Name: Ensayo de verde de malaquita para el descubrimiento de inhibidores de la proteína 90 de choque térmico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Aprende el ensayo de verde de malaquita para detectar fosfato inorgánico y descubrir inhibidores de Hsp90. Este método sencillo y económico facilita el cribado de alta producción en investigación oncológica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este estudio fue apoyado por el programa Korea Research Fellowship (KRF), becario postdoctoral de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Ciencia y TIC (NRF-2019H1D3A1A01102952). Los autores agradecen la subvención intramuros de KIST y la subvención número 2MRB130 del Ministerio de Océanos y Pesca por proporcionar asistencia financiera para este proyecto.

1. Ensayo de verde de malaquita a escala de laboratorio
<ol><li>Preparación del tampón de ensayo<ol><li>Prepare el tampón del ensayo, según la composición y preparación presentadas en la Tabla 1.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de patrones de fosfato<ol><li>Utilice el estándar de fosfato de 1 mM, proporcionado en el kit de ensayo de fosfato de ensayo verde de malaquita (almacenado a 4 °C).</li>
		<li>Pipetear 40 μL de 1 mM de fosfato patrón en 960 μL de agua ultrapura para obtener 40 μM de solución de fosfato (solución de premezcla). Agregue la solución de premezcla con agua ultrapura, según las instrucciones del fabricante, para formar una dilución en serie de fosfato de 0 a 40 μM.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de levadura Hsp90<ol><li>Use levadura Hsp90 con una concentración de glicerol de 0.66 mg / ml. Descongelar sobre hielo justo antes de usar.</li>
		<li>Use 8 μL (5.98 μg, 0.80 μM) de levadura Hsp90 para la actividad medible de la ATPasa. Compruebe que la diferencia de densidad óptica después de la adición del reactivo verde de malaquita entre el blanco y el control positivo es de al menos 0,5 y menos de 1,0. Aquí, la diferencia de absorbancia entre el blanco (sin Hsp90) y el control positivo (con Hsp90) se encontró que era 0.510.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de ATP<ol><li>Transfiera 1 mg de ATP a un vial que contenga 453,39 μL de agua ultrapura para obtener 4 mM de solución madre. Realizar cálculos de peso basados en ATP anhidro (peso molecular [m.w.] = 551.14). Prepare ATP fresco, ya que puede hidrolizarse espontáneamente con el tiempo.</li>
		<li>Añadir 4 μL de solución madre de ATP a cada pocillo para obtener una concentración final del pozo de 0,2 mM (volumen total final del pozo de ensayo de 80 μL). Añadir ATP como último componente a la reacción, utilizando una pipeta multicanal para que todas las reacciones comiencen simultáneamente.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de geldanamicina (GA)<ol><li>Preparar una reserva de 10 mM de AG disolviendo 1 mg en 178,37 μL de DMSO (m.w. = 560,64). Usando la solución madre, prepare 4 mM, 0.8 mM, 0.16 mM, 0.032 mM, 0.0064 mM y 0.00128 mM en solución DMSO por dilución en serie.</li>
		<li>Agregue 2 μL de estas soluciones madre a cada pozo para obtener una concentración final del pozo de 0.1 mM, 0.02 mM, 0.004 mM, 0.0008 mM, 0.00016 mM y 0.000032 mM, respectivamente.</li>
		<li>Prepare los pozos como se describe en la Tabla 2 y la Tabla 3, con los pozos que contienen el espacio en blanco (tampón + agua + DMSO) y el control negativo (Hsp90 en tampón + agua + DMSO). Los pozos que contienen GA (Hsp90 en tampón + agua + GA) sirven como control positivo.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de placas de pozo y orden de adición<ol><li>Prepare placas de 96 pocillos con el diseño presentado en la Tabla 2. Para los compuestos que muestran absorbancia a 620 nm, prepare un pocillo separado para registrar la absorbancia en esta longitud de onda. No prepare un pocillo separado para GA, ya que GA no muestra absorbancia a 620 nm para la concentración utilizada en el ensayo.</li>
		<li>Prepare cada componente con el volumen total de cada constituyente, como se presenta en la Tabla 3.</li>
		<li>Establezca pozos de ensayo agregando agua ultrapura a cada pozo. Después de esto, agregue la cantidad requerida de tampón de ensayo y una solución compuesta (por ejemplo, solución GA).</li>
		<li>Luego, agregue Hsp90 a los pocillos apropiados y agite las placas durante 2 minutos en un agitador de placas a temperatura ambiente.</li>
		<li>Añadir 4 μL de solución de ATP con una pipeta multicanal. Envuelva la placa en papel de aluminio y agite durante 2 minutos en un agitador de placas (200 rpm) a temperatura ambiente. Incubar la placa a 37 °C durante 3 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación y adición de reactivo verde de malaquita<ol><li>El reactivo verde de malaquita consiste en los reactivos A (molibdato de amonio en HCl 3M) y B (verde de malaquita y alcohol polivinílico). Lleve el reactivo a temperatura ambiente antes de usarlo. Mezclar los reactivos A y B en una proporción de 100:1 (1.000 μL:10 μL). Prepare esto dentro de las 3 h antes de su uso, ya que es inestable y comienza a descomponerse después de 3 h.</li>
		<li>Después de 3 h del paso 1.6.5, detener la reacción añadiendo 20 μL de reactivo verde de malaquita, añadido en el mismo orden que el ATP, utilizando una pipeta multicanal.</li>
		<li>Después de una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente, mida la absorbancia de la placa a 620 nm en un lector de placas.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Cribado de alto rendimiento de inhibidores de Hsp90 mediante ensayo de verde de malaquita
NOTA: El protocolo para la detección de alto rendimiento es similar a la metodología a escala de laboratorio. El volumen final del pozo en cada caso es de 80 μL. Sin embargo, hay una ligera diferencia en el orden de la adición de reactivos. En el método basado en escala de laboratorio, hay cinco etapas de adición de solución (34 μL de agua, 32 μL de tampón, 2 μL de compuesto en DMSO, 8 μL de Hsp90 y finalmente 4 μL de solución de ATP). En contraste, con HTS hay tres etapas de adición (40 μL de solución tampón que contiene levadura Hsp90, 2 μL de DMSO en 18 μL de agua que contienen los compuestos, y finalmente 20 μL de ATP disuelto en agua). La cantidad mínima de solución que se puede pipetear con precisión en la configuración HTS es de 20 μL. Por lo tanto, se observa una diferencia en el pipeteo entre las escalas de laboratorio y HTS.
<ol><li>Preparación del tampón de ensayo (pH 7.4)<ol><li>Utilice el mismo tampón en HTS que para el ensayo de verde de malaquita a escala de laboratorio (Tabla 1).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de levadura Hsp90<ol><li>Use proteínas con una concentración de glicerol de 0.66 mg / ml. Descongelar sobre hielo justo antes de usar.</li>
		<li>Use 8 μL (5.98 μg, 0.80 μM) de levadura Hsp90 en cada pocillo, lo que proporciona una actividad ATPasa medible.</li>
		<li>Diluir la proteína (8 μL) en tampón (32 μL) para cada pocillo. El volumen total de trabajo final para cada pocillo es de 40 μL en un volumen total de ensayo de 80 μL.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de 0.8 mM ATP<ol><li>Disolver 1 mg de ATP en 2.267 μL de agua destilada para obtener una solución de 0,8 mM. El volumen total de trabajo para cada pocillo es de 20 μL en un volumen total de ensayo de 80 μL.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de geldanamicina (GA)/compuestos problema<ol><li>Prepare un stock de 0,8 mM de GA en DMSO, como en el paso 1.5. Diluir 10 μL de la cepa de GA con 90 μL de agua para obtener una concentración final de 80 μM.</li>
		<li>Utilizar 20 μL de la solución de GA de 80 μM en pocillos de ensayo apropiados (volumen total final del pozo de ensayo = 80 μL), dando una concentración final del pocillo de 20 μM. Esto sirve como un control positivo.</li>
		<li>Para los compuestos de ensayo, preparar soluciones en DMSO según su concentración deseada para la evaluación.</li>
		<li>Preparar 10 μL de DMSO en 90 μL de agua para agregar a pozos en blanco (tampón + agua + DMSO) y control negativo (Hsp90 en tampón + agua + DMSO). Preparar los compuestos de ensayo de manera similar a una concentración final de pocillo de 100 μM.</li>
	</ol></li>
	<li>Diseño de placas de ensayo y orden de adición<ol><li>Utilice cuatro placas principales, una placa compuesta y cuatro placas de adición que contengan existencias de reactivos para configurar el ensayo (Figura 2 y Tabla 4).</li>
		<li>Además, la placa A, agregue 90 μL de tampón de ensayo en cada pocillo; además de la placa B, añadir 90 μL de tampón con Hsp90 en cada pocillo; además de las placas C y D, añadir 90 μL de ATP y 90 μL de reactivo verde malaquita, respectivamente, en cada pocillo (Tabla 5 y Tabla 6).</li>
		<li>Desde la placa de adición A y la placa B, transferir 40 μL de solución de cada pocillo a la placa principal 1 y 2, y 3 y 4, respectivamente, utilizando un sistema de dosificación multicanal automatizado. Aquí se utilizó la estación de trabajo de automatización de laboratorio Biomek(R) FXP (Figura 2 y Tabla 6).</li>
		<li>Desde cada pocillo de la placa compuesta, transfiera 20 μL de la solución a las placas principales 1, 2, 3 y 4 (Figura 2). Agite los platos durante 1 minuto en una coctelera (200 rpm).</li>
		<li>Desde cada pocillo de la placa de adición C (ATP), transfiera 20 μL de solución a las placas principales 1, 2, 3 y 4 (Figura 2). Agite los platos durante 1 minuto en una coctelera (200 rpm).</li>
		<li>Incubar las placas durante 3 h a 37 °C.</li>
		<li>Preparar el reactivo verde de malaquita según el paso 1.7. Después de 3 h, transferir 20 μL de reactivo verde de malaquita de la placa de adición D a los pocillos de las placas principales 1, 2, 3 y 4 (Figura 2).</li>
		<li>Después de una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente, medir la absorbancia de la placa es de 620 nm en un lector de placas.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Workman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+attack+on+multistep+oncogenesis+by+inhibiting+the+Hsp90+molecular+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Combinatorial attack on multistep oncogenesis by inhibiting the Hsp90 molecular chaperone.</a> Cancer Letters. 206 (2), 149-157 (2004).</li>
<li>Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP90+at+the+hub+of+protein+homeostasis%3A+emerging+mechanistic+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (7), 515-528 (2010).</li>
<li>Mahalingam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+HSP90+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting HSP90 for cancer therapy.</a> British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).</li>
<li>Dutta Gupta, S., Pan, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+update+on+discovery+and+development+of+Hsp90+inhibitors+as+senolytic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Recent update on discovery and development of Hsp90 inhibitors as senolytic agents.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 161, 1086-1098 (2020).</li>
<li>Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+HSP90+inhibitors+as+a+novel+class+of+senolytics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics.</a> Nature Communications. 8 (1), 422(2017).</li>
<li>Fuhrmann-Stroissnigg, H., Niedernhofer, L. J., Robbins, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp90+inhibitors+as+senolytic+drugs+to+extend+healthy+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Hsp90 inhibitors as senolytic drugs to extend healthy aging.</a> Cell Cycle. 17 (9), 1048-1055 (2018).</li>
<li>Pearl, L. H., Prodromou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+the+Hsp90+molecular+chaperone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone machinery.</a> Annual Review of Biochemistry. 75, 271-294 (2006).</li>
<li>Park, H. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unleashing+the+full+potential+of+Hsp90+inhibitors+as+cancer+therapeutics+through+simultaneous+inactivation+of+Hsp90%2C+Grp94%2C+and+TRAP1%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Unleashing the full potential of Hsp90 inhibitors as cancer therapeutics through simultaneous inactivation of Hsp90, Grp94, and TRAP1.</a> Experimental & molecular medicine. 52 (1), 79-91 (2020).</li>
<li>Hoy, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pimitespib%3A+first+approval%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Pimitespib: first approval.</a> Drugs. 82 (13), 1413-1418 (2022).</li>
<li>Whitesell, L., Mimnaugh, E. G., De Costa, B., Myers, C. E., Neckers, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+heat+shock+protein+HSP90-pp60v-src+heteroprotein+complex+formation+by+benzoquinone+ansamycins%3A+essential+role+for+stress+proteins+in+oncogenic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Inhibition of heat shock protein HSP90-pp60v-src heteroprotein complex formation by benzoquinone ansamycins: essential role for stress proteins in oncogenic transformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (18), 8324-8328 (1994).</li>
<li>Rowlands, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).</li>
<li>Sheikha, G. A., Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+sulfonamide+drugs+inhibit+ATPase+activity+of+heat+shock+protein+90%3A+investigation+by+docking+simulation+and+experimental+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Enzyme+Inhibition+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Some sulfonamide drugs inhibit ATPase activity of heat shock protein 90: investigation by docking simulation and experimental validation.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 26 (5), 603-609 (2011).</li>
<li>Al-Sha'er, M. A., Mansi, I., Hakooz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Docking+and+pharmacophore+mapping+of+halogenated+pyridinium+derivatives+on+heat+shock+protein+90%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+and+Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Docking and pharmacophore mapping of halogenated pyridinium derivatives on heat shock protein 90.</a> Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 7 (4), 103-112 (2015).</li>
<li>Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elaborate+ligand-based+modeling+reveals+new+nanomolar+heat+shock+protein+90%CE%B1+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Information+and+Modeling%22%5BJournal%5D)">Elaborate ligand-based modeling reveals new nanomolar heat shock protein 90α inhibitors.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 50 (9), 1706-1723 (2010).</li>
<li>Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+exploration+of+new+pyridinium-based+HSP90%CE%B1+inhibitors+tailored+to+thiamine+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Medicinal+Chemistry+Research%22%5BJournal%5D)">Rational exploration of new pyridinium-based HSP90α inhibitors tailored to thiamine structure.</a> Medicinal Chemistry Research. 21 (4), 487-510 (2012).</li>
<li>Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+docking-based+comparative+intermolecular+contacts+analysis+to+validate+Hsp90%CE%B1+docking+studies+and+subsequent+in+silico+screening+for+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Modeling%22%5BJournal%5D)">Application of docking-based comparative intermolecular contacts analysis to validate Hsp90α docking studies and subsequent in silico screening for inhibitors.</a> Journal of Molecular Modeling. 18 (11), 4843-4863 (2012).</li>
<li>Dutta Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%2C4-dihydroxy+benzaldehyde+derived+Schiff+bases+as+small+molecule+Hsp90+inhibitors%3A+rational+identification+of+a+new+anticancer+lead%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">2,4-dihydroxy benzaldehyde derived Schiff bases as small molecule Hsp90 inhibitors: rational identification of a new anticancer lead.</a> Bioorganic Chemistry. 59, 97-105 (2015).</li>
<li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+malachite+green+assay+of+phosphate%3A+mechanism+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An improved malachite green assay of phosphate: mechanism and application.</a> Analytical Biochemistry. 409 (1), 144-149 (2011).</li>
<li>Gupta, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+docking+study%2C+synthesis+and+biological+evaluation+of+Mannich+bases+as+Hsp90+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Molecular docking study, synthesis and biological evaluation of Mannich bases as Hsp90 inhibitors.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 80, 253-259 (2015).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+identifies+established+drugs+as+SARS-CoV-2+PLpro+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening identifies established drugs as SARS-CoV-2 PLpro inhibitors.</a> Protein & Cell. 12 (11), 877-888 (2021).</li>
<li>Giri, A. K., Ianevski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+for+drug+discovery+targeting+the+cancer+cell-microenvironment+interactions+in+hematological+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening for drug discovery targeting the cancer cell-microenvironment interactions in hematological cancers.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 17 (2), 181-190 (2022).</li>
<li>Mahapatra, D. K., et al. Heat shock protein 90 (Hsp90) inhibitory potentials of some chalcone compounds as novel anti-proliferative candidates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMahapatra%2C+DK+%22Advanced+Studies+in+Experimental+and+Clinical%22">Advanced Studies in Experimental and Clinical</a>. , Apple Academic Press. 107-122 (2021).</li>
<li>Jaeger, A. M., Whitesell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP90%3A+enabler+of+cancer+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">HSP90: enabler of cancer adaptation.</a> Annual Review of Cancer Biology. 3, 275-297 (2019).</li>
<li>Yang, S., Xiao, H., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+heat+shock+proteins+in+cancer+diagnosis%2C+prognosis%2C+metabolism+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Recent advances in heat shock proteins in cancer diagnosis, prognosis, metabolism and treatment.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 142, 112074(2021).</li>
<li>Mishra, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+Hsp90%CE%B2-selective+inhibitors+to+overcome+detriments+associated+with+pan-Hsp90+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The development of Hsp90β-selective inhibitors to overcome detriments associated with pan-Hsp90 inhibition.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 64 (3), 1545-1557 (2021).</li>
<li>Khandelwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-guided+design+of+an+Hsp90beta+N-terminal+isoform-selective+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structure-guided design of an Hsp90beta N-terminal isoform-selective inhibitor.</a> Nature Communications. 9 (1), 425(2018).</li>
<li>Wang, Y., Koay, Y. C., McAlpine, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+selective+are+Hsp90+inhibitors+for+cancer+cells+over+normal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">How selective are Hsp90 inhibitors for cancer cells over normal cells.</a> ChemMedChem. 12 (5), 353-357 (2017).</li>
<li>Panaretou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+binding+and+hydrolysis+are+essential+to+the+function+of+the+Hsp90+molecular+chaperone+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo.</a> The EMBO Journal. 17 (16), 4829-4836 (1998).</li>
<li>Banerjee, M., Hatial, I., Keegan, B. M., Blagg, B. S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+design+and+development+strategies+for+finding+Hsp90+inhibitors+and+their+role+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Assay design and development strategies for finding Hsp90 inhibitors and their role in human diseases.</a> Pharmacology & Therapeutics. 221, 107747(2021).</li>
<li>Howes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+polarization+assay+for+inhibitors+of+Hsp90%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A fluorescence polarization assay for inhibitors of Hsp90.</a> Analytical Biochemistry. 350 (2), 202-213 (2006).</li>
<li>Opalińska, M., Jańska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAA+proteases%3A+guardians+of+mitochondrial+function+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">AAA proteases: guardians of mitochondrial function and homeostasis.</a> Cells. 7 (10), 163(2018).</li>
<li>Ambrose, A. J., Chapman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function%2C+therapeutic+potential%2C+and+inhibition+of+Hsp70+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Function, therapeutic potential, and inhibition of Hsp70 chaperones.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 64 (11), 7060-7082 (2021).</li>
<li>Cheng, I., Mikita, N., Fishovitz, J., Frase, H., Wintrode, P., Lee, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+region+in+the+N-terminus+of+Escherichia+coli+Lon+that+affects+ATPase%2C+substrate+translocation+and+proteolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of a region in the N-terminus of Escherichia coli Lon that affects ATPase, substrate translocation and proteolytic activity.</a> Journal of Molecular Biology. 418 (3-4), 208-225 (2012).</li>
</ol>

No hay intereses financieros en competencia.

Hsp90 es un objetivo importante para el descubrimiento de nuevas moléculas de fármacos contra el cáncer. Desde que se estableció su farmacogabilidad en 199410, 18 moléculas han llegado a ensayos clínicos. En la actualidad, siete moléculas se encuentran en diversas fases de ensayos clínicos, ya sea solas o en combinación22. Todas estas moléculas pequeñas son inhibidores de unión al ATP N-terminal. Los otros medios para inhibir la chaperona (inhibidores C-terminales, inhibido...

La proteína de choque térmico 90 (Hsp90) es una chaperona molecular que mantiene la estabilidad de las proteínas responsables del desarrollo y la progresión del cáncer. Además, las proteínas responsables del desarrollo de resistencia a los agentes antineoplásicos también son clientes de Hsp901. Hsp90 se sobreexpresa ubicuamente en todos los tipos de células cancerosas (>90% de las proteínas celulares), en comparación con las células normales donde puede constituir menos del 2% del total de proteínas. Además, el Hsp90 de las células cancerosas reside en un complejo con co-chaperonas, mientras que en una célula normal está presente predominantemente en un estado libre y no complejado 2,3. En los últimos años, se ha demostrado que varios inhibidores de Hsp90 poseen efectos senolíticos en estudios in vitro e in vivo, donde han mejorado significativamente la vida útil de ratones 4,5,6. Todos los hallazgos antes mencionados corroboran el hecho de que los inhibidores de Hsp90 podrían ser efectivos en múltiples tipos de cáncer, con menos efectos adversos y menores posibilidades de desarrollar resistencia. La función de acompañamiento de Hsp90 se logra uniendo ATP en el dominio N-terminal de Hsp90 e hidrolizándolo en ADP y fosfato libre7. Se encontró que las moléculas pequeñas que se unen competitivamente al bolsillo de unión al ATP de Hsp90 suprimen con éxito el efecto de acompañamiento de la proteína. Hasta la fecha, esta sigue siendo la mejor estrategia para la inhibición de Hsp90, lo que está respaldado por el hecho de que tales inhibidores han alcanzado ensayos clínicos8. Uno de ellos, Pimitespib, fue aprobado en Japón para el tratamiento del tumor del estroma gastrointestinal (GIST) en junio de 20229. Este es el primer inhibidor de Hsp90 aprobado desde que se estableció la farmacogabilidad de la chaperona en 199410.
El ensayo verde de malaquita es un procedimiento simple, sensible, rápido y económico para la detección de fosfato inorgánico, adecuado para la automatización y el cribado de alto rendimiento (HTS) de compuestos contra su objetivo deseado11. El ensayo se ha empleado con éxito para el cribado de inhibidores de Hsp90 en pequeñas configuraciones a escala de laboratorio, así como en un HTS 12,13,14,15,16,17. El ensayo utiliza un método colorimétrico que determina el fosfato inorgánico libre formado debido a la actividad ATPasa de Hsp90. La base de esta cuantificación es la formación de un complejo de fosfomolibdato entre fosfato libre y molibdeno, que posteriormente reacciona con el verde malaquita para generar un color verde (Figura 1). Esta rápida formación de color se mide en un espectrofotómetro, o en un lector de placas, entre 600-660 nm18,19.
En el presente protocolo, se describe el procedimiento para llevar a cabo un ensayo de verde de malaquita con levadura Hsp90 y la posterior identificación de inhibidores contra la chaperona. La molécula de producto natural, geldanamicina (GA), con la que se estableció por primera vez la farmacogabilidad de Hsp90, fue tomada como un inhibidor auténtico10. HTS se ha convertido en una parte integral del programa actual de descubrimiento de fármacos, debido a la disponibilidad de un gran número de moléculas para pruebas. Esta técnica ha ganado más importancia en los últimos 2 años debido a la necesidad urgente de reutilizar medicamentos para tratar la infección por Covid-1920,21. Por lo tanto, se presenta un esquema detallado para el HTS de moléculas contra la proteína Hsp90 de levadura mediante la adopción del método de ensayo verde de malaquita.

<table><tbody><tr><td>1M Solución de cloruro de magnesio en agua</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63069-100ml</td><td></td></tr><tr><td>1M Solución de cloruro de potasio en agua</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60142-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos</td><td>SPL Ciencias de la vida</td><td>No aplicable</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5&prime;-trifosfato hidrato de sal disódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699-5G</td><td></td></tr><tr><td>Laboratorio Biomek FX estación de trabajo de automatización</td><td>Beckman Coulter</td><td>No aplicable</td><td></td></tr><tr><td>Compuestos 3-96</td><td>No aplicable</td><td>No aplicable La</td><td>levadura Hsp90 marcada con histidina se obtuvo del Dr. Chrisostomos Prodromou, Escuela de Ciencias de la Vida, Universidad de Sussex, Reino Unido, y la proteína se expresó en el Instituto de Productos Naturales KIST Gangneung. Los detalles no se pueden divulgar debido a problemas de infracción de patentes.</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Geldanamicina, 99% (HPLC), polvo</td><td>AK Scientific, Inc.</td><td>V2064</td><td></td></tr><tr><td>Invitroge UltraPure DNasa/Agua destilada sin RNasa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Ensayo de fosfato verde de malaquita&nbsp; Kit de ensayo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK307-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Lector de microplacas de detección múltiple Synergy HT</td><td>Biotek Instruments, Inc.</td><td>No aplicable</td><td></td></tr><tr><td>Lector multiplaca Synergy HT</td><td>Biotek Instruments, Inc.</td><td>No aplicable</td><td></td></tr><tr><td>Solución tampón de clorhidrato de Trizma, pH7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93313-1L</td><td></td></tr><tr><td>Levadura Hsp90</td><td>No aplicable</td><td>No aplicable</td><td>Escuela de Ciencias de la Vida, Universidad de Sussex, Reino Unido y la proteína se expresó en KIST Gangneung Institute of Natural Products. Número de acceso primario: P02829</td></tr></tbody></table>

ensayo de verde de malaquita para el descubrimiento de inhibidores de la proteína 90 de choque térmico

Malachite Green Assay for the Discovery of Heat-Shock Protein 90 Inhibitors

La proteína de choque térmico 90 (Hsp90) es un objetivo anticancerígeno prometedor debido a su efecto de acompañamiento en múltiples proteínas oncogénicas. La actividad de Hsp90 depende de su capacidad para hidrolizar trifosfato de adenosina (ATP) a difosfato de adenosina (ADP) y fosfato libre. La actividad ATPasa de Hsp90 está vinculada a su función de acompañamiento; El ATP se une al dominio N-terminal del Hsp90, y se encontró que interrumpir su enlace era la estrategia más exitosa para suprimir la función Hsp90. La actividad de la ATPasa se puede medir mediante un ensayo colorimétrico de verde de malaquita, que determina la cantidad de fosfato libre formado por hidrólisis de ATP. Aquí, se describe un procedimiento para determinar la actividad ATPasa de la levadura Hsp90 utilizando el kit de ensayo de fosfato verde de malaquita. Además, se proporcionan instrucciones detalladas para el descubrimiento de inhibidores de Hsp90 tomando geldanamicina como un inhibidor auténtico. Finalmente, se discute la aplicación de este protocolo de ensayo a través del cribado de alto rendimiento (HTS) de moléculas inhibidoras contra levadura Hsp90.

Los resultados del ensayo se interpretan en términos de absorbancia debido a la concentración de iones fosfato libres. La absorbancia por fosfato libre debido a la hidrólisis de ATP por la levadura Hsp90 a 620 nm se considera como 100% de actividad ATPasa, o inhibición de proteína de porcentaje cero. La inhibición de la proteína conduce al cese de la hidrólisis del ATP (menos fosfato libre). que se refleja en términos de disminución de la absorbancia a 620 nm.
Resultados del ensayo de ...

El protocolo de ensayo de verde de malaquita es un método simple y rentable para descubrir supresores de la proteína de choque térmico 90 (Hsp90), así como otros compuestos inhibidores contra enzimas dependientes de ATP.

Ensayo de verde de malaquita para el descubrimiento de inhibidores de la proteína 90 de choque térmico

Heat shock protein 90 (Hsp90) is a promising anticancer target because of its chaperoning effect on multiple oncogenic proteins. The activity of Hsp90 is ...

Este protocolo ayudará en la determinación de la actividad de las proteínas ATPasa mediante la medición del fosfato libre resultante de la hidrólisis de ATP por las proteínas. El ensayo de verde de malaquita es un procedimiento simple, sensible, rápido y económico para la detección de fosfato inorgánico. Es adecuado para la automatización y el cribado de alto rendimiento de compuestos contra su objetivo.Esta técnica jugará un papel importante en el rápido descubrimiento de inhibidores contra la proteína Hsp90, que es un importante objetivo anticancerígeno. Para comenzar, pipetear 40 microlitros de fosfato estándar de un milimolar en 960 microlitros de agua ultrapura para obtener una solución de fosfato de 40 micromolares. Agregue esta solución según las instrucciones del fabricante para formar una dilución en serie de fosfato de 0 a 40 micromolar.A continuación, use ocho microlitros de levadura Hsp90 para una actividad de ATPasa medible. Agregue el reactivo verde de malaquita al blanco y al control positivo, y verifique que la diferencia de densidad óptica entre el blanco y el control positivo después de la adición sea al menos 0.5 e inferior a 1. Para preparar ATP, transfiera un m

malachite-green-assay-for-discovery-heat-shock-protein-90

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

En este protocolo un método para medir el replegamiento de proteínas intracelulares tras el choque térmico se describe. Este método puede ser usado para estudiar foldases como chaperones moleculares y sus co-factores o componentes capaces de influir en su actividad. La actividad luciferasa de luciérnaga se utiliza como reportero para medir la actividad de las chaperonas replegado.

Ensayo Replegado intracelular

Se presenta una variación de la RÁPIDA (inmunoprecipitación cuantitativa Combinado con Knockdown) enfoque que se introdujo anteriormente para distinguir entre verdadera y falsa interacciones proteína-proteína. Nuestro enfoque se basa...

El Protocolo para la identificación de las interacciones proteína-proteína base de<sup&gt; 15</sup&gt; N metabólico Etiquetado, inmunoprecipitación, cuantitativa Espectrometría de Masas y Modulación Affinity

En este video, demostramos el ensayo homogéneo de proximidad luminiscente amplificado, un ensayo de proximidad basado en perlas. Utiliza perlas aceptoras y donantes de tamaño homogéneo, inmovilizadas con dos proteínas que tienden a interactuar para detectar posibles moléculas pequeñas que inhiben las interacciones proteicas.

Ensayo homogéneo de proximidad luminiscente amplificado: un ensayo de proximidad basado en perlas para cribar moléculas pequeñas que inhiben las interacciones proteína-proteína

Una de las más difíciles condiciones de estrés que organismos durante toda su vida consiste en la acumulación de oxidantes. Durante el estrés oxidativo, las células dependen pesadamente chaperonas moleculares. Aquí, presentamos los métodos utilizados para investigar la regulación redox agregación de la actividad, así como para dar seguimiento a los cambios estructurales que rigen la función de chaperona con HDX-MS.

Definición acompañante Regulación Redox actividad de Hsp33 y mapeo de cambios conformacionales en la Hsp33 mediante espectrometría de masas de intercambio hidrógeno-deuterio

Un ensayo ATPase acoplado a la nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) se ha adaptado al cribado de rendimiento semialto de inhibidores de la miosina de moléculas pequeñas. Este ensayo cinético se ejecuta en un formato de microplaca de 384 pocillos con volúmenes de reacción totales de sólo 20 s por poca. La plataforma debe ser aplicable a prácticamente cualquier enzima productora de ADP.

Una adaptación de semi-alto rendimiento del ensayo ATPase acoplado a NADH para la detección de inhibidores de moléculas pequeñas

La capacidad de evaluar la participación objetivo de los inhibidores candidatos en las células intactas es crucial para el descubrimiento de fármacos. Este protocolo describe un ensayo de cambio térmico celular de formato de 384 pozos que detecta de forma fiable el compromiso de destino celular de inhibidores dirigidos a SHP2 de tipo salvaje o sus variantes oncogénicas.

Evaluación del compromiso de objetivos celulares por inhibidores de la fosfatasa SHP2 (PTPN11)

SAMHD1 es una trifosfofosfato trifosfohidrolasa desoxinucleósido con funciones críticas en la salud y la enfermedad humanas. Aquí presentamos un ensayo versátil de actividad de SAMHD1 acoplado a enzimas, desplegado en un formato de microplaca de 384 pocillos, que permite la evaluación de moléculas pequeñas y análogos de nucleótidos como sustratos, activadores e inhibidores de SAMHD1.

Un ensayo de actividad acoplada a enzimas de alto rendimiento para sondear la interacción de moléculas pequeñas con la dNTPasa SAMHD1

Este protocolo presenta una técnica para sondear las interacciones proteína-proteína utilizando perlas de donantes ligadas al glutatión con co-chaperonas con motivos TPR fusionadas con GST y perlas aceptoras junto con un péptido derivado de Hsp90. Hemos utilizado esta técnica para detectar moléculas pequeñas para interrumpir las interacciones Hsp90-FKBP51 o Hsp90-FKBP52 e identificado inhibidores potentes y selectivos de la interacción Hsp90-FKBP51.

Estudios de interacciones chaperona-cochaperona utilizando un ensayo homogéneo basado en cuentas

Este protocolo demuestra la actividad chaperona de la proteína de choque térmico 70 (Hsp70). Las células de E. coli dnaK756 sirven como modelo para el ensayo, ya que albergan una Hsp70 nativa y funcionalmente deteriorada, lo que las hace susceptibles al estrés térmico. La introducción heteróloga de Hsp70 funcional rescata la deficiencia de crecimiento de las células.

Ensayo de complementación basado en Escherichia coli para estudiar la función chaperona de la proteína de choque térmico 70

Este protocolo introduce una metodología de cribado fluorométrico optimizada para identificar inhibidores naturales de productos o pequeñas moléculas en la síntesis de proteínas. Su viabilidad la hace adecuada tanto para la enseñanza de grado en técnicas de descubrimiento de fármacos como para su implementación en campañas de química medicinal.

Un protocolo basado en fluorescencia para el cribado preliminar de inhibidores de síntesis de proteínas de fuentes naturales

Aprende el ensayo de verde de malaquita para detectar fosfato inorgánico y descubrir inhibidores de Hsp90. Este método sencillo y económico facilita el cribado de alta producción en investigación oncológica.

Ensayo de verde de malaquita para el descubrimiento de inhibidores de la proteína 90 de choque térmico

Explorar más videos