Name: In vitro Investigación de los efectos de la matriz extracelular rica en hialuronanos en la migración de células de cresta neural (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Aprende a evaluar la migración y adhesión de células de cresta neural en matrices ricas en ácido hialurónico mediante ensayos in vitro. Este método permite analizar poblaciones celulares e individuos para estudios de biología del desarrollo.

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Expreso un gran agradecimiento a Fumitoshi Irie y Yu Yamaguchi por su aliento y amables sugerencias para establecer este método. Este trabajo fue apoyado por subvenciones para programas de investigación científica de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (#19KK0232 a T.I., #20H03896 a T.I.). El método original para el recubrimiento de HA sobre sustratos de vidrio y ensayos de degradación de HA in situ en los sustratos se describió en Yamamoto et al. (2017)8, mientras que el método para la preparación de sustratos mixtos de HA/Col1 se describió en Irie et al. (2021)7.

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Facultad de Odontología de la Universidad de Osaka.
1. Cultivo de células de la cresta neural craneal de ratón
NOTA: La línea celular de la cresta neural utilizada en este estudio comprende células O9-1, originalmente derivadas de Wnt1-Cre; Células que expresan R26R-GFP aisladas de embriones de ratón E8.512 (ver discusión). El método descrito aquí para el cultivo de células O9-1 sigue un protocolo previamente establecido13.
<ol><li>Prepare la placa recubierta de matriz de la membrana basal.<ol><li>Descongele la matriz de la membrana basal (ver Tabla de materiales) en hielo. Diluir la matriz 1:50 en 1x PBS refrigerado y mantener en hielo.</li>
		<li>Cubra una placa de cultivo de 10 cm con 10 ml de la solución de matriz de membrana basal diluida. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 1 h y aspirar la matriz antes de usarla.</li>
		<li>Lave el plato 3 veces con 2 ml de PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultive células O9-1 en la placa recubierta de matriz de la membrana basal.<ol><li>Calentar el medio de células madre embrionarias (ES) completo (ver Tabla de materiales) en un baño maría a 37 °C.</li>
		<li>Mezcle suavemente la suspensión de celdas O9-1 (consulte la Tabla de materiales) y cuente el número de celdas con un contador de celdas automatizado (consulte la Tabla de materiales). Ajustar la concentración celular a 1,1 × 106/ml con un medio de células madre embrionarias completo.</li>
		<li>Agregue 8 ml de medio celular CE completo precalentado a la placa de cultivo de 10 cm recubierta de matriz y siembre las células O9-1 a 1.1 x 106 células/placa. Incubar a 37 °C en una incubadora humidificada deCO2 al 5%.</li>
		<li>Al día siguiente, sustituya el medio por un medio de células madre embrionarias completo fresco (precalentado a 37 °C). Reemplace con medio fresco cada 2-3 días a partir de entonces. NOTA: Cuando las células son aproximadamente 80% confluentes (3-4 días después de la placa), pueden disociarse con tripsina-EDTA al 0,25% y pasar más lejos o congelarse para su uso posterior. En la Figura 1 se muestran imágenes representativas de las células O9-1.</li>
		<li>Lave la placa de cultivo con 2 ml de 1x PBS antes de la tripsinización. Añadir 2 ml de tripsina-EDTA al 0,25% precalentada e incubar durante 5 min a 37 °C. Verifique el desprendimiento completo de células; Golpee suavemente el costado del plato un par de veces si es necesario.</li>
		<li>Agregue 2 ml de medio celular madre embrionaria completo precalentado a la placa de cultivo y transfiera las células disociadas a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar el tubo a 300 x g durante 5 min.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante sin alterar la bolita celular. Luego, agregue 2 ml de medio celular ES completo precalentado al tubo y resuspenda completamente las células mediante pipeteo. Sembrar las células en una nueva placa de cultivo con la densidad celular deseada.</li>
		<li>Alternativamente, prepare un stock de células congeladas agregando 1 ml de medio de congelación celular que contenga 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) al tubo en lugar de un medio celular ES completo y resuspendiendo completamente las células. Transfiera la suspensión celular a tubos criogénicos y guárdela a -80 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparación del plato recubierto de HA/Col1
NOTA: El método original de recubrimiento de HA/Col1 sobre platos con fondo de vidrio fue propuesto por Irie et al.7.
<ol><li>Agregue cuidadosamente 50 μL de trietoxisilano sin diluir a un plato con fondo de vidrio de 3,5 cm (consulte la Tabla de materiales). Incubar durante 5 min a temperatura ambiente (RT) y proteger de la luz. NOTA: La incubación con trietoxisilano no debe exceder los 5 min. Esto puede afectar la eficiencia del recubrimiento y producir productos indeseables.</li>
	<li>Lave el plato rápidamente 3 veces con 2 ml de agua destilada. Añadir 50 μL de glutaraldehído al 0,25%, diluido 100x en PBS, por plato, e incubar a RT durante 30 min.</li>
	<li>Lavar rápidamente 4 veces con 2 ml de PBS. Luego, cubra los platos con 300 μL de colágeno tipo I en ácido acético 0.2 N a RT durante 1 h.</li>
	<li>Lavar rápidamente 3 veces con 2 ml de PBS. Agregue 300 μL de hialuronato-H2 sódico marcado con fluorescemina (FAHA-H2) marcado con fluorescemina (diluido en PBS) a cada plato e incube durante la noche en RT. Lave nuevamente 3 veces con 2 ml de PBS. Después de aspirar el PBS, seque al aire la placa durante 5 minutos en un banco limpio. NOTA: FAHA-H2 es un hialuronato de sodio marcado con fluoresceinamina con un peso molecular promedio que oscila entre 1.200 y 1.600 KDa. Se puede utilizar HA de un peso molecular apropiado de acuerdo con el diseño de la investigación.</li>
</ol>3. Ensayo de migración en el plato recubierto de HA/Col1
NOTA: Se realizó un ensayo basado en el cierre de heridas utilizando huecos definidos de 500 μm libres de células en sustratos de Col1/HA utilizando insertos de cultivo de 2 pocillos (ver Tabla de materiales). Las células O9-1 expresan Tmem2, que es necesario para la adhesión y degradación de HA en el espacio extracelular9 (Figura 2 y Figura 3).
<ol><li>Después de secar el plato con fondo de vidrio recubierto, adhiera los insertos de cultivo de 2 pocillos a los platos y llene los insertos externamente con 1 ml de PBS.</li>
	<li>Sembrar las células O9-1 en los pocillos a 1 x 104 células en 100 μL del medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco que contiene 2% de suero fetal bovino (FBS) por inserto. Cultivar las células durante 2 días a 37 °C en una incubadora humidificada deCO2 al 5%.</li>
	<li>Retire las inserciones con cuidado de los platos recubiertos con fondo de vidrio con pinzas. Lave los platos recubiertos con fondo de vidrio suavemente con 2 ml de 1x PBS para eliminar las células y los desechos celulares. Agregue 2 ml de DMEM fresco que contenga 2% de FBS en los platos de cultivo.</li>
	<li>Capture imágenes de contraste de fase ahora como punto de inicio utilizando un microscopio de fluorescencia todo en uno en modo monocromo con ajustes de alta resolución (ganancia a 6 dB, sin agrupación). En este estudio se utilizaron lentes objetivas con aumentos de 4x a 20x para obtener imágenes (ver Tabla de materiales). NOTA: Capture las imágenes de contraste de fase con las barras de escala correspondientes y guárdelas en formato TIFF.</li>
	<li>Cultivar las células durante 48 h adicionales a 37 °C y 5% deCO2. Capture imágenes de contraste de fase a las 24 h y 48 h en cultivo utilizando el microscopio de fluorescencia todo en uno.</li>
	<li>Fijar las células a las 48 h con 1 ml de paraformaldehído al 4% (PFA) durante 15 min a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C. Luego, lave los platos 3 veces durante 5 minutos cada uno con 1 ml de PBS fresco.</li>
	<li>Coloque un cubreobjetos con medio de montaje (ver Tabla de materiales) para una observación morfológica adicional. NOTA: Los platos pueden ser fotografiados inmediatamente o almacenados hasta 2 meses a 4 °C.</li>
	<li>Opcional: Inmunomarcar las células en busca de proteínas de interés. NOTA: Aquí se describe como ejemplo un protocolo para detectar el complejo de adhesión focal (FA) utilizando un anticuerpo monoclonal antivinculina derivado del ratón (consulte la Tabla de materiales).<ol><li>Incubar los platos (a partir del paso 3.6) con 0,5 ml de tampón de bloqueo (5% de suero normal de cabra en PBS) durante 60 min. NOTA: Elija un tampón de bloqueo apropiado para el anticuerpo primario. Un tampón de bloqueo típico sería un 5% de suero normal de la misma especie que el anticuerpo secundario utilizado.</li>
		<li>Preparar el anticuerpo primario diluido en tampón de dilución de anticuerpos (suero de cabra normal al 1% en PBS). Incubar los platos con 0,5 ml de anticuerpo primario diluido durante la noche a 4 °C. NOTA: Elija el tampón de dilución de anticuerpos adecuado. Por lo general, el anticuerpo se usa en una dilución 1:50-1:200.</li>
		<li>Enjuague 3 veces durante 5 minutos cada una con 2 ml de PBS. Prepare el anticuerpo secundario anti-ratón derivado de cabra diluido en el tampón de dilución de anticuerpos (suero de cabra normal al 1% en PBS). Incubar los platos con 0,5 ml de anticuerpo secundario diluido durante 1-3 h a temperatura ambiente. NOTA: Normalmente, el anticuerpo secundario se utiliza en una dilución 1:500-1:1.000. DAPI se puede utilizar para teñir los núcleos.</li>
		<li>Enjuague 3 veces con 2 ml de PBS durante 5 minutos cada vez. Coloque el cubreobjetos con 50 μL de medio de montaje. NOTA: Las antenas se pueden visualizar utilizando el microscopio de fluorescencia todo en uno con un filtro GFP (excitación: 470/40, emisión: 525/50) y un filtro TexasRed (excitación: 560/40, emisión: 630/75) en modo monocromo con ajustes de alta resolución (ganancia a 6 dB, sin agrupación). En este estudio se utilizaron lentes objetivas con aumentos de 4x a 20x para la obtención de imágenes. NOTA: El portaobjetos puede almacenarse hasta 2 meses a 4 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Análisis de datos
<ol><li>Abra el software ImageJ 1.51s. En la ventana ImageJ, seleccione Archivo > Abrir en la barra de menús para abrir el archivo de imagen guardado.</li>
	<li>Para ajustar la escala de medición, dibuje una línea de la misma distancia que la barra de escala. Vaya a Analizar > Definir escala y escriba la distancia y las unidades conocidas de la línea en los cuadros correspondientes de la ventana Definir escala .</li>
	<li>Dibuje una línea recta entre el espacio de celda y presione Analizar > Medir para transferir los valores a una ventana de datos. Mida al menos cinco posiciones diferentes en cada muestra y promedie las distancias para obtener los datos representativos de la muestra. Realice los análisis estadísticos utilizando el software apropiado (ver Tabla de materiales).</li>
</ol>

<ol><li>Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+and+switches+in+mammalian+neural+crest+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326(2013).</li>
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</ol>

El autor declara que no existen intereses contrapuestos.

Varios componentes de ECM regulan la emigración/migración de NCC. Por ejemplo, la HA regula positivamente la migración de NCC 2,15. Curiosamente, un estudio basado en modelos genéticos de ratón de Tmem2, una hialuronidasa de superficie celular, elucidó el requisito de degradación de HA en la migración de NCC9. Los colágenos también son abundantes en la ECM que rodea el tubo neural16. Se ha demostrado que la decorina...

Las células de la cresta neural (NCC) son una población celular multipotente que está presente en los embriones en desarrollo, y se originan en el borde de la placa neural durante la neurulación. Contribuyen a la formación de una variedad de tejidos, incluyendo el sistema nervioso periférico, el sistema cardiovascular, los tejidos craneofaciales y el esqueleto1. Después de la inducción y la especificación de NCC en el borde de la placa neural, los NCC emigran del neuroepitelio y migran hacia los sitios de tejido derivados de NCC1.
El hialuronano (HA) es un glicosaminoglicano no sulfatado que se distribuye en una variedad de tejidos como un componente de la matriz extracelular (ECM). La importancia de HA en el desarrollo embrionario se ha demostrado en sistemas modelo a través de la ablación de genes responsables del metabolismo de los hialuronanos. Por ejemplo, se encontró que las mutaciones en los genes de la hialuronano sintasa (Has1 y Has2) en Xenopus conducen a defectos de migración NCC y malformación craneofacial2. Además, se ha informado que los proteoglicanos de unión a HA, agrecano y versicano, ejercen efectos inhibitorios sobre la migración de NCC3. En ratones, la ablación de Has2 conduce a defectos graves en la formación del cojín endocárdico, lo que resulta en la letalidad a mediados de la gestación (E9.5-10) 4,5,6.
Se ha demostrado recientemente que la proteína transmembrana 2 (Tmem2), una hialuronidasa de superficie celular, desempeña un papel crítico en la promoción de la adhesión y migración de células cancerosas mediada por integrina mediante la eliminación de HA asociada a la matriz en los sitios de adhesión 7,8. Más recientemente, Inubushi et al.9 demostraron que una deficiencia en Tmem2 conduce a defectos craneofaciales graves debido a anomalías en la emigración/migración y supervivencia de NCC. En el estudio anterior9, la expresión de Tmem2 se analizó durante la formación y migración de NCC. La expresión de Tmem2 se observó en el sitio de la delaminación de NCC y en la emigración de NCC positivos para Sox9 (Figura 1). Además, utilizando células de la cresta neural O9-1 de ratón sin Tmem2, el estudio demostró que la expresión in vitro de Tmem2 era esencial para que las células O9-1 formaran adherencias focales y para su migración a sustratos que contienen HA (Figura 2 y Figura 3)9.
Estos resultados indican fuertemente que Tmem2 también es importante para la adhesión y migración de NCC a través de la ECM rica en HA. Sin embargo, el mecanismo molecular de adhesión y migración de NCC dentro de la ECM rica en HA aún no está claro. Por lo tanto, es necesario establecer un sistema experimental de cultivo in vitro para explorar completamente la adhesión y migración de NCC dentro de la ECM rica en HA.
De los numerosos enfoques empleados en la prueba de la migración celular, el ensayo basado en el cierre de heridas celulares es un método simple utilizado con frecuencia en los campos de la fisiología y la oncología10. Este enfoque es útil debido a su relevancia para el fenotipo in vivo y es eficaz para determinar el papel de fármacos y quimioatrayentes durante la migración celular11. Es posible evaluar la capacidad de migración tanto de masas celulares enteras como de células individuales midiendo las distancias de brecha celular a lo largo del tiempo11. En este manuscrito, se introduce un ensayo modificado in vitro basado en el cierre de heridas para modelar la migración de NCC en tejidos ricos en HA que rodean el tubo neural. Este procedimiento también es aplicable para estudiar diferentes componentes de ECM (es decir, colágenos, fibronectina y laminina) para analizar el papel del andamio de ECM en la migración de NCC.

<table><tbody><tr><td>plato de cultivo celular de 10 cm</td><td>CORNING</td><td>Cat. 353003</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Millipore</td><td>Cat. No. BSS-1005-B</td><td></td></tr><tr><td>Insertos de cultivo de 2 pocillos</td><td>ibidi</td><td>Cat. Nº 80209</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555 con etiqueta de cabra anti-ratón IgG</td><td>Invitrogen</td><td>Cat. A21422</td> Contador de células automatizado <td>de anticuerpo secundario anti-ratón derivado de cabra</td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>Cat. No. TC20</td><td></td></tr><tr><td>CELLBANKER</td><td>ZENOGEN PHARMA</td><td>Cat. 11910</td><td>Medio de congelación celular</td></tr><tr><td>colágeno tipo I</td><td>Sigma</td><td>Cat. Nº 08-115</td><td></td></tr><tr><td>Medio Celular ES Completo</td><td>Millipore</td><td>Cat. No. ES-101-B</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>Cat. 10184322</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águila Modificada Medium&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>Cat. 11971025</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>Cat. Microscopio de</td> fluorescencia 10270106 <td></td></tr><tr><td></td><td>Keyence</td><td>Cat. No. BZ-X700</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresent etiquetado como HA</td><td>PG Research</td><td>FAHA-H2</td><td></td></tr><tr><td>Plato de fondo de vidrio</td><td>Iwaki</td><td>Cat. 11-0602</td><td></td></tr><tr><td>glutaldehído</td><td>Sigma</td><td>Cat. Nº G5882</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Fisher</td><td>Cat. No. CB-40234</td><td>El</td></tr><tr><td>anticuerpo monoclonal anti-vinculina</td> de la matriz de membrana basal <td>Sigma</td><td>Cat. No. V9264</td><td></td></tr><tr><td>medios de montaje</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra normal</td><td>Fisher</td><td>Cat. 50062Z</td><td></td></tr><tr><td>O9-1 celdas</td><td>Millipore</td><td>Cat. No. SCC049</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma</td><td>Cat. 158127</td><td></td></tr><tr><td>trietoxisilano</td><td>Sigma</td><td>Cat. Nº 390143</td><td></td></tr><tr><td>tripsina-EDTA</td><td>Millipore</td><td>Cat. No. SM-2003-C</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro investigación de los efectos de la matriz extracelular rica en hialuronanos en la migración de células de cresta neural

In Vitro Investigation of the Effects of the Hyaluronan-Rich Extracellular Matrix on Neural Crest Cell Migration

Las células de la cresta neural (NCC) son células altamente migratorias que se originan en la región dorsal del tubo neural. La emigración de NCC desde el tubo neural es un proceso esencial para la producción de NCC y su posterior migración hacia los sitios objetivo. La ruta migratoria de los NCC, incluidos los tejidos del tubo neural circundantes, involucra una matriz extracelular rica en hialuronano (HA). Para modelar la migración de NCC en estos tejidos circundantes ricos en HA desde el tubo neural, se estableció en este estudio un ensayo de migración de sustrato mixto que consiste en HA (peso molecular promedio: 1,200-1,400 kDa) y colágeno tipo I (Col1). Este ensayo de migración demuestra que las células de línea celular NCC, O9-1, son altamente migratorias en el sustrato mixto y que el recubrimiento de HA se degrada en el sitio de adherencias focales en el curso de la migración. Este modelo in vitro puede ser útil para una mayor exploración de la base mecanicista involucrada en la migración de NCC. Este protocolo también es aplicable para evaluar diferentes sustratos como andamios para estudiar la migración de NCC.

Se realizó un ensayo de migración en sustratos mixtos compuestos de Col1 y HA de alto peso molecular (peso molecular promedio: 1.200-1.400 kDa) utilizando el protocolo descrito aquí. Se encontró que las células de O9-1 en el límite de la brecha migran fácilmente a la brecha rica en HA (Figura 4). La inmunotinción para un marcador de AF, la vinculina14, confirmó que las células O9-1 formaron adherencias focales (FA) en los sitios de degradación de HA (<strong class="xf...

Este protocolo describe un experimento de migración in vitro adecuado para el análisis funcional de las moléculas involucradas en la migración in vivo de las células de la cresta neural a la matriz extracelular rica en hialuronano.

In vitro Investigación de los efectos de la matriz extracelular rica en hialuronanos en la migración de células de cresta neural

Neural crest cells (NCCs) are highly migratory cells that originate from the dorsal region of the neural tube. The emigration of NCCs from the neural tube ...

El ácido hialurónico es una de las matrices extracelulares más abundantes en el modelo animal. Se ha demostrado la importancia del ácido hialurónico en el desarrollo embrionario. Este modelo in vitro es útil para explorar cómo las células de la cresta neural se adhieren y migran dentro de la matriz extracelular rica en ácido hialurónico.Con nuestra técnica, podemos evaluar la migración y la capacidad de degradación de HA tanto de la población mayorista como de las células individuales a lo largo del tiempo. Además, esta técnica se puede utilizar para la detección de drogas para encontrar compuestos que aceleren o prevengan la degradación de HA. Para comenzar, diluya la matriz de la membrana basal con PBS refrigerado en una proporción de 1:50 y manténgala en hielo.Cubra una placa de cultivo de 10 centímetros con 10 mililitros de la solución de matriz diluida e incube la placa a temperatura ambiente durante una hora. Lave el plato tres veces con dos mililitros de PBS. Para cultivar las células O9-1 en la placa recubierta de matriz, caliente el tallo embrionario completo o el medio de células madre embrionarias en un baño de agua a 37 grados centígrados.Mezcle suavemente la suspensión de celdas O9-1 y cuente el número de celdas usando un contador de celdas automatizado. Luego ajuste la concentración celular a 1.1 millones de células por mililitro con el medio completo de células ES. Agregue ocho mililitros de medio celular ES completo precalentado a la placa de cultivo de 10 centímetros recubierta de matriz y siembre las células O9-1 a 1.1 millones de células por placa.Incubar a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada con dióxido de carbono al 5%. Al día siguiente, reemplace el medio con un medio de células madre embrionarias completo fresco precalentado a 37 grados centígrados. Reemplácelo con medio fresco cada dos o tres días a partir de entonces.Lave la placa de cultivo con dos mililitros de PBS y luego agregue dos mililitros de tripsina-EDTA al 0,25% precalentado. Incubar durante cinco minutos a 37 grados centígrados. Agregue dos mililitros de medio celular ES completo precalentado a la placa de cultivo y transfiera las células disociadas a un tubo cónico de 15 mililitros.Centrifugar el tubo a 300 g durante cinco minutos y desechar el sobrenadante sin alterar el pellet celular. Agregue dos mililitros de medio celular ES completo precalentado al tubo y resuspenda completamente las células mediante pipeteo. Luego siembra las células en una nueva placa de cultivo con la densidad celular deseada.Agregue cuidadosamente 50 microlitros de trietoxisilano sin diluir a un plato con fondo de vidrio de 3,5 centímetros e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente protegido de la luz. Lave el plato tres veces con dos mililitros de agua destilada y agregue 50 microlitros de glutaraldehído al 0,25% diluido 100 veces en PBS por plato. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos, luego lavar cuatro veces con dos mililitros de PBS y cubrir los platos con 300 microlitros de colágeno tipo uno en 0,2 ácido acético normal a temperatura ambiente durante una hora.Nuevamente, lave tres veces con dos mililitros de PBS. Agregue 300 microlitros de 200 microgramos por mililitro de fluoresceinamina, etiquetado hialuronato de sodio H2 a cada plato e incube durante la noche a temperatura ambiente. Lavar de nuevo con dos mililitros de PBS tres veces.Después de secar el plato con fondo de vidrio recubierto, conecte los dos insertos de cultivo de pozo a los platos y llene los insertos externamente con un mililitro de PBS. Siembre las células O9-1 en los pocillos a 10, 000 células en 100 microlitros de DMEM que contienen 2% de suero bovino fetal o FBS por inserto. Cultive las células durante dos días a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada con dióxido de carbono al 5%, capture imágenes de contraste de fase como punto de inicio, utilizando un microscopio de fluorescencia todo en uno.Retire las inserciones cuidadosamente de los platos con fondo de vidrio recubierto con pinzas y lave suavemente los platos con fondo de vidrio recubierto con dos mililitros de PBS para eliminar las células y los desechos celulares. Agregue dos mililitros de DMEM fresco que contenga 2% de FBS en los platos cultivados. Cultive las células durante 48 horas adicionales a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono y capture imágenes de contraste de fase después de 24 horas y 48 horas en cultivo.Lave los platos con PBS y fije las células después de 48 horas con un mililitro de paraformaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados centígrados. Luego lave los platos tres veces durante cinco minutos cada una con un mililitro de PBS fresco. Finalmente, coloque un cubreobjetos con el medio de montaje para una mayor observación morfológica.Las secciones transversales del tubo neural de los embriones bandera de Tmem2 en E9.0 se muestran en esta figura. Las secciones en los niveles craneal y troncal del tubo neural fueron doblemente marcadas para la proteína bandera Tmem2 y el hialuronano. La expresión de Tmem2 se observó en la placa neural y la región fronteriza del tubo neural, mientras que estos sitios carecían de tinción de hialuronano.Aquí se muestra el doble etiquetado de las celdas de la cresta neural para la bandera Tmem2 y Sox9. Las secciones transversales del tubo neural E9.0 se tiñeron para la bandera Tmem2 y Sox9. En esta figura se muestran las imágenes representativas de células de O9-1 agotadas y control de Tmem2 cultivadas en una placa de cultivo regular.La expresión de Tmem2 en estas células se evaluó mediante qPCR con GAPDH como control interno para la normalización. Las células O9-1 agotadas y controladas de Tmem2 se cultivaron durante 48 horas en hojas de cubierta de vidrio recubiertas con hialuronano fluorescente. La actividad degradante del hialuronano se revela como áreas oscuras en el fondo fluorescente.El nivel de degradación del hialuronano también se comparó cuantitativamente entre las células de O9-1 de control y las células de control de O9-1. La degradación del hialuronano unido al sustrato en las adherencias focales en las células O9-1 se muestra en esta figura. Las células O9-1 cultivadas en sustratos mixtos que consisten en Col1/HA fueron inmunomarcadas con un anticuerpo anti-vinculina.Las manchas oscuras o rayas representan la actividad de degradación del hialuronano en el sustrato FAHA H2. Los sitios de degradación del hialuronano y las adherencias focales se colocalizaron en los sustratos mixtos. El recubrimiento de Coval de los platos con fondo de vidrio con HA es un paso crítico en el protocolo porque un recubrimiento inadecuado puede resultar en que el HA se elimine fácilmente por fuerza mecánica durante la adhesión y la migración.Para garantizar un recubrimiento adecuado, utilizamos glutaraldehído, colágeno tipo uno químicamente inmovilizado al vidrio a través del acoplamiento armado al aldehído. Es posible utilizar sustrato de matriz extracelular además de colágeno tipo uno, pero deben tener grupos armantes y puede haber limitaciones en el recubrimiento de coval en platos con fondo de vidrio debido a sus propiedades químicas. Por lo tanto, el ensayo y error puede ser necesario para determinar el mejor enfoque.Este experimento de laboratorio puede ser útil para estudiar cómo funcionan ciertas moléculas durante el movimiento de las células de la cresta neural en el entorno HA o HA alrededor del tubo neural. También podría ser una forma útil de probar un medicamento que podría acelerar o prevenir este proceso de migración. Es interesante saber por qué Tmem2 tiene tanto las funciones de adhesión sobre HA como la degradación de HA y por qué HA necesita ser degradado en el sitio de cohesión completa.Dado que HA es la sustancia más común en la matriz extracelular, averiguar la respuesta a esta pregunta es realmente importante en biología y medicina. Este protocolo experimental es valioso porque se puede aplicar a varios tipos de células, incluidos fibroblastos de la piel, células epiteliales y células cancerosas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

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In vitro Investigación de los efectos de la matriz extracelular rica en hialuronanos en la migración de células de cresta neural (Video) | JoVE Journal

In vitro Investigación de los efectos de la matriz extracelular rica en hialuronanos en la migración de células de cresta neural

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