Cristalización de proteínas de alto rendimiento mediante microdiálisis

La cristalización por diálisis es un método infrautilizado. Este protocolo presenta un enfoque Novo para esto, lo que aumentará la gama de estrategias de cristalización actualmente disponibles para la determinación estructurada. Las principales ventajas de esta técnica son que es de alto rendimiento, fácil de configurar sin necesidad de equipos especializados, y permite un fácil monitoreo del crecimiento de cristales.

La persona que realiza esta técnica debe sentirse cómoda con el pipeteo de bajo volumen y el uso de pipetas multicanal. Las gotas deben pipetearse lo más suficiente posible para evitar la deshidratación parcial. Para configurar el experimento de microdiálisis, coloque una placa de microdiálisis de 96 pocillos disponible comercialmente en la orientación del lado de la proteína hacia arriba y retire la cinta adhesiva de la cubierta despegando el espaciador adhesivo de presión de 200 micras.

Después de despegar la cinta adhesiva de la cubierta, observe la posición del pozo A1. A continuación, utilizando una pipeta multicanal, cargue un máximo de 3,2 microlitros de muestra de proteína preparada adecuadamente en cada pocillo. Coloque correctamente la película de cubierta UV de 200 micras sobre la placa de 96 pocillos con la película hacia arriba. Luego, para activar y sellar el adhesivo de presión, presione la película de cubierta UV con una paleta de sellado y verifique su integridad.

Ahora, invierta la placa para llevarla a la orientación del lado del búfer hacia arriba y tome nota de la posición espejada del pozo marcado A1. Usando una pipeta multicanal, cargue un máximo de 350 microlitros de la solución de diálisis en cada pocillo de la placa y selle cuidadosamente los pocillos con la película de cubierta del depósito. Luego, coloque la placa en la orientación del lado del amortiguador hacia arriba dentro de una incubadora adecuada con temperatura controlada a 20 grados centígrados para permitir el crecimiento de cristales. Para examinar la formación de cristales bajo el microscopio, retire la película protectora de la película de cubierta UV de 200 micras y coloque la placa debajo del ocular con el lado de la proteína hacia arriba.

Para establecer un experimento de cristalización a gran escala, adopte las condiciones en las que se produjo el crecimiento de microcristales en la placa de microdiálisis y replique las mismas condiciones en recipientes grandes. Seleccione el tamaño del envase en función del volumen de la solución de diálisis. Pipetear un volumen máximo de 500 microlitros de muestra de proteína en el tubo del dializador antes de sellar el tubo con la tapa de plástico roja.

Coloque el tubo sellado del dializador de 500 microlitros en la rejilla flotante dentro del recipiente lleno de solución de diálisis. A continuación, coloque el recipiente sin perturbaciones dentro de una incubadora adecuada con temperatura controlada a 20 grados centígrados para lograr el crecimiento de cristales. Para comprobar la formación de cristales, pipetear uno o dos microlitros de la solución del dializador a un portaobjetos de cubierta de vidrio.

Cubra la solución en el portaobjetos con otro portaobjetos de vidrio y véalo bajo un microscopio. Las imágenes capturadas con un microscopio estereoscópico de gran aumento mostraron la formación exitosa de microcristales de cuatro proteínas utilizando las placas de microdiálisis con membranas de corte de peso molecular de 10 kilodalton. Se encontró que la lisozima forma cristales cuando se dializa contra 0,1 molar acetato de sodio a pH 4 que contiene aditivos apropiados.

Domatin formó cristales cuando se dializó contra 0,1 molares de propano bis-tris a pH 6,6 que contenía aditivos apropiados. Las condiciones de diálisis optimizadas condujeron a la formación de microcristales por las proteínas de membrana, a saber, la proteína AcrB de la bomba de eflujo multifármaco E. coli y el transportador de lactosa E. coli LacY. La cristalización a gran escala en los tubos dializadores empleando las condiciones de diálisis optimizadas obtenidas de los experimentos de microdiálisis condujo a la formación de miles de microcristales para cada una de las proteínas.

Para la cristalización de la fomitina, se dializaron 250 microlitros de proteína contra 50 mililitros de la solución de diálisis. Para AcrB, 250 microlitros de la proteína se dializaron contra 25 microlitros de solución de diálisis. La cristalización de LacY también se estableció en la misma proporción, con 100 microlitros de proteína por 10 mililitros de solución de diálisis.

Al invertir la placa hacia el lado del amortiguador hacia arriba, es importante tener en cuenta la posición de A1, de modo que las soluciones de la pantalla de cristalización se puedan dispensar en consecuencia. Los cristales obtenidos de este método se pueden utilizar para aplicaciones posteriores, como cristalografía en serie y micro ED.