Name: Estrategia basada en CRISPR de un solo paso para el etiquetado de genes endógenos en Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Aprende a generar líneas de Drosophila modificadas mediante CRISPR y recombinación homóloga con este protocolo simplificado. Reduce el tiempo de genotipado y valida ediciones genéticas mediante PCR en patas de mosca.

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Agradecemos a George Watase y Josie Clowney por las discusiones durante las etapas iniciales del desarrollo del protocolo. El trabajo fue financiado por fondos de los NIH (subvención n.º R35GM133737 a S.Y.), Alfred P. Sloan Fellowship (a S. Y.) y McKnight Scholar Award (a S. Y.).

1. Diseño y construcción de reactivos de edición génica
NOTA: Para llevar a cabo el marcaje endógeno, es imprescindible identificar las distintas isoformas del gen deseado. Dependiendo de los objetivos específicos del experimento, se puede incorporar una etiqueta fluorescente internamente o en el extremo N o C de la(s) isoforma(s) de proteína seleccionada(s). Para una edición óptima mediada por CRISPR, es crucial colocar los dos sgRNAs adecuadamente cerca del sitio de knock-in previsto. Posteriormente, para permitir la edición a través de la recombinación homóloga, se debe preparar un vector donante que abarque secuencias homólogas al gen diana, junto con la etiqueta fluorescente. A continuación se muestra una guía paso a paso de estos procesos (Figura 1).
<ol><li>Diseñe el sgRNA como se describe a continuación.<ol><li>Diseñe sgRNAs para Drosophila utilizando estos sitios web: http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/ o http://www.flyrnai.org/crispr2/.</li>
		<li>Para el sitio web de flycrispr, ingrese la secuencia ±100 pb que rodea la ubicación deseada del knock-in (terminal N, terminal C o cualquier locus genómico de interés). Si utiliza el nos-Cas9 attP2 como fondo de inyección, elija la opción de genoma Drosophila melanogaster (nos-Cas9 III, BDSC #78782). El sistema Nos-Cas9 garantiza la expresión de Cas9 específica de la línea germinal.</li>
		<li>Para mejorar la eficiencia de la expresión de sgRNA, seleccione los objetivos CRISPR con la opción 5' G , ya que los sgRNA que comienzan con una guanina mejorarán la actividad de edición. A continuación, haz clic en el botón Buscar objetivos CRISPR . Se mostrará una lista de posibles secuencias de sgRNA.</li>
		<li>Para cada secuencia, haga clic en el botón Evaluar . Esta acción comprueba si hay posibles objetivos fuera de lugar para cada secuencia en función del genoma previamente seleccionado. De la lista proporcionada, elija 2 sgRNAs que tengan 0 objetivos apagados. Asegúrese de que un sgRNA esté aguas arriba y el otro aguas abajo en relación con la ubicación del knock-in. Idealmente, sus posiciones deben estar lo más cerca posible del sitio del knock-in (<200 pb), pero no deben superponerse entre sí (Figura 2). NOTA: A veces puede ser difícil encontrar sgRNAs apropiados para un gen diana determinado. El espacio entre los sgRNAs y la ubicación del knock-in se puede aumentar a ± 200 pb. El uso de sgRNAs que no se inician con G podría disminuir ligeramente la tasa de positivos.</li>
	</ol></li>
	<li>Realice la selección de etiquetas fluorescentes como se describe a continuación.<ol><li>Las etiquetas fluorescentes ofrecen una amplia gama de características, cada una de las cuales tiene sus ventajas e inconvenientes únicos 1,2. A la hora de determinar la etiqueta fluorescente ideal para etiquetar una proteína específica, tenga en cuenta las consideraciones clave descritas en los siguientes pasos que entran en juego.</li>
		<li>Dado que los niveles de expresión natural de proteínas suelen ser mucho más bajos que los observados en los experimentos de sobreexpresión 1,2, comience con las etiquetas que son brillantes y fotoestables y que se ajustan a la configuración experimental. Algunas etiquetas fluorescentes, específicamente ciertas RFP como tdTomato y DsRed, tienden a formar multímeros14 y pueden conducir a la agregación de proteínas.</li>
		<li>Para una mayor versatilidad, vincule las etiquetas de epítopos (p. ej., FLAG o V5) al marcador fluorescente utilizando un enlazador flexible, que permite realizar análisis bioquímicos como Western Blot o coinmunoprecipitación.</li>
	</ol></li>
	<li>Para el diseño del vinculador, siga los pasos que se describen a continuación.<ol><li>Para una funcionalidad óptima, asegúrese de que tanto la proteína endógena de interés como la etiqueta fluorescente se plieguen por separado en sus respectivas formas funcionales. Para lograr esto, use un péptido enlazador que tenga una longitud de 2 a 20 aminoácidos. Por ejemplo, coloque dos residuos de glicina entre el último aminoácido de la proteína Period y el primer aminoácido de la proteína fluorescente knock-in mNeonGreen.</li>
		<li>Asegúrese de que estas secuencias de péptidos enlazadores comprendan aminoácidos como la glicina y la serina, que imparten flexibilidad a la estructura15. Esto asegura que el comportamiento natural y la ubicación de la proteína endógena permanezcan inalterados.</li>
	</ol></li>
	<li>Diseñe el vector donante como se describe a continuación. NOTA: El vector donante introduce la etiqueta fluorescente en la ubicación endógena deseada a través del proceso de reparación dirigida por homología, que se inicia mediante la escisión CRISPR. Como tal, además de la etiqueta fluorescente, el vector donante debe poseer secuencias que sean homólogas en ambos lados de la etiqueta.<ol><li>Comience el diseño del vector donante organizando la secuencia de ADN del péptido enlazador y la etiqueta fluorescente y asegúrese de que haya secuencias homólogas flanqueando ambos extremos (brazos de homología). Para obtener resultados óptimos, asegúrese de que los brazos de homología abarquen al menos 800 nucleótidos a cada lado del sitio de inserción previsto (Figura 2). NOTA: Informes recientes sugieren que los brazos de homología pueden ser más cortos (100-200 pb)16.</li>
		<li>Asegúrese de que todas las secuencias de PAM dentro del plásmido donante se modifiquen de tal manera que la secuencia de aminoácidos de la proteína resultante permanezca sin cambios. Si la secuencia PAM se encuentra en la UTR, elimínela por completo.</li>
		<li>La posición de los codones START y STOP depende de la ubicación de la etiqueta. Para el marcaje interno, asegúrese de que la etiqueta fluorescente esté en el marco con la secuencia codificante del gen diana. Para el marcaje N-terminal, coloque la etiqueta fluorescente antes del codón de inicio endógeno. Para el etiquetado C-terminal, sitúe la etiqueta fluorescente antes del codón de parada natural y asegúrese de conservar un solo codón de inicio para evitar posibles problemas de traducción.</li>
	</ol></li>
	<li>Sintetizar sgRNA y plásmidos donantes como se describe a continuación.<ol><li>Para la creación de plásmidos de ARNsg, siga las pautas de clonación de ARNg U6, que se pueden encontrar en flycrispr.org/protocols/grna/. Emplee el enfoque alternativo de clonación basado en enzimas de restricción (denominado estrategia C en el recurso proporcionado) para insertar la secuencia de ARNg en el plásmido pU6-BbsI-chiRNA (Addgene, #45946).</li>
		<li>Transforma en DH5a E. coli (NEB, C2987H) siguiendo los protocolos de transformación estándar proporcionados por el fabricante. Para la verificación, realice la secuenciación Sanger en los clones resultantes utilizando cebadores de secuenciación estándar T3 o T7.</li>
		<li>Para la creación de plásmido de donante, adquiera ADN bicatenario con la secuencia de donante deseada de proveedores comerciales (por ejemplo, IDT). Intégrelo en el sitio de clonación múltiple pBlueScriptII SK(-). Secuenciar el plásmido donante para asegurarse de que las secuencias de sgRNA o PAM se modifiquen correctamente y que no haya SNP presentes en el plásmido. NOTA: Una alternativa a la integración mediante pBlueScriptII es la PCR de los brazos de homología y los segmentos de etiqueta fluorescente por separado y consolidarlos en la red troncal utilizando técnicas como el ensamblaje Golden Gate o el ensamblaje Gibson.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilice el siguiente esquema de inyección y cruce.<ol><li>Para adquirir moscas editadas en la línea germinal, coinyecte plásmidos de ARNg y el plásmido donante en el fondo Cas9 apropiado (p. ej., nos-Cas9 III, BDSC 78782). Si utiliza servicios de inyección comercial, siga las instrucciones del proveedor para realizar la preparación del plásmido. NOTA: Normalmente, la concentración de plásmidos de ARNg debe superar los 0,5 μg/μL y la concentración de plásmidos del donante debe ser superior a 1,0 μg/μL. Un plazo común desde el envío de muestras de plásmidos hasta la recepción de embriones inyectados es de aproximadamente 2 semanas. Aquí se presenta una estrategia para detectar eventos de edición de genes en el cromosoma X empleando la cepa balanceadora FM7/L. Para los genes del segundo o tercer cromosoma, emplee las cepas de equilibrio adecuadas.</li>
		<li>Para la recolección de moscas inyectadas (G0), anestesiar con dióxido de carbono y separar moscas macho y hembras vírgenes. Establecer cruces de moscas emparejando cada macho G0 con al menos dos hembras vírgenes FM7/L en viales individuales estrechos de alimento CT. Coloque los viales cruzados en una incubadora ventilada mantenida a 25 ° C y ~ 60% de humedad hasta que las moscas F1 se cierren (FM7 / L es el equilibrador del cromosoma X más utilizado). Del mismo modo, empareje cada hembra G0 con moscas macho FM7/Y.</li>
		<li>Anestesiar y recolectar al menos 10 crías de hembras vírgenes (F1) de cruces de machos y hembras G0. A partir de cruces de hembras G0, reúna al menos 10 moscas F1 macho (Figura 3A). Asegúrese de que cada mosca F1 esté etiquetada con los detalles de su parentesco y almacenada por separado. Continúe con el paso de selección.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilice el siguiente protocolo de PCR de una sola pierna.<ol><li>Creación de cebadores: Diseñe un par de cebadores que abarquen el sitio de edición del gen diana. Lo ideal es que las temperaturas de fusión de las imprimaciones sean similares, en torno a los 55°C.</li>
		<li>Preparación del tampón de lisis: Prepare 10 μL de tampón de lisis para cada muestra de mosca. El tampón consta de 10 mM de Tris (pH 8,2), 1 mM de EDTA (pH 8,0), 25 mM de NaCl y 400 μg/mL de proteinasa K. Prepare el tampón de lisis como una mezcla maestra, luego distribuya 10 μL en cada pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos. Asegúrese de que el tampón permanezca frío durante todo el proceso de disección de la pierna (Figura 3B).</li>
		<li>Configuración del tubo: Prepare tubos capilares de vidrio, llenando un extremo con alimento de sacarosa-agar (2% de agar y 4% de sacarosa), y colóquelos en una placa de 96 pocillos profundos, que se denominará el hotel de moscas (Figura 3C).</li>
		<li>Disección de la pierna: Coloque la almohadilla de anestesia de dióxido de carbono bajo un microscopio estereoscópico, anestesie una mosca candidata y corte una de las patas medias. Coloque la pierna en el tampón de lisis, asegurando una inmersión completa. No es necesario macerar la pierna, se procede directamente al paso del protocolo de lisis (Figura 3B). Sostenga el ala de la mosca con un par de pinzas de metal fino, mueva la mosca al hotel de la mosca y selle el tubo con hilo inmediatamente.</li>
		<li>Muestras de control: Se pueden usar dos moscas de tipo salvaje como controles negativos siguiendo el mismo procedimiento de disección de patas. Un plásmido de donante diluido sirve como control positivo.</li>
		<li>Cuidados posteriores a la disección: Aloje el hotel de moscas en una incubadora ventilada mantenida a 25 °C y ~60% de humedad. Si bien las moscas pueden sobrevivir durante la noche, se recomienda completar los pasos posteriores y el apareamiento en el mismo día.</li>
		<li>Protocolo de lisis: Colocar las patas cortadas en la solución tampón de lisis en un termociclador ajustado a 37 °C durante 90 min, seguido de 95 °C durante 5 min, finalmente mantenido a 4 °C. Esto extraerá suficiente ADN de la pata de cada mosca (Figura 3B).</li>
		<li>Reacción de PCR: Organice la reacción de PCR según las instrucciones del fabricante, utilizando 1,5 μL del lisado de patas de mosca como fuente de ADN.</li>
		<li>Electroforesis en gel: Someter los productos de PCR a electroforesis en gel de agarosa. Interprete los resultados del gel en función del tamaño de la banda. Por lo general, las moscas de control negativo exhibirán una banda más baja y los controles de plásmidos positivos mostrarán una banda más alta. Asegúrese de que los tamaños de banda específicos sean consistentes con el diseño original del plásmido del donante. Las moscas hembras positivas mostrarán dos bandas ya que son heterocigóticas, y las masculinas positivas presentarán una sola banda (Figura 3B). NOTA: Por lo general, se puede realizar la detección de 70 moscas en un solo día. Asegúrese de identificar un mínimo de 10 moscas F1 positivas en 4 o 5 cruces G0 distintos, ya que ciertas F1 pueden ser estériles debido a mutaciones fuera del objetivo.</li>
	</ol></li>
	<li>Realice la siguiente configuración cruzada posterior a la PCR.<ol><li>Con base en los resultados del gel, seleccione las moscas positivas del hotel de moscas y crucéelas individualmente con moscas balanceadoras (FM7/L para marcar genes del cromosoma X) para producir la generación F2. Una vez que emerja la generación F2, establezca cruces de hermanos para crear poblaciones estables homocigóticas (Figura 3D).</li>
		<li>Utilice material homocigótico para la secuenciación Sanger del sitio de edición para garantizar la precisión. Líneas de mosca validadas por retrocruzamiento con moscas de tipo salvaje para eliminar las mutaciones de fondo. Realice pruebas de detección en cada generación mediante el protocolo de PCR de una sola pierna.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90 (3), 1103-1163 (2010).</li>
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<li>Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins%3A+a+cell+biologist%27s+user+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide.</a> Trends Cell Biol. 19 (11), 649-655 (2009).</li>
<li>Kanca, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expanded+toolkit+for+Drosophila+gene+tagging+using+synthesized+homology+donor+constructs+for+CRISPR-mediated+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">An expanded toolkit for Drosophila gene tagging using synthesized homology donor constructs for CRISPR-mediated homologous recombination.</a> Elife. 11, e76077(2022).</li>
<li>Nitabach, M. N., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+Drosophila+circadian+control+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Organization of the Drosophila circadian control circuit.</a> Curr Biol. 18 (2), R84-R93 (2008).</li>
<li>Carvalho, G. B., Ja, W. W., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-lethal+PCR+genotyping+of+single+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Non-lethal PCR genotyping of single Drosophila.</a> Biotechniques. 46 (4), 312-314 (2009).</li>
<li>Gummadova, J. O., Coutts, G. A., Glossop, N. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Drosophila+Clock+promoter+reveals+heterogeneity+in+expression+between+subgroups+of+central+oscillator+cells+and+identifies+a+novel+enhancer+region%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Rhythms%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Drosophila Clock promoter reveals heterogeneity in expression between subgroups of central oscillator cells and identifies a novel enhancer region.</a> J Biol Rhythms. 24 (5), 353-367 (2009).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Los resultados demuestran una estrategia simplificada y sencilla basada en CRISPR de un solo paso para etiquetar genes endógenos en Drosophila. En el protocolo, utilizamos dos ARNg para inducir la rotura de la doble cadena de ADN y la recombinación homóloga de manera más eficiente. Los ARNg y el plásmido donante se inyectan en embriones de mosca de la fruta, que expresan la enzima Cas9 en su línea germinal. Estos embriones se cultivan posteriormente en condiciones normales hasta la edad adulta, momento en el que se cruzan con moscas equilibradoras para producir la descendencia de primera generación (F1). El genotipado por PCR se realiza en la pata media de cada espécimen F1 para detectar moscas modificadas genéticamente. Este método proporciona una ventaja significativa sobre los métodos de cribado actuales que utilizan dos pasos de cribado, donde el primer paso se basa en el uso de un marcador visible, como el color de los ojos, para identificar el genotipo apropiado y el segundo paso consiste en la eliminación del marcador de color de los ojos10. Aquí, presentamos un método que emplea PCR en ADN extraído de un pequeño segmento de la pata media de una mosca individual que permite el genotipado no letal de moscas individuales, ofreciendo una alternativa más eficiente y rentable a los métodos existentes. Este método permite el cribado de los animales candidatos uno a uno o en lotes hasta que se aísle el genotipo adecuado. El número de animales examinados antes de aislar las poblaciones apropiadas varía de un experimento a otro, dependiendo de muchos factores, como la eficacia de los ARNg seleccionados, la eficacia de la inyección y las inserciones fuera del objetivo que pueden afectar a la viabilidad. Alternativamente, el ADN de alas individuales de moscas individuales también se puede utilizar con fines de genotipado18.
Es posible que la adición de una etiqueta al terminal N o C de un gen pueda afectar negativamente la función del gen, lo que puede afectar potencialmente la viabilidad de las moscas. Si se dispone de información sobre la estructura de la proteína, se puede utilizar para determinar si el marcaje N-terminal o C-terminal puede preservar mejor la función y la localización de la proteína nativa. Siempre se recomienda realizar experimentos de control, incluida la prueba de si la proteína marcada muestra un patrón de localización similar al de la proteína de tipo salvaje mediante métodos de tinción de anticuerpos. La misma estrategia de cribado se puede utilizar para cribar otros tipos de inserciones o deleciones genéticas basadas en CRISPR. En conclusión, la estrategia de cribado en un solo paso facilita mucho la generación de moscas editadas con CRISPR y abre muchas posibilidades para estudiar la localización subcelular y la dinámica de los genes endógenos en su contexto nativo.

Las proteínas fluorescentes han surgido como herramientas poderosas para visualizar la localización de proteínas, la dinámica y las interacciones proteína-proteína en células dentro de organismos vivos 1,2. El marcaje de genes endógenos con proteínas fluorescentes permite obtener imágenes en vivo a largo plazo de los procesos celulares con resolución subcelular. Además, estas técnicas de marcaje de genes endógenos tienen varias ventajas en comparación con los enfoques de sobreexpresión e inmunotinción. Por ejemplo, la sobreexpresión de proteínas puede conducir a un mal plegamiento de proteínas, interacciones inespecíficas proteína-proteína y mala localización3. Hasta la fecha, los investigadores han sido capaces de crear vastas bibliotecas de genes endógenos fusionados con proteínas fluorescentes para unos pocos organismos modelo, como la levadura en ciernes, que puede someterse a unarecombinación homóloga eficiente. En el caso de Drosophila melanogaster, se han ideado varias herramientas como MiMICs5, trampas potenciadorasbasadas en transposones 6 y fosmids7 para marcar genes de forma fluorescente.
El desarrollo de herramientas basadas en CRISPR-Cas9 ha hecho posible realizar de manera eficiente la edición del genoma, incluido el etiquetado de proteínas endógenas, en una amplia gama de organismos modelo 8,9. Cas9 es una enzima guiada por ARN que escinde el ADN bicatenario de una manera altamente eficiente y específica8, que luego puede ser reparado por una vía de unión de extremos no homóloga (NHEJ) que conduce a mutaciones puntuales o deleciones. Alternativamente, la vía de reparación dirigida por homología (HDR) permite la integración del ADN heterólogo en el cromosoma.
Los métodos anteriores para el etiquetado de genes basado en CRISPR en el organismo modelo, Drosophila melanogaster, se han basado en un proceso de dos pasos 10,11,12. Esto implica el uso de un marcador de color de ojos discernible, Dsred, para detectar eventos HDR exitosos. Posteriormente, el marcador Dsred se extirparía mediante el sistema de recombinación Cre/loxP. Para agilizar y agilizar este proceso, aquí te presentamos un método más sencillo y eficiente. Este enfoque evita la necesidad de genotipado letal y permite la detección directa de moscas individuales. Específicamente, empleamos un enfoque basado en PCR para extraer ADN de un pequeño segmento de la pata media de la mosca, lo que nos permite genotipar moscas individuales. Cabe destacar que este procedimiento no compromete la vitalidad, el movimiento o las capacidades reproductivas de la mosca muestreada. Solo los individuos apropiados, identificados a través de este método, se convierten en poblaciones estables.
Aquí, presentamos un protocolo detallado para generar moscas marcadas con proteínas fluorescentes en el que los genes endógenos se marcan con reporteros fluorescentes. Esta técnica utiliza la edición del genoma CRISPR-Cas9 para fusionar cualquier etiqueta de fluoróforo deseada con el terminal N o C de un gen endógeno. A continuación, describimos el diseño y la construcción de plásmidos de ARNg y un plásmido de donante, la estrategia de cribado de un solo paso para seleccionar moscas positivas para CRISPR y los pasos para establecer líneas estables. Específicamente, describimos estrategias para marcar un gen endógeno de Drosophila, punto, con un fluoróforo en el terminal C. También describimos brevemente los experimentos de control que deben realizarse para confirmar que la proteína marcada es funcional y las técnicas de imagen en vivo para visualizar la proteína Period en neuronas de reloj vivo dentro de cerebros intactos de Drosophila 13. El protocolo descrito aquí también es ampliamente aplicable a los candidatos para la deleción e inserción de fragmentos específicos de ADN mediante la edición del genoma CRISPR-Cas9.

<table><tbody><tr><td>0.5M EDTA pH8.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>5-alfa Competente&nbsp;E. coli&nbsp;( Alta eficiencia)</td><td>NEB</td><td>C2987H Placa</td><td></td></tr><tr><td>de pocillo profundo de 96 pocillos</td><td>MARCA</td><td>701354</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>BbsI-HF</td><td>NEB</td><td>R3539S</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>D-Sacarosa</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A142-212</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Vidrio Antidecoloración Medio de montaje</td><td>Invitrogen</td><td>P36982</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>QIAGEN</td><td>19131</td><td></td></tr><tr><td>Schneider's Drosophila</td><td>Medio Gibco</td><td>21720001 Cloruro</td><td></td></tr><tr><td>de</td> <td>sodioFisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>R0145S</td><td></td></tr></tbody></table>

estrategia basada en crispr de un solo paso para el etiquetado de genes endógenos en drosophila melanogaster

One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster

El estudio de la localización, dinámica y regulación de proteínas subcelulares en células vivas se ha transformado profundamente con el advenimiento de técnicas que permiten el marcaje de genes endógenos para producir proteínas de fusión fluorescentes. Estos métodos permiten a los investigadores visualizar el comportamiento de las proteínas en tiempo real, proporcionando información valiosa sobre sus funciones e interacciones dentro del entorno celular. Muchos estudios actuales de etiquetado genético emplean un proceso de dos pasos en el que los marcadores visibles, como los cambios en el color de los ojos, se utilizan para identificar organismos modificados genéticamente en el primer paso, y el marcador visible se extirpa en el segundo paso. Aquí, presentamos un protocolo de un solo paso para realizar un etiquetado genético endógeno preciso y rápido en Drosophila melanogaster, que permite la detección de líneas diseñadas sin el marcador ocular visible, lo que ofrece una ventaja significativa sobre los métodos anteriores. Para detectar eventos exitosos de marcaje de genes, empleamos una técnica basada en PCR para genotipar moscas individuales mediante el análisis de un pequeño segmento de su pata media. Las moscas que superan los criterios de selección se utilizan para producir poblaciones estables. Aquí, detallamos el diseño y la construcción de plásmidos de edición CRISPR y los métodos para el cribado y la confirmación de líneas de ingeniería. En conjunto, este protocolo mejora significativamente la eficiencia del marcaje de genes endógenos en Drosophila y permite estudios de procesos celulares in vivo.

En nuestros experimentos, normalmente encontramos una tasa de éxito de ~20%-30% en la detección de varios genes endógenos marcados en todos los cromosomas (X, II, III). La eficiencia de este proceso puede variar en función de varios factores, como la selección del ARNg, la naturaleza del gen y la calidad de la inyección. Aquí, ilustramos los resultados de nuestra estrategia para marcar el gen del período endógeno con el fluoróforo mNeonGreen13. El gen de la menstruación , situado en el cromosoma X de D. melanogaster, desempeña un papel fundamental en el reloj circadiano. Drosophila tiene una red de reloj bien caracterizada que consta de aproximadamente 150 neuronas reloj que expresan proteínas reloj17.
Marcamos la proteína Period con la proteína verde fluorescente mNeonGreen en su extremo C-terminal, conectada por un enlazador de doble glicina13. Después de la inyección del plásmido, cruzamos las moscas G0 con el equilibrador FM7/L y posteriormente cosechamos la generación F1. De las 126 moscas F1 tamizadas con cebadores especializados en PCR (Tabla 1), se identificaron 47 casos positivos, con una tasa de éxito del 37,3%. De estos, seleccionamos 5 individuos F1 para establecer cruzamientos adicionales para producir poblaciones estables. El sexo no afectó la tasa de resultados positivos durante este cribado. Después de verificar la precisión de la secuencia del gen marcado, ejecutamos pruebas de control, incluyendo evaluaciones de comportamiento y evaluaciones de qPCR para asegurar las oscilaciones del ARNm para confirmar la funcionalidad de la proteína marcada (PERIOD-mNeonGreen)13.
Para realizar experimentos de imágenes en vivo, cruzamos estas moscas PERIOD-mNeonGreen con Clock856-GAL4; UAS-CD4-tdEl tomate vuela , donde Clock856-GAL4 marca todas las neuronas reloj19 y CD4 es una proteína transmembrana que marca las membranas celulares. Para los experimentos de imágenes en vivo, diseccionamos 3-4 cerebros adultos utilizando el medio Drosophila de Schneider helado. Los cerebros fueron montados y fotografiados con un microscopio confocal Airyscan. La Figura 4 muestra las imágenes representativas que muestran la proteína PERIOD dentro de las neuronas reloj en los cerebros de Drosophila .
<img alt="Diagrama de flujo de clonación de plásmidos de sgRNA y donante, que detalla la inyección de embriones CRISPR y la detección genética." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64729/64729fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Esquema del protocolo de edición genética basado en CRISPR/Cas9. El protocolo describe una serie de pasos para diseñar y ensamblar plásmidos de sgRNA y donantes, seguidos de la detección a través del método de PCR de una sola pierna y la producción de líneas de ingeniería estables. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64729/64729fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Diagrama de edición de genes CRISPR-Cas9; muestra sgRNA, Cas9, reparación de ADN, reparación dirigida por homología." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64729/64729fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Esquema de la edición del genoma CRISPR/Cas9 para generar moscas de periodo-mNeonGreen. (A) Esquema que ilustra la adición de una etiqueta de proteína fluorescente al C-terminal de un gen endógeno. (B) El gen del período endógeno (per) está marcado con mNeonGreen, una proteína fluorescente verde monomérica brillante en el extremo carboxilo. Dos sgRNAs se encuentran en el último exón y en el 3'UTR, respectivamente. El vector donante contiene dos secuencias de homología de ~1 kb que flanquean la etiqueta mNeonGreen. El codón de parada se agrega al final de la etiqueta para una terminación de traducción adecuada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64729/64729fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Proceso de cribado de moscas: cruzamientos genéticos y método de PCR, diagrama, extracción de ADN genómico, electroforesis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64729/64729fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Estrategia de cribado de moscas CRISPR positivas. (A) Enfoque para establecer cruces genéticos de preselección de genes destinados al etiquetado CRISPR en los cromosomas X y II. G0 denota las moscas inyectadas inicialmente, mientras que F1 representa su descendencia de primera generación que requiere detección. (B) Se describe el método de detección de PCR de una sola pierna y la duración de cada paso del procedimiento. (C) Aquí se muestra una imagen del Fly Hotel. Los tubos de vidrio se llenan con comida para moscas y se sellan en un extremo. Las moscas individuales se cargan en tubos individuales. Después de analizar el ADN extraído de la parte media de las moscas individuales, se toman las moscas apropiadas del hotel de moscas y se establecen las líneas estables. (D) Enfoque para establecer cruces de moscas posteriores a la selección (que se muestran aquí en azul) que pasaron la prueba de detección. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64729/64729fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Imagen de microscopía de fluorescencia celular; ZT0-ZT2; localización de proteínas; Comparación de procesos celulares." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64729/64729fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: Imágenes representativas de la proteína PERIOD-mNeonGreen en neuronas reloj. Imágenes representativas de las moscas de tomate de periodo-mNeonGreen, Clock-GAL4, UAS-CD4-tdTomato arrastradas a ciclos de luz-oscuridad. ZT se refiere al tiempo de Zeitgeber y ZT0 se refiere al tiempo de luces encendidas y ZT12 se refiere al tiempo de luces apagadas. La envoltura nuclear de la neurona reloj está etiquetada con tdTomato, que se muestra aquí en rojo, y la proteína PERIOD está etiquetada con mNeonGreen y se muestra en verde. La proteína PERIOD se organiza en focos nucleares discretos a lo largo de los puntos de tiempo nocturnos y matutinos. Barras de escala, 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64729/64729fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nombre</td>
			<td>Secuencia de ADN (5' a 3')</td>
		</tr><tr><td>Imprimación de cribado menstrual hacia adelante</td>
			<td>ATACTCGTCCATAGACCACG</td>
		</tr><tr><td>Imprimación de cribado menstrual inversa</td>
			<td>ACATTATCCTCGGCTTGCAT</td>
		</tr><tr><td>por gRNA1-sentido</td>
			<td>cttcACCAGACACAGCACGGGGAT</td>
		</tr><tr><td>antisentido por ARNg1</td>
			<td>aaacATCCCCGTGCTGTGTGTGTGTT</td>
		</tr><tr><td>por el sentido de ARNg2</td>
			<td>cttcGTCAGCAGCAACTGCGGGTG</td>
		</tr><tr><td>antisentido por ARNg2</td>
			<td>aaacCACCCGCAGTTGCTGCTGAC</td>
		</tr><tr><td>brazos de homología de período e inserto mNeonGreen</td>
			<td>GAATTCCAAGCTGCTCATCCTGCCCATTGTCAGCAA GGGCGACCTGACCATTCGGTTGAACGATGTGCACA CAAAGGTTTGGATTACCGCCGAGCCAGTGAAGCGC TCCGATGGCCACACCTATCTCAACATCACCGACTAC AAGACGGCCACCAAGATCAAGGGgtgagcatggcctgcat gtctagccaactgaatggtgacctcaaacctcttctcgtagTGGCCACT TTGACCTGTCGAATCTGTTCAACGAACAAGGAGC GCGCGACAGCACGCTGAAGGTGCTGAACCAGGAGT GGAGCACCCTGGCCCTCGATGTCCAGCCGAAGATC AACGAGGCCTGCGCCAAGGCCTTCAGTGCCATCGT ACAGAGTCTGTGGGCCAACATTCCCTACGACGAGTT CTTCGAAAAGGAATGAACGCATATGTATCTAACAAAGT CCGGTCTAACTAGCCACTCTAGCTAATTACTGATTAAA CTACCTAATTGCAGCTAAATCCAATCCATCTCTTCGATTAA AACAACTACAAGTTGGCGTTGGCTTTTCGATAT TTATTGTACAATAAATAACTAAAAAAGATTCGGATATATA AACCTTAGGGCTGAGAAGGGTGGTTCGATGTTCGAAC CCTCTCTAGTTTTCAATTCACTTAATATTCTGATTAAACAT AGGATAGATATCATCTAAAAGCTTTGCTTGGCTTGAGAT CTACATTATCCTCGGCTTGCATGGGTTCTGGGCATCCTT CCACGTCAGTTCGTCTGATGCTTTCGTTACTTGTTCGGA TACTGAATGGTGACATCCCACGGAAGCGTTCGCGTTGAT TCGAAGAActtgaagggaatggaagggagttaggaataggaactggtgg gactggctggtactcggtgcccagaccggaggcaattgctcacTCGTTTCCA GGACCCTGCTGCTCCTCGGTGTCTGCTGCTCGGATCATC CCAGGGATCGACATTGTGCACTCGGTTGTGTACGTCGGT CAGCAGCAACTGCGGGTGTCATTACTTGTACAGTTCGT CCATACCCATGACATCGGTGAAAGCTTTTTGCCATTCTT TGAAATTCAGCTCTGTTTTCGAGTGCTTCAGTTCGGTTT TTCGAAAGACATACATCGGTTGGTTCTTGAGATAGTTAG CCGCCATCGGCTTGGCAAAAGTGTACGTTGTTCGCGCT GTGGAGCGATACCTTTTTCCATTTCCTGTTGTATAGGAC CATTTGAAAGTGGAAATAATAGTCTTATCATTGGGGTAG GTCTTTTTGCTGCGGCACCAGTCAGCGGCAGTGAGC GAATTTGTCATAACTGGGCCATCAGCGGGGAAACCCG TTCCCTTGACTTGGGCTTCGCCTTTAATATGGCTACCT TCGTAAGTGTGATAGTTCACCGTGAGCGAGGCTC CGTCTTCAAATTGCATTGTTCGATGCACCTGGTAGCCC GAGCCATCTACCATCGGCGGAAGGGCGACATGC CATCTGGATACGGCAAATACTGATGGAATCCGTAACCG ATGTGTGGAACCAGGATCCAAGGGGAAAATTGGAGAT CGCCTTTAGTCGATTTCAGATTGAGCTCTTCGTAGCC GTCGTTGGGGTTTCCCGTACCCTCCGACCATATC GAAGTCGACTCCATTGATCGAACCAAAGATATGCAG CTCGTGTGTAGCCGGCAACGAAGCCATATTATCTTC TTCACCCTTCGACACACCTCCGCCGTCGCCGTGCT GTGTCTGGTCCTCCTCCGGGTGCTCCATGATCTTGC TCTCAGATGTGCTCATGCTctgcaaaagaacggaaatggatta cattgaatcgcatcgtggactgaactgtacgtacCTTCAGCTTTCGG TGCTTGGGGTCCTTTTCGGTGTCCGGCGGACTCTC CGATCCGTCCGTGGTCTTGATGAAGGACGAGTAGA AGGAGGAGAAGCTGGAGCCATCCATGTCGTCGCTA TTCCCATTGCTGTCCGTGTATTTctgtggatgagaccatgttc ttcataatgaccaatcaccaatggacctcattcgtatagcatacCTTGTT GTTGGCGGGATTGCTGCTGCTGCAGGGCGGGTCG GAGTTGTAGTCGCCCATCACGGAGGGAATGGGCGA GGAGTCCGGCACCTCCTTCTTGCAGGGATCGGATA CCGCTGCACTGGAGCCCGGCTCCGTCTTGACGGA TGCGCTCTGCGAGGAGGAGGGACGCTGCACCTGGGC AGGAGTGGTGACCGAGTGGAATGCACCCGGCACC TTCTTCGTCATGGACGCCGGCGTGGTctatggacgagta tggagttggagttggagttaagacagttcggtgaggcaccaccccccactg acttacCGTGTACACCGACTTGTTGTACGCGGATTGGG AGCCCAACGGACGTTCGGGAATCTGGAGAGCGTTG GCCATTCCCGGAAAGGGCATCGGCTGGTACATCAT GGCCGTGGCCGCCGCCGCCGCCGGGTGTGTGTTAG AAAAGCGAAGGATGCGGGTACATCACGCCGGCCAT GTACTGCAGCGGCATGGCCTGGGCGGCCGCGGCA GCCGCCTGCTGGGGGGGGGGGCATGTCCGTGC CACCCTTGTGCGGATGCTTGCATCCGGGGAGAG CGCGTGGGACTGGTGGGGCGTCAAGGAGGCGGGGA TGTAGTAGAAGGTCGGGAAGAGGCCGGCGGAGGA GAAGCTGCTCTGGGCCATGGCCGTGCGTGGGGAG TGAACGGGCGGTGTGATGCCCACCGAGAACGGTG GCCAGAGGTTTATGTTCTAGA</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Lista de secuencias de sgRNA para marcar el gen Period endógeno en el terminal C y cebadores utilizados para realizar el cribado de PCR de una sola pierna.

Aquí, presentamos un protocolo simplificado de etiquetado de genes endógenos para Drosophila, que utiliza una técnica basada en PCR para la identificación sin marcadores de modificaciones genéticas exitosas, lo que facilita el desarrollo de líneas knock-in estables.

Estrategia basada en CRISPR de un solo paso para el etiquetado de genes endógenos en Drosophila melanogaster

The study of protein subcellular localization, dynamics, and regulation in live cells has been profoundly transformed by the advent of techniques that ...

El propósito de este protocolo es generar una línea de mosca editada endógena. Mostramos como ejemplo un knock-in de proteína fluorescente, pero también podría aplicarse a otros knock-in, knock-out, así como a la generación de mutaciones. Nuestro protocolo es un método basado en la recombinación homóloga de CRISPR, por lo que casi no hay restricciones en los sitios de mutación.Además, nuestro protocolo redujo en gran medida el tiempo y el esfuerzo involucrados en los pasos de genotipado. Para empezar, abra el sitio web de fly CRISPR para diseñar sgRNAs para Drosophila, e introduzca aproximadamente 100 secuencias de pares de bases que rodeen la ubicación deseada del knock-in. Seleccione objetivos CRISPR con la opción de guanina de cinco primos.Haga clic en el botón Buscar objetivos CRISPR para generar una lista de posibles secuencias de sgRNA. A continuación, haga clic en el botón de evaluación de cada secuencia y elija dos sgRNAs que tengan cero objetivos externos. Dado que los niveles de expresión natural de proteínas suelen ser mucho más bajos, seleccione etiquetas fluorescentes que sean brillantes y fotoestables, y que se ajusten a la configuración experimental.A continuación, diseñe un enlazador para vincular las etiquetas de epítopos al marcador fluorescente para el análisis bioquímico. Utilice un péptido enlazador que oscile entre dos y 20 aminoácidos, que comprenda aminoácidos como la glicina y la serina. Para diseñar el vector donante de Drosophila, organice la secuencia de ADN del péptido enlazador y la etiqueta fluorescente, y asegure secuencias homólogas que flanqueen ambos extremos.Modifique cualquier secuencia de PAM dentro del plásmido donante para mantener la secuencia de aminoácidos de las proteínas resultante. A continuación, coloque los codones de inicio y parada en función de la ubicación de la etiqueta. Para el marcaje interno, asegúrese de que la etiqueta fluorescente esté en el marco con la secuencia codificante del gen diana.Para el marcaje N-terminal, coloque la etiqueta fluorescente después del codón de inicio endógeno. Para el marcado C-terminal, coloque la etiqueta fluorescente antes del codón de parada natural. Asegúrese de conservar un solo codón de inicio para evitar posibles problemas de traducción.Utilice el enfoque alternativo de clonación basado en enzimas de restricción para insertar la secuencia de sgRNA en el plásmido U6 Bbs1-chiRNA. Después de crear el plásmido sgRNA, transforme el plásmido en DH5-Alpha Escherichia coli según las instrucciones del fabricante. Verifique los clones resultantes a través de la secuenciación Sanger, utilizando cebadores de secuenciación estándar T3 o T7.Para crear el plásmido donante, utilice ADN bicatenario con la secuencia deseada e intégrelo en el sitio de clonación múltiple negativo del plásmido Bluesript 2SK. Secuenciar el plásmido donante para asegurarse de que las secuencias de sgRNA o PAM se modifiquen correctamente y que no haya SNP presentes en el plásmido. A continuación, tome moscas Cas9 inyectadas con el ARNg construido y plásmidos donantes.Anestesiar las moscas con dióxido de carbono y separar las moscas macho de las hembras vírgenes. Para establecer cruces de moscas, empareje cada macho G zero con al menos dos hembras vírgenes FM7L en viales individuales estrechos de alimento CT. Coloque los viales cruzados en una incubadora ventilada mantenida a 25 grados centígrados y 60% de humedad hasta que las moscas F1 se cierren.A continuación, anestesia y recoge al menos 10 crías femeninas vírgenes de cruces de machos y hembras G zero. Asegúrese de que cada mosca F1 esté etiquetada con los detalles de su parentesco y almacenada por separado. Para detectar la PCR en las moscas, diseñe cebadores con una temperatura de fusión de alrededor de 55 grados centígrados que abarquen el sitio de edición del gen diana.Prepare un tampón de lisis para cada muestra de mosca y dispense 10 microlitros en cada pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos. Mantenga el tampón a una temperatura fría durante el proceso de disección de la pierna. A continuación, prepare tubos capilares de vidrio, llenando un extremo con comida de agar sacarosa.Coloque estos tubos en una placa de pocillos de 96 pocillos de profundidad, conocida como el hotel de moscas. Para la disección de las piernas, coloque la almohadilla de anestesia de dióxido de carbono bajo un microscopio estereoscópico. Anestesiar una mosca candidata y cortarle una de sus patas medias.Después de eso, sumerja la pierna en el tampón de lisis. Sostén el ala de la mosca con un par de pinzas de metal fino. Mueva la mosca al hotel de mosca y selle el tubo con hilo inmediatamente.Aloje el hotel de moscas en una incubadora ventilada mantenida a 25 grados centígrados y 60% de humedad. Sumerja las patas cortadas en la solución tampón de lisis en un termociclador. Organice la reacción de PCR según las instrucciones del fabricante, utilizando 1,5 microlitros del lisado de patas de mosca como fuente de ADN.Someter los productos de PCR a electroforesis en gel de agarosa e interpretar los resultados en función del tamaño de la banda. En función de los resultados del gel, seleccione las moscas positivas del hotel de moscas y crúcelas individualmente con moscas de equilibrio para producir la generación F2. Utilice material homocigótico para la secuenciación Sanger del sitio de edición para garantizar la precisión.Cruza las líneas de mosca validadas con moscas de tipo salvaje para eliminar las mutaciones de fondo. Realice pruebas de detección en cada generación mediante el protocolo de PCR de una sola pierna. Las imágenes de microscopio confocal de cerebros adultos de Drosophila mostraron proteínas del período organizadas en focos nucleares discretos a lo largo de la noche y las primeras horas de la mañana.En general, este protocolo es sólido si sus cebadores de PCR de genotipado son específicos.

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Investigación

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