disponibles en estos modelos han demostrado ser cruciales para desarrollar nuestra comprensión de las bases mecanicistas de la teratogenicidad del etanol, y los resultados de estos sistemas modelo han sido notablemente consistentes con lo que se encuentra en los estudios de etanol humano 5,6. Entre estos, el pez cebra se ha convertido en un poderoso modelo para estudiar la teratogénesis del etanol7,8, en parte debido a su fertilización externa, alta fecundidad, trazabilidad genética y embriones translúcidos. Estas fortalezas se combinan para hacer que el pez cebra sea ideal para estudios de imágenes en vivo en tiempo real de TEAF utilizando líneas transgénicas de pez cebra.
El pez cebra transgénico se ha utilizado ampliamente para estudiar múltiples aspectos del desarrollo embrionario9. Sin embargo, la creación de construcciones transgénicas y líneas transgénicas posteriores puede ser extremadamente difícil. Un transgén estándar requiere un elemento promotor activo para impulsar el transgén y una señal poli A o "cola", todo en un vector bacteriano estable para el mantenimiento general del vector. La generación tradicional de una construcción transgénica multicomponente requiere múltiples pasos de subclonación que consumen mucho tiempo10. Los enfoques basados en PCR, como el ensamblaje de Gibson, pueden eludir algunos de los problemas asociados con la subclonación. Sin embargo, los cebadores únicos deben ser diseñados y probados para la generación de cada construcción transgénica única10. Más allá de la construcción de transgenes, la integración genómica, la transmisión de la línea germinal y la detección de la integración adecuada de transgenes también han sido difíciles. Aquí, describimos un protocolo para usar el sistema de transgénesis Tol2 basado en transposones (Tol2Kit)10,11. Este sistema modular utiliza la clonación de pasarela multisitio para generar rápidamente múltiples construcciones transgénicas a partir de una biblioteca en constante expansión de vectores de "entrada" y "destino". Los elementos transponibles Tol2 integrados aumentan en gran medida la tasa de transgénesis, lo que permite la rápida construcción e integración genómica de múltiples transgenes. Usando este sistema, mostramos cómo la generación de una línea de pez cebra transgénico endodermo se puede utilizar para estudiar los defectos estructurales específicos del tejido subyacentes al TEAF. En última instancia, en este protocolo, mostramos que la configuración modular y la construcción de construcciones transgénicas ayudarán enormemente a la investigación del TEAF basada en el pez cebra.

<table><tbody><tr><td>Caja de herramientas Addgene Tol2</td><td>https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Air</td><td></td><td></td><td>Proporcionado directamente por la universidad</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760</td><td></td></tr><tr><td>Balanza analítica</td><td>VWR</td><td>10204-962</td><td></td></tr><tr><td>Borosil 1,0 mm OD x 0,75 mm ID Capilar</td><td>FHC</td><td>30-30-0</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>VWR</td><td>97062-590</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>BioVision</td><td>2486</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118-500</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección fluorescente</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal de barrido láser</td><td>Olympus</td><td>Fluoview FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Lawson Lab Preparación de plásmidos de donante</td><td>https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>LB Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9724</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>Caldo Fisher Scientific</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa de grado de baja EEO/multipropósito/biología molecular Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>LR Clonasa II Plus Enzima</td><td>Fisher Scientific</td><td>12538200</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio (heptahidrato)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Micro Pipeta</td><td>Instrumentación Científica Aplicada</td><td>MIMPH-M-PIP</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga 0,5 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10025-724</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10025-716</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Instrumentación Científica Aplicada</td><td>MM33</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de micropipeta 10 &mu; L&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611106</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de micropipeta 1000 &mu; L&nbsp;</td><td>Fisher Scientific 13611127</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puntas de micropipeta 200 &mu; L&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611112</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit de transcripción</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Mosimann Lab Tol2 Hoja de cálculo</td><td>https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro NanoDrop NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NcoI</td><td>NEB</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>NEB</td><td>R0189S Placas de</td><td></td></tr><tr><td>Petri 100 mm&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>Fenol Sal sódica roja</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4758-5G</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p1000L Micropipeta</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p200L Micropipeta</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p2L Micropipeta</td><td>Gilson</td><td>FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio (Dibasic)</td><td>VWR</td><td>BDH9266-500G</td><td></td></tr><tr><td>Inyector de presión Instrumentación</td><td>científica aplicada</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>VWR</td><td>BDH9280-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio (dibásico)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>Stericup .22 &micro; m sistema de filtración al vacío&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SCGPU11RE</td><td></td></tr><tr><td>Tol2 Página Wiki</td><td>http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Top10 Químicamente Competentes E. coli</td><td>Fisher Scientific</td><td>C404010</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de pipetas verticales</td><td>David Kopf Instruments</td><td>720</td><td></td></tr><tr><td>Molde de microinyección de pez cebra</td><td>Herramientas de ciencia adaptativa</td><td>i34</td><td></td></tr></tbody></table>

el sistema zebrafish tol2: un enfoque de transgénesis modular y flexible basado en pasarelas

The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach

Los trastornos del espectro alcohólico fetal (TEAF) se caracterizan por un conjunto altamente variable de defectos estructurales y deficiencias cognitivas que surgen debido a la exposición prenatal al etanol. Debido a la compleja patología del TEAF, los modelos animales han demostrado ser críticos para nuestra comprensión actual de los defectos de desarrollo inducidos por el etanol. El pez cebra ha demostrado ser un modelo poderoso para examinar los defectos de desarrollo inducidos por el etanol debido al alto grado de conservación tanto de la genética como del desarrollo entre el pez cebra y los humanos. Como sistema modelo, el pez cebra posee muchos atributos que los hacen ideales para estudios de desarrollo, incluyendo un gran número de embriones fertilizados externamente que son genéticamente tratables y translúcidos. Esto permite a los investigadores controlar con precisión el momento y la dosis de exposición al etanol en múltiples contextos genéticos. Una herramienta genética importante disponible en el pez cebra es la transgénesis. Sin embargo, generar construcciones transgénicas y establecer líneas transgénicas puede ser complejo y difícil. Para abordar este problema, los investigadores del pez cebra han establecido el sistema de transgénesis Tol2 basado en transposones. Este sistema modular utiliza un enfoque de clonación de puerta de enlace multisitio para el ensamblaje rápido de construcciones transgénicas completas basadas en transposones Tol2. Aquí, describimos la caja de herramientas flexible del sistema Tol2 y un protocolo para generar construcciones transgénicas listas para la transgénesis del pez cebra y su uso en estudios de etanol.

Para generar las construcciones transgénicas, utilizamos el sistema de transgénesis Tol2. Se utilizaron tres vectores de entrada, incluido p5E, que contiene los elementos promotores / potenciadores de genes, pME, que sostiene que el gen se expresa por los elementos promotores / potenciadores, y p3E que, como mínimo, contiene la cola de poliA, para generar la construcción transgénica a través de la clonación LR de puerta de enlace multisitio. El vector de destino, pDest, proporciona las repeticiones Tol2 para la ...

Este trabajo describe un protocolo para el sistema modular de transgénesis Tol2, un método de clonación basado en pasarela para crear e inyectar construcciones transgénicas en embriones de pez cebra.

El sistema Zebrafish Tol2: un enfoque de transgénesis modular y flexible basado en pasarelas

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to ...

El pez cebra transgénico ha demostrado ser fundamental para nuestra comprensión del desarrollo embrionario. El sistema Tol2 es una herramienta versátil que permite a los investigadores generar rápida y sistemáticamente múltiples peces cebra transgénicos para estudios de TEAF. El diseño modular y la facilidad de generación de nuevos componentes del kit hacen del sistema Tol2 una herramienta versátil para generar nuevos transgénicos sin tener que rediseñar ningún componente del kit.Mi consejo para los investigadores que realizan esta técnica por primera vez es hacer varias pruebas para entrenar la precisión de generar e inyectar construcciones transgénicas. Para comenzar, linealice el plásmido kit Tol2 que contiene transposasa con una endonucleasa de restricción cero combinando 10 microlitros de plásmido transposasa, 1.5 microlitros de tampón de reacción de endonucleasa de restricción y 0.3 microlitros de ninguna endonucleasa en un tubo de microcentrífuga de 500 microlitros. Llene la reacción hasta 20 microlitros con agua libre de ARNasa.Mezclar y digerir a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, detenga la digestión agregando un microlitro de 0.5 molar EDTA, dos microlitros de acetato de amonio molar y 80 microlitros de etanol al 100% a la mezcla de reacción. Mezcle y enfríe a menos 20 grados centígrados durante la noche.Al día siguiente, centrifugar y aspirar el sobrenadante antes de resuspender el pellet de ADN en agua libre de ARNasa. Luego determine la concentración lineal de plásmidos en nanogramos por microlitro en un fluorómetro ejecutando dos microlitros de la muestra. Configure la producción de ARNm SP6 combinando 10 microlitros de 2X NTP/CAP, dos microlitros de tampón de reacción 10X, 0.1 a un microgramo de plantilla de ADN lineal en dos microlitros de mezcla de enzimas SP6 en un tubo de 500 microlitros.Llene la reacción hasta 20 microlitros con agua libre de ARNasa y mezcle antes de incubar a 37 grados centígrados. Después de dos horas, agregue un microlitro de DNAse, mezcle bien e incube durante 15 minutos adicionales. Detenga la reacción agregando 30 microlitros de solución de precipitación de cloruro de litio.Mezcle y enfríe a menos 20 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, centrifugar la solución para granular el ARNm y aspirar el sobrenadante antes de lavar el pellet con un mililitro de etanol al 80%. Seque al aire el pellet y vuelva a suspenderlo en 20 microlitros de agua libre de ARNasa.Determine la concentración de ARNm usando un fluorómetro, luego alícuota 100 nanogramos de ARNm por tubo para un solo uso y guárdelo a menos 80 grados centígrados. Para realizar la reacción, reúna 10 femtomole de P5E, PME y P3E y 20 femtomole del vector de destino PDEST. Identifique el tamaño de los cuatro vectores y pares de bases de la fuente de plásmidos.Después de determinar la concentración de los cuatro vectores, utilizando el peso del ADN como 660 gramos por mol y el tamaño del plásmido y los pares de bases, calcule el total de nanogramos de plásmido necesarios para alcanzar 10 femtomole para los vectores de entrada o 20 femtomole para el vector de destino. A continuación, genere la construcción sox17:EGFP-CAAX utilizando los componentes descritos en el manuscrito. Usando la concentración de plásmidos, calcule los microlitros totales de cada plásmido necesarios para alcanzar 10 femtomole o 20 femtomole, y luego divida esto por dos para el uso en las reacciones de cinco microlitros a mitad LR.Generar 10 femtomole de P5E sox17, PME EGFP-CAAX, P3E Poly(A) y 20 femtomole de vector de destino. Configure cinco microlitros de reacción mitad LR combinando los volúmenes de P5E, PME, P3E y PDEST en un tubo de 500 microlitros. Luego agregue agua estéril para hacer el volumen de cuatro microlitros.Mezcle la enzima LR dos veces durante un minuto cada una antes de agregar un microlitro a la reacción y mezcle bien antes de incubar a 25 grados centígrados. Al día siguiente, detenga la reacción LR agregando 0.5 microlitros de proteinasa K.Incubar a 37 grados centígrados durante 10 minutos y luego enfriar a temperatura ambiente. A continuación, transforme de tres a cuatro microlitros del plásmido en células químicamente competentes descongeladas agregando el plásmido y dejando que las células reposen en hielo durante 25 a 30 minutos.Luego choque térmico las células en un baño de agua de 42 grados centígrados durante 30 segundos. Después del choque térmico, agregue 250 microlitros de medios líquidos ricos sin antibióticos a las células e incube agitando a 37 grados centígrados durante 1,5 horas. Extienda 300 microlitros de suspensión bacteriana en una placa de ampicilina Luria-Bertani e incube durante la noche.Al día siguiente, examinar las colonias para detectar la presencia de dos fenotipos: claro y opaco. Elija las colonias claras una a la vez, inocule el cultivo líquido y agite a 37 grados centígrados durante la noche. Combine 150 nanogramos de plásmido, 100 nanogramos de ARNm transposasa y 2% de rojo fenol en hielo.Luego agregue agua libre de ARN para hacer el volumen de tres microlitros. Transfiera un embrión en estadio celular utilizando pipetas de transferencia a la placa de inyección llena de EM que cubre completamente el agar y luego presione suavemente aproximadamente de 50 a 75 embriones por ranura de la placa de inyección. Agregue la mezcla de rojo fenol plásmido de ARNm al extremo abierto de una aguja de inyección capilar.Coloque la aguja capilar en la armadura del equipo de inyección y encienda el equipo de inyección. Baje la aguja en la placa de inyección y rompa la punta con pinzas para permitir que la plataforma de inyección bombee solo una pequeña cantidad de mezcla. Inyecte los embriones con un bolo de tres nanolitros de la mezcla de rojo fenol plásmido de ARNm en el cuerpo celular del embrión.Cuando termine, retire los embriones de la placa de inyección sacándolos suavemente de la ranura y transfiera el pipeteo a una placa de Petri de 100 milímetros con EM fresca. Incubar a 28,5 grados centígrados. Elija la etapa de desarrollo apropiada para la expresión de transgenes fluorescentes y realice pruebas bajo un microscopio de disección fluorescente. Detectar transgenes no fluorescentes mediante la detección de marcadores transgénicos fluorescentes como GFP impulsados por el promotor cardíaco específico para el gen Cmlc2.Cuando los embriones positivos para la inserción transgénica se conviertan en adultos y alcancen la edad reproductiva, selecciónelos individualmente para detectar la transmisión de la línea germinal y la expresividad transgénica criándolos en pez cebra de tipo salvaje. Se muestran ejemplos de colonias bacterianas obtenidas de la transformación de la recombinación LR. Las colonias claras contenían un producto de recombinación LR correcto más del 85% del tiempo, mientras que las colonias opacas nunca contenían un producto de recombinación correcto.La digestión diagnóstica de las tres colonias a partir de la transformación de los productos de recombinación LR mostró que la única colonia opaca no contenía ningún plásmido, mientras que las dos colonias claras contenían una sola banda en 9, 544 pares de bases. El ARNm de transposasa en 1, 950 pares de bases se muestra aquí. Se observó expresión de EGFP-CAAX del endodermo en mosaico en el 75% de los embriones inyectados.La expresión del marcador transgénico de Cmlc2 EGFP en el corazón en desarrollo se observó 24 horas después de la fertilización. El pez cebra adulto tenía transmisión germinal de sox17:EGFP-CAAX generó embriones fluorescentes con el endodermo completamente marcado con EGFP-CAAX. Tanto la longitud anterior-posterior del endodermo como la longitud dorsal-ventral de cada bolsa de las bolsas uno a cinco se midieron en embriones mutantes BMP de tipo salvaje controlados y tratados con etanol.La longitud total del endodermo no se vio afectada por el genotipo o el tratamiento. Sin embargo, las bolsas uno y tres mostraron aumentos significativos en la longitud de la bolsa entre embriones de tipo salvaje no tratados y tratados con etanol, pero disminuciones significativas en la longitud entre los mutantes BMP no tratados y tratados con etanol. La bolsa dos mostró aumentos significativos en el tamaño de la bolsa entre los grupos de tipo salvaje no tratado y tratado con etanol y BMP, respectivamente.Al intentar este procedimiento, es fundamental ser preciso en el pipeteo y la dilución del sistema Tol2, así como golpear el cuerpo celular durante la inyección del embrión.

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Investigación

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Developmental Biology

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