Análisis e imagen de osteocitos

Se postula que el esfuerzo cortante por flujo de fluido es un estimulador mecanoestimulador de los osteocitos. Dado que la medición directa no es una opción, los modelos confocales derivados de imágenes de osteocitos son una herramienta valiosa para realizar análisis de dinámica de fluidos computacional para evaluar las tensiones puras del flujo de fluido en las membranas dendríticas de los osteocitos. Algunos de los trabajos realizados en nuestro laboratorio corresponden a los desarrollos recientes en el campo donde se utiliza la morfología real de las lagunas de los osteocitos, incluida la tortuosidad y la densidad de las dendritas, junto con la red ósea y lacunar-canalicular para determinar numéricamente el esfuerzo de cizallamiento del flujo de fluido y las ubicaciones en la estructura dendrítica del osteocito donde el esfuerzo es alto.

Las tecnologías actuales incluyen varios modelos computacionales, como el análisis de elementos finales, la dinámica de fluidos computacional, la interacción fluido-estructura, el modelado basado en imágenes, incluido el microscopio de rayos X o confocal para modelos 3D precisos y mediante sistemas de pruebas mecánicas para validar los modelos midiendo las respuestas óseas, como las deformaciones en condiciones de carga controlada. Nuestros hallazgos indican que la pérdida de dendritas debido al envejecimiento o la enfermedad ósea es un factor en el que los huesos se vuelven menos sensibles a la actividad física. Predijimos que los osteocitos detectan cargas mecánicas a través de regiones de alto esfuerzo cortante de flujo de fluido que son dendritas.

Y el esfuerzo cortante del flujo de fluido se correlaciona con una morfología lacunar similar, especialmente el área de superficie. Con el establecimiento de este protocolo, ahora estamos trabajando en un proyecto de los NIH para estudiar el esfuerzo de cizallamiento del flujo de fluidos en las dendritas de osteocitos de huesos de ratones de dos edades y sexos diferentes. Este estudio ayudará a determinar cómo el envejecimiento y las diferencias sexuales afectan la transducción mecanométrica en el hueso debido a la carga.

Para empezar, fije el fémur recogido del ratón en paraformaldehído frío al 4% en solución salina tamponada con fosfato durante 24 horas a cuatro grados centígrados con un balanceo suave. Al día siguiente, enjuague el hueso y la solución salina tamponada con fosfato e insértela rápidamente en un acrílico de polimerización rápida. Corta cortes transversales gruesos de 300 micrómetros por encima del tercer trocánter.

Con papel de lija, pula las secciones de hueso hasta un grosor final de 90 a 100 micrómetros. A continuación, enjuague las secciones pulidas con etanol al 70%95% y al 100% durante cinco minutos cada una. Tiñir las secciones con 1%fit C en 100%etanol durante cuatro horas en la oscuridad con una agitación moderada.

A continuación, lave bien las secciones con etanol al 100%. Y séquelos al aire durante la noche antes de colocarlos en una gota de medio de montaje en un portaobjetos de vidrio. Monta un cubreobjetos en la muestra.

En un microscopio confocal, configure un láser de 488 nanómetros para la excitación y una ventana de recolección de emisiones de 496 a 596 nanómetros. Primero, capture una imagen de baja potencia de toda la sección ósea usando el objetivo 5x. A continuación, capture imágenes de las tres regiones de interés con el objetivo 20x.

Utilice un objetivo de aceite de apertura numérica de 100x 1,44 con un zoom digital de 1,7 y un tamaño de paso de 0,126 micrómetros para recopilar pilas Z detalladas de 400 planos Z de 1024 por 1024 píxeles y una resolución de píxeles de 0,089 micrómetros. Para el modelado informático de osteocitos de ratón, abra el software ImageJ después de importar las imágenes de la pila Z recopiladas del fémur del ratón en formato TIFF, ajuste el umbral en el menú de sección para cambiar los límites de intensidad de píxeles para su inclusión en una máscara. Con la operación de máscara de recorte, recorte una laguna con sus canalículos como región de interés.

Encierra la laguna en un cubo imaginario más grande con longitudes de lado de 21, 14 y 19 micrómetros. Realice una operación de crecimiento de región para seleccionar las regiones de píxeles conectadas para generar una red lacunar-canalicular o LCN uniforme. A continuación, utilizando la operación de parte calculada, convierta la máscara lacunar-canalicular en un objeto.

Reduzca el volumen de LCN utilizando la operación de alisado para construir el osteocito y las membranas dendríticas. A continuación, exporte los objetos. Combine dos superficies de las membranas dendríticas del LCN y del osteocito en una sola superficie.

Ahora, utilice la operación de remallado para crear un modelo volumétrico del espacio canalicular lacunar. Exporte el modelo como un archivo STL y ajuste la escala del objeto a micrómetros. En un software de procesamiento basado en imágenes tridimensionales, elija el modelo volumétrico del espacio lacunar-canalicular del ratón como modelo base para construir distintos modelos de osteocitos.

Seleccione un umbral más bajo para reducir la intensidad de luz de la imagen y obtener una laguna con menos canalículos. A continuación, desarrolle modelos de osteocitos con diferentes espesores de espacio lacunar-canalicular o diámetros canaliculares de dendritas. Construya modelos de osteocitos más grandes o más pequeños utilizando operaciones de envoltura o alisado, respectivamente.

Para crear un flujo de fluido en el software de simulación, importe las geometrías basadas en imágenes confocales desarrolladas en el software CFX. Establezca las dimensiones de la unidad en nanómetros. A continuación, haga clic en restar para lograr un solo cuerpo de espacio canicular lacunar.

Haga clic con el botón derecho en la faceta generada y conviértala de facetas a un dominio sólido sin fusionar caras. Haga clic en malla y seleccione elementos tetraédricos lineales con un tamaño de elemento de 0,06 micrómetros. Perfeccione la malla con un estudio de convergencia de malla.

Ahora, seleccione la superficie y elija los canalículos en la parte superior del cubo imaginario como entradas de fluido. Usando la caja, elija los canalículos en las otras cinco caras como salidas de fluido. A continuación, exporte la malla.

Después de crear otro flujo de fluido, importe la malla fluida en la sección de configuración de CFX. Con la opción de contorno de inserción, defina dos condiciones de contorno de sumideros y salientes para las caras. Ejerza una presión de entrada de fluido de 300 y cero pascales en las entradas y salidas, respectivamente.

Trate las superficies restantes como paredes con una condición antideslizante. De la biblioteca de materiales, trate el líquido laminar intersticial como agua. Establezca las secciones de transferencia de calor, combustión y radiación térmica en ninguna.

Seleccione la turbulencia como característica del fluido en el LCN. A continuación, ejecute el software utilizando la doble precisión y el inicio directo como tipo de envío. Inserte un nuevo contorno en la sección de resultados del software CFD.

Cree un esfuerzo de cizallamiento de flujo de fluido o contorno FFSS eligiendo el cizallamiento de pared en las membranas dendríticas del osteocito como variable en el dominio. A continuación, inserte un contorno de líneas de corriente de velocidad dentro del dominio lacunar-canalicular a partir de las entradas. El promedio de FFSS en osteocitos y membranas dendríticas en el modelo de osteocito joven fue de 0,42 Pascal, que fue significativamente mayor que 0,13 Pascal en el modelo de osteocito envejecido.

La FFSS aumentó en los osteocitos con mayor espacio canalicular lacunar, como se observó en el modelo siete y el modelo ocho, donde el modelo ocho mostró la FFSS más alta. Los valores más bajos de FFSS de 0,19 Pascal y 0,13 Pascal se observaron en el modelo dos y el modelo cuatro, respectivamente, con la densidad canalicular más baja. No se observaron cambios significativos en FFSS con el aumento del diámetro de las dendritas como se observó en los modelos cinco y seis.