Name: Visualización y cuantificación de las interacciones endógenas de proteínas intraorgánulas en los sitios de contacto ER-mitocondrias mediante ensayos de ligadura de proximidad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Aprende a visualizar y cuantificar interacciones proteicas endógenas en sitios de contacto ER-mitocondrias mediante ensayos de ligadura de proximidad. Este método permite estudiar la dinámica de proteínas ORP5 y ORP8 en membranas asociadas a mitocondrias.

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Este trabajo contó con el apoyo de la ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD), el Programa ATIP-Avenir, la Fondation pour la Recherche Medicale (n°206548) y la Fondation Vaincre Alzheimer (eOTP:669122 LS 212527), la I'Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope, ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging; ANR-11-IDEX-0003-02/Ciencias de las Plantas Saclay).

1. Tinción mitocondrial y ensayo de ligadura de proximidad (PLA)
<ol><li>Placa 0,5 x 10 5-2 x 10 5 5 células HeLa, mantenidas en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina y 1% de aminoácidos no esenciales a 37 °C con 5% de CO2, en cubreobjetos de vidrio de 13 mm en placas de1,5 en 24 pocillos a una dilución que permite una confluencia celular del 75%-90% el día del procedimiento. NOTA: Cabe destacar que las células HeLa pueden someterse a tratamientos adicionales, como el tratamiento con siRNA y/o la transfección de plásmidos de ADN, antes de la tinción mitocondrial y el PLA.</li>
	<li>Tinción mitocondrial<ol><li>Lavar las células una vez en un medio sin suero precalentado a 37 °C. Incubar las células con medio precalentado sin suero durante 10 min a 37 °C con 5% de CO2.</li>
		<li>Prepare 1 μM de marcador mitocondrial rojo en medio libre de suero precalentado.</li>
		<li>Incubar las células con 500 μL de solución marcadora mitocondrial durante 30 min a 37 °C con 5% de CO2. Durante el tratamiento con marcadores mitocondriales y los siguientes pasos del protocolo, mantenga las células en cubreobjetos protegidas de la luz tanto como sea posible.</li>
		<li>Después de la incubación, lavar las células 1 vez en medio libre de suero precalentado y 2 veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x. Realice este paso lo más rápido posible, ya que los largos pasos de lavado antes de la fijación pueden afectar la morfología mitocondrial.</li>
		<li>Retire el 1x PBS de los cubreobjetos y fije las células incubándolas en PFA al 4% recién preparado (en 1x PBS) durante 30 minutos a temperatura ambiente (en la oscuridad) bajo la cubierta química. Lavar 3 veces durante 2 minutos en 500 μL de 1x PBS (usando pipetas desechables o un sistema de vacío conectado a una bomba).</li>
		<li>Retire el 1x PBS e incube los cubreobjetos con 500 μL de 50 mM de NH4Cl durante 15 min a temperatura ambiente (en la oscuridad). Lavar 1 vez durante 2 minutos en 500 μL de 1x PSB utilizando un sistema de vacío.</li>
		<li>Lavar 3 veces durante 2 min en 500 μL de tampón de bloqueo 1 (BB1, 1% BSA, 0,1% saponina en 1x PBS) para el PLA ORP5-ORP8 o tampón de bloqueo 2 (BB2, 2% BSA, 0,1% suero normal de cabra, 0,1 saponina en 1x PBS) para el ORP8-PTPIP51 PLA.</li>
		<li>Transfiera los cubreobjetos de la placa de 24 pocillos a una cámara de humedad. Después de transferir los cubreobjetos a la cámara, agregue 100 μL de BB (BB1 o BB2, según los pares de anticuerpos utilizados) para evitar la sequedad. NOTA: Se puede obtener fácil y rápidamente una cámara de humedad protegida de la luz envolviendo una placa de Petri (plástico o vidrio) en papel de aluminio y agregando algunos trozos de toalla de papel húmeda en la periferia de la placa de Petri.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensayo de ligadura de proximidad (PLA) NOTA: El protocolo PLA sigue las instrucciones del fabricante con ligeras modificaciones.<ol><li>Incubación primaria de anticuerpos<ol><li>Prepare la solución de trabajo de anticuerpos primarios. Diluir anti-ORP5 de conejo (1:150) más anti-ORP8 de ratón (1:200) en BB1, anti-ORP8 de ratón (1:200) más anti-PTPIP51 de conejo (1:200) en BB2 y anti-ORP5 de conejo (1:150) más anti-PTPIP51 de ratón (1:200) en BB1. Prepare (al menos) 40 μL de solución de anticuerpos primarios por cubreobjetos (p. ej., 0,27 μL de anti-ORP5 de conejo, 0,2 μL de anti-ORP8 de ratón, 39,53 μL de BB1).</li>
			<li>Retire el BB del lavado anterior (paso 1.2.8) mediante un sistema de vacío y añada 40 μL de solución primaria de anticuerpos a los cubreobjetos. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente en una cámara de humedad protegida de la luz.</li>
		</ol></li>
		<li>Lave los cubreobjetos 3 veces durante 5 minutos con 100 μL del BB correspondiente utilizando el sistema de vacío.</li>
		<li>Incubación de sondas de PLA<ol><li>Prepare la solución de trabajo de las sondas PLA. Diluir las sondas de PLA de conejo PLUS (1:5) y MINUS (1:5) de ratón en BB y mezclar. Para cada cubreobjetos, prepare (al menos) 40 μL de solución de sonda de PLA (p. ej., 8 μL de sonda de PLA PLUS de conejo, 8 μL de sonda de PLA MENOS de ratón, 24 μL de BB). Deje reposar la solución de la sonda de PLA durante 20 minutos a temperatura ambiente antes de usarla.</li>
			<li>Retire el BB de los cubreobjetos (a partir del paso 1.3.2) utilizando un sistema de vacío y añada 40 μL de solución de sonda de PLA a los cubreobjetos. Incubar durante 1 h a 37°C en una cámara de humedad protegida de la luz.</li>
		</ol></li>
		<li>Lave los cubreobjetos 2 veces durante 5 min en 100 μL de 1 tampón de lavado A a temperatura ambiente.</li>
		<li>Ligadura<ol><li>Diluir el tampón de ligadura 5x a 1:5 en agua ultrapura y mezclar. Para cada cubreobjetos, prepare (al menos) 40 μL de solución de ligadura (8 μL de tampón de ligadura 5x, 31 μL de agua ultrapura).</li>
			<li>Añadir la ligasa (1 U/μL, suministrada en el kit de PLA) a 1x tampón de ligadura preparado en el paso anterior a una dilución de 1:40, y mezclar.</li>
			<li>Retirar 1x tampón de lavado A de los cubreobjetos (a partir del paso 1.3.4) mediante un sistema de vacío, añadir 40 μL de solución de ligasa a los cubreobjetos e incubar durante 30 min a 37 °C en una cámara de humedad protegida de la luz.</li>
		</ol></li>
		<li>Lave los cubreobjetos 2 veces durante 2 minutos en 100 μL de 1 tampón de lavado A a temperatura ambiente utilizando el sistema de aspiración.</li>
		<li>Polimerización<ol><li>Diluir 5 tampones de amplificación 1:5 en agua ultrapura y mezclar. Para cada cubreobjetos, prepare (al menos) 40 μl de solución de amplificación (8 μl de tampón de amplificación 5x, 31,5 μl de agua ultrapura).</li>
			<li>Añadir la polimerasa (10 U/μL, suministrada en el kit de PLA) al tampón de polimerización 1x preparado en el paso anterior a una dilución de 1:80, y mezclar.</li>
			<li>Retirar 1x tampón de lavado A de los cubreobjetos (del paso 1.3.6) mediante un sistema de vacío, añadir 40 μL de solución de polimerasa a los cubreobjetos e incubar durante 1 h 40 min a 37 °C en una cámara de humedad protegida de la luz.</li>
		</ol></li>
		<li>Retire la solución de polimerasa de los cubreobjetos y lave 2 veces durante 10 min en 100 μL de 1 tampón de lavado B a temperatura ambiente en una cámara de humedad protegida de la luz.</li>
		<li>Lave los cubreobjetos 1 vez durante 1 min en 100 μL de 0,001x tampón de lavado B a temperatura ambiente en una cámara de humedad protegida de la luz.</li>
		<li>Monte los cubreobjetos en portaobjetos de vidrio para microscopía utilizando un medio de montaje con DAPI (concentración entre 1,6-0,4 μg/mL). Sella con esmalte de uñas.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Adquisición de imágenes
<ol><li>Observe los resultados del PLA y adquiera imágenes mediante microscopía confocal de fluorescencia con un objetivo de inmersión en aceite de 63x utilizando el software adjunto.</li>
	<li>Establezca la excitación de fluorescencia con un diodo láser de 405 nm o un láser de luz blanca, y recoja las ventanas espectrales con PMT de GaAsP o detectores híbridos. En cada plano focal (que abarca 300 nm), adquiera las señales de fluorescencia para PLA (λex = 488 nm, λem = 505-560 nm) y mitocondrias (λex = 543 nm, λem = 606-670 nm).</li>
</ol>3. Procesamiento de imágenes y evaluación de manchas de PLA asociadas a mitocondrias
<ol><li>Procese las imágenes confocales utilizando un software para el análisis de imágenes que genera mapas de distancia entre los componentes celulares. Siga los pasos que se indican a continuación para generar reconstituciones 3D de los puntos de PLA y la red mitocondrial y para acceder a la distancia entre ellos mediante un software de imágenes celulares (Figura 1).</li>
	<li>Instalación de la extensión de mapa de distancia 3D<ol><li>Instale tanto el paquete de software de análisis celular con la opción XT como el software de MATLAB o solo un tiempo de ejecución del compilador de MATLAB (MRC), que se puede descargar gratuitamente desde el sitio web.</li>
		<li>Configure el software de análisis celular para iniciar MATLAB cuando se inicie un XTension de la siguiente manera: en la opción Imaris (Mac OS X) o en el menú Editar (Windows), seleccione Preferencias, cambie al panel Herramientas personalizadas y, a continuación, establezca la ruta: C:\Archivos de programa\MATLAB\R201Xa_x64\bin\win64\MATLAB .exe para Windows o/Aplicaciones/MATLAB_R201Xa.app/bin/matlab para Mac OS X.</li>
	</ol></li>
	<li>Importar las imágenes al software<ol><li>Convierta las imágenes de pila confocal en un archivo . IMS, ya sea directamente a través de la sección Arena o utilizando el convertidor de archivos independiente que permite la conversión por lotes.</li>
		<li>Después de la importación, compruebe que las imágenes permanezcan correctamente calibradas. Haga clic en Editar > Propiedades de la imagen > Geometría de la imagen y compruebe que el tamaño del vóxel corresponde en X e Y al tamaño de píxel esperado para la imagen real (consulte la calibración de la imagen en el software de adquisición) y que el tamaño del vóxel en Z corresponde al paso aplicado por el microscopio para generar la pila Z. Si los valores no son correctos, modifíquelos para garantizar una estimación correcta de las distancias en los siguientes pasos.</li>
		<li>Ajuste el contraste de los diferentes canales en el menú Ajuste de pantalla haciendo clic en Editar > Mostrar ajuste de pantalla. Ajuste cada canal de forma independiente para optimizar la visualización de cada color. Este paso no afecta directamente a los valores de la imagen, pero es esencial para establecer umbrales precisos o detectar objetos débiles.</li>
		<li>Limite el análisis a una sola celda recortando la imagen con las opciones Editar > Recortar 3D. Para analizar otra celda en el mismo campo de visión, abra la misma imagen una vez más y recórtela de manera diferente.</li>
	</ol></li>
	<li>Detección puntual ORP5-ORP8<ol><li>Detecte las señales PLA generadas en la ubicación de la interacción de ORP5 y ORP8 haciendo clic en la opción Agregar nuevos puntos, que crea un nuevo conjunto de objetos y abre el asistente de detección de puntos.</li>
		<li>Seleccione el canal en el que se debe realizar la detección puntual.</li>
		<li>Ajuste el diámetro XY estimado (el rango debe adaptarse si el tamaño del objeto difiere) para ayudar al algoritmo de detección de puntos a encontrar los objetos de interés. Tenga en cuenta que si el valor elegido es demasiado alto, los objetos cercanos se fusionarán. Si el valor es demasiado pequeño, una señal puede considerarse como varios objetos, o se pueden detectar señales aberrantes.</li>
		<li>Haga clic en Sustracción de fondo para eliminar el fondo de la imagen antes de la detección puntual para mejorar el contraste local alrededor de los objetos de interés.</li>
		<li>Ajuste el umbral de detección puntual manteniendo la calidad (intensidad en el centro del objeto) como parámetro de umbral y el umbral automático del software, o modifique ligeramente este valor para detectar todos los objetos. Una vez finalizada la detección puntual, guarde los parámetros de detección y reutilícelos para procesar otras imágenes.</li>
	</ol></li>
	<li>Detección de redes mitocondriales<ol><li>Detecte la red mitocondrial para generar una representación de superficie haciendo clic en Agregar nuevas superficies para crear un nuevo objeto y abra el asistente de detección de superficies.</li>
		<li>Seleccione el canal en el que se debe realizar la creación de superficies.</li>
		<li>Aplique un filtro gaussiano para obtener una superficie más suave haciendo clic en la casilla de verificación Suavizar y estableciendo un umbral que indique los detalles más pequeños observables en la superficie.</li>
		<li>Realice una resta de fondo para mejorar los contrastes locales y ayudar con el paso de umbral.</li>
		<li>Ajuste el umbral para detectar la red mitocondrial en función de la intensidad de la señal. Si es difícil establecer correctamente el umbral, se recomienda volver al paso anterior para ajustar el grado de suavidad y la resta de fondo.</li>
		<li>Si es necesario, aplique un filtro en la superficie para eliminar los pequeños residuos resultantes del umbral. Para ello, seleccione el filtro Número de vóxeles en la ventana de clasificación de superficie y juegue con los umbrales superior e inferior para mantener solo los objetos de interés. Una vez finalizada la creación de la superficie, guarde los parámetros de creación y reutilícelos para procesar otras imágenes.</li>
	</ol></li>
	<li>Generación del mapa de distancias 3D alrededor de las mitocondrias<ol><li>Genere un mapa de distancia fuera de la superficie mitocondrial creado previamente de la siguiente manera. Seleccione la superficie de las mitocondrias en el cuadro del árbol de escenas. Haga clic en Procesamiento de imágenes > Función de superficies > Transformación de distancia. Esto llamará a un Matlab XTension que pide al usuario que elija si el mapa debe calcularse fuera o dentro de la superficie del objeto.</li>
		<li>Seleccione Objeto de superficie exterior para medir la distancia entre los puntos de PLA y la superficie de las mitocondrias. Una vez generado, el mapa de distancia aparece como un nuevo canal en el panel de ajuste de visualización. En este canal, cada píxel tiene un valor correspondiente a la distancia a la mitocondria más cercana.</li>
	</ol></li>
	<li>Extracción de las distancias de los objetos a la mitocondria más cercana<ol><li>Para medir la distancia desde cada punto hasta la mitocondria más cercana e identificar y visualizar las más cercanas, seleccione los puntos generados previamente en el cuadro del árbol de escenas.</li>
		<li>En las estadísticas y el registro detallado, seleccione Valores específicos (para obtener una medición para cada punto). Seleccione Intensidad central Ch=X (donde X corresponde al número del canal del mapa de distancia). Esto medirá el valor de cada centro puntual, que corresponde a su distancia a la mitocondria más cercana, en el mapa de distancias.</li>
		<li>Exporte los datos como un archivo .csv haciendo clic en el icono de disquete en la parte inferior izquierda de la ventana.</li>
		<li>Para extraer una subpoblación de puntos en función de sus distancias a las mitocondrias, seleccione los puntos en el árbol de escenas y haga clic en la pestaña Filtros .</li>
		<li>En esta ventana, agregue un nuevo filtro basado una vez más en la intensidad central Ch=X, y extraiga los puntos a menos de 380 nm de distancia de las mitocondrias estableciendo el umbral inferior en 0 μm y el umbral superior en 0,380 μm. NOTA: El umbral de 380 nm se estimó sobre la base de una reacción de PLA que incluía la asociación entre los anticuerpos primarios y secundarios (30 nm) más la mitad del ancho total a la mitad del máximo (FWHM) de las señales de amplificación de PLA (350 nm).</li>
		<li>Para enfocar las manchas seleccionadas y, por ejemplo, darles un color distinto, realice un paso de duplicación pulsando el botón Duplicar selección a nuevas tintas .</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Scorrano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coming+together+to+define+membrane+contact+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Coming together to define membrane contact sites.</a> Nature Communications. 10, 1287(2019).</li>
<li>Vance, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAM+%28mitochondria-associated+membranes%29+in+mammalian+cells%3A+Lipids+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+and+Cell+Biology+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">MAM (mitochondria-associated membranes) in mammalian cells: Lipids and beyond.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1841 (4), 595-609 (2014).</li>
<li>Giordano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-vesicular+lipid+trafficking+at+the+endoplasmic+reticulum-mitochondria+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Non-vesicular lipid trafficking at the endoplasmic reticulum-mitochondria interface.</a> Biochemical Society Transactions. 46 (2), 437-452 (2018).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li>
<li>Gomez-Suaga, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ER-mitochondria+tethering+complex+VAPB-PTPIP51+regulates+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The ER-mitochondria tethering complex VAPB-PTPIP51 regulates autophagy.</a> Current Biology. 27 (3), 371-385 (2017).</li>
<li>Han, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Mfn2+in+the+structure+and+function+of+endoplasmic+reticulum-mitochondrial+tethering+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The role of Mfn2 in the structure and function of endoplasmic reticulum-mitochondrial tethering in vivo.</a> Journal of Cell Science. 134 (13), jcs253443(2021).</li>
<li>Stoica, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS%2FFTD-associated+FUS+activates+GSK-3%CE%B2+to+disrupt+the+VAPB-PTPIP51+interaction+and+ER-mitochondria+associations%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">ALS/FTD-associated FUS activates GSK-3β to disrupt the VAPB-PTPIP51 interaction and ER-mitochondria associations.</a> EMBO reports. 17 (9), 1326-1342 (2016).</li>
<li>Tubbs, E., Rieusset, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+endoplasmic+reticulum+and+mitochondria+interactions+by+in+situ+proximity+ligation+assay+in+fixed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e54899(2016).</li>
<li>Cuello, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+the+ER%2Fmitochondria+compartment+in+human+cardiomyocytes+with+PLN+p.Arg14del+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Impairment of the ER/mitochondria compartment in human cardiomyocytes with PLN p.Arg14del mutation.</a> EMBO Molecular Medicine. 13 (6), e13074(2021).</li>
<li>Paillusson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-Synuclein+binds+to+the+ER-mitochondria+tethering+protein+VAPB+to+disrupt+Ca2%2B+homeostasis+and+mitochondrial+ATP+production%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">α-Synuclein binds to the ER-mitochondria tethering protein VAPB to disrupt Ca2+ homeostasis and mitochondrial ATP production.</a> Acta Neuropathologica. 134 (1), 129-149 (2017).</li>
<li>Tubbs, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-associated+endoplasmic+reticulum+membrane+%28MAM%29+integrity+is+required+for+insulin+signaling+and+is+implicated+in+hepatic+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance.</a> Diabetes. 63 (10), 3279-3294 (2014).</li>
<li>Chung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI4P%2Fphosphatidylserine+countertransport+at+ORP5-+and+ORP8-mediated+ER-plasma+membrane+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">PI4P/phosphatidylserine countertransport at ORP5- and ORP8-mediated ER-plasma membrane contacts.</a> Science. 349 (6246), 428-432 (2015).</li>
<li>Galmes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORP5%2FORP8+localize+to+endoplasmic+reticulum-mitochondria+contacts+and+are+involved+in+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">ORP5/ORP8 localize to endoplasmic reticulum-mitochondria contacts and are involved in mitochondrial function.</a> EMBO Reports. 17 (6), 800-810 (2016).</li>
<li>Ghai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORP5+and+ORP8+bind+phosphatidylinositol-4%2C+5-biphosphate+%28PtdIns%284%2C5%29P+2%29+and+regulate+its+level+at+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">ORP5 and ORP8 bind phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PtdIns(4,5)P 2) and regulate its level at the plasma membrane.</a> Nature Communications. 8, 757(2017).</li>
<li>Monteiro-Cardoso, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORP5%2F8+and+MIB%2FMICOS+link+ER-mitochondria+and+intra-mitochondrial+contacts+for+non-vesicular+transport+of+phosphatidylserine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">ORP5/8 and MIB/MICOS link ER-mitochondria and intra-mitochondrial contacts for non-vesicular transport of phosphatidylserine.</a> Cell Reports. 40 (12), 111364(2022).</li>
<li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORP5+localizes+to+ER-lipid+droplet+contacts+and+regulates+the+level+of+PI%284%29P+on+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">ORP5 localizes to ER-lipid droplet contacts and regulates the level of PI(4)P on lipid droplets.</a> Journal of Cell Biology. 219 (1), e201905162(2020).</li>
<li>Guyard, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORP5+and+ORP8+orchestrate+lipid+droplet+biogenesis+and+maintenance+at+ER-mitochondria+contact+sites%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">ORP5 and ORP8 orchestrate lipid droplet biogenesis and maintenance at ER-mitochondria contact sites.</a> The Journal of Cell Biology. 221 (9), e202112107(2022).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo fue diseñado para identificar y cuantificar las interacciones de PLA entre las proteínas de los orgánulos en los SQM, en particular en los MERCS. La novedad del protocolo es que combina el PLA con el marcaje de múltiples orgánulos, la microscopía confocal y el análisis de imágenes 3D para localizar y cuantificar las interacciones del PLA entre dos proteínas que residen en la misma membrana, en este caso dentro de la membrana del RE en estrecha proximidad con la membrana de las mitocondrias (MAM) o con el M...

La comunicación entre orgánulos es una característica definitoria de las células eucariotas. Una forma en que los orgánulos se comunican es mediante la formación de sitios de contacto de membrana (MCS), que son oposiciones de membrana cercanas entre dos orgánulos que son mantenidas por proteínas estructurales y funcionales, como ataduras, proteínas de transferencia de lípidos y canales de calcio1. Los SQM pueden establecerse entre orgánulos similares o diferentes, y median el intercambio de componentes celulares, lo cual es importante para mantener la homeostasis celular. Hasta la fecha, se han identificado varias SQM, incluidos los contactos del retículo endoplásmico (RE)-mitocondrias, RE-membrana plasmática (PM) y ER-gotitas lipídicas (LD)1. Entre ellas, las que se forman entre el RE y las mitocondrias (MERCSs) se encuentran entre las más estudiadas, ya que están implicadas en la regulación de varias funciones celulares, entre ellas la homeostasis lipídica y cálcica2. Dado que las mitocondrias están excluidas en gran medida de las vías clásicas de transporte vesicular, dependen de MERCS y de sus constituyentes moleculares para importar lípidos o precursores lipídicos clave del RE. El transporte no vesicular de estos lípidos a través de los MERCS garantiza el mantenimiento de la composición lipídica mitocondrial adecuada, así como su integridad funcional y estructural3.
Dada la participación crucial de las SQM en diversas funciones celulares, el interés por proporcionar una comprensión más profunda de sus componentes moleculares ha aumentado considerablemente en los últimos años. Se han utilizado varios tipos de enfoques basados en imágenes para avanzar en el conocimiento de las SQM. Entre ellos, el ensayo de ligadura de proximidad (PLA) basado en sonda de fluorescencia ha sido ampliamente utilizado como indicador de la abundancia de SQM mediante la detección de interacciones proteína-proteína entre orgánulos (en un rango de detección de 40 nm) a niveles endógenos4. Por ejemplo, los MERCS se han visualizado y cuantificado mediante el uso de PLA entre varios pares de proteínas mitocondrias-ER, incluidos VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 y PTPIP51-VAPB 5,6,7,8. Aunque esta tecnología se ha utilizado para detectar y cuantificar las interacciones proteína-proteína entre orgánulos que están presentes en el MCS 5,7,9,10,11, la mayoría de los estudios no combinaron PLA con tinción de orgánulos. En consecuencia, aún no se ha desarrollado un método cuantitativo que permita medir la proximidad entre las interacciones del PLA y los orgánulos asociados. Por lo tanto, hasta ahora, en el caso de las proteínas RE, su interacción dentro de los subdominios de membrana en contacto con otros orgánulos no se ha distinguido de su interacción dentro de la red RE ampliamente distribuida.
Aquí, describimos un protocolo para detectar interacciones de PLA entre proteínas que residen en la membrana del mismo orgánulo y analizar su proximidad a la membrana del orgánulo asociado en el MCS. Este protocolo se desarrolló en base a dos premisas: 1) estudios previos que muestran que, en condiciones de sobreexpresión, las proteínas de transferencia de lípidos del RE ORP5 y ORP8 se colocalizan e interactúan en las mitocondrias del RE y en los MCS del RE-PM 12,13,14,15 y que el ORP5 se localiza en los contactos del RE-LD 16,17; 2) las tecnologías existentes, como el PLA, la microscopía confocal, el marcaje de orgánulos y el análisis de imágenes en 3D.

<table><tbody><tr><td>1X Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (1X DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de amonio (NH4Cl)</td><td>VWR</td><td>21236.291</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio circulares 13mm n.º 1.5</td><td>Agar Scientific</td><td>L46R13-15</td><td></td></tr><tr><td>CMXRos rojo MitoTracker</td><td>Invitrogen</td><td>M7512</td><td>marcador mitocondrial rojo</td></tr><tr><td>Microscopio confocal invertido SP8-X</td><td>Leica</td><td>DMI 6000</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar TC Placas de 24 pocillos</td><td>Merck</td><td>CLS3526</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Reactivos de detección in situ Green&nbsp;</td>Medio de montaje <td>in situ Sigma</td><td>DUO92002</td><td></td></tr><tr><td>Duolink con DAPI&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>DUO82040</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Sonda PLA in situ Anti-Ratón MINUS&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>DUO92004</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Sonda PLA in situ Anti-Rabbit PLUS</td><td>Sigma</td><td>DUO92014</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Tampones de lavado in situ, fluorescencia&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>DUO82049</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Opti-MEM I Medio Suero Reducido, Suplemento GlutaMAX&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>51985026</td><td>medio libre de suero</td></tr><tr><td>Imaris software v 9.3</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td>software de imagen celular</td></tr><tr><td>Incubadora UINCU-line IL10</td><td>VWR</td><td>390-0384</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio StarFrost (3" x 1")&nbsp;</td><td>Knittel Ratón de cristal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-ORP8&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>134409</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>conejo anti-ORP5&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>HAP038712</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma</td><td>84510</td><td></td></tr><tr><td>Agua Destilada Ultra Pura, libre de DNasa/RNasa</td><td>Invitrogen</td><td>10977-035</td><td></td></tr></tbody></table>

visualización y cuantificación de las interacciones endógenas de proteínas intraorgánulas en los sitios de contacto er-mitocondrias mediante ensayos de ligadura de proximidad

Visualization and Quantification of Endogenous Intra-Organelle Protein Interactions at ER-Mitochondria Contact Sites by Proximity Ligation Assays

Los sitios de contacto de membrana (MCS) son áreas de proximidad cercana a la membrana que permiten y regulan el intercambio dinámico de diversas biomoléculas (es decir, calcio y lípidos) entre los orgánulos yuxtapuestos sin involucrar la fusión de la membrana. Las SQM son esenciales para la homeostasis celular, y sus funciones están aseguradas por los componentes residentes, que a menudo existen como complejos de proteínas multiméricas. Las SQM a menudo involucran el retículo endoplásmico (RE), un sitio importante de síntesis de lípidos y almacenamiento de calcio celular, y son particularmente importantes para los orgánulos, como las mitocondrias, que están excluidos de las vías clásicas de transporte vesicular. En los últimos años, las SQM entre el RE y las mitocondrias han sido ampliamente estudiadas, ya que sus funciones tienen un fuerte impacto en el metabolismo/bioenergética celular. Se han comenzado a identificar varias proteínas en estos sitios de contacto, incluidas las ataduras de membrana, los canales de calcio y las proteínas de transferencia de lípidos, lo que plantea la necesidad de nuevas metodologías y enfoques técnicos para estudiar estos componentes de la SQM. Aquí, describimos un protocolo que consiste en enfoques técnicos combinados, que incluyen el ensayo de ligadura de proximidad (PLA), la tinción de mitocondrias y la segmentación por imágenes 3D, que permite la detección de proteínas que están físicamente cerca (>40 nm) entre sí y que residen en la misma membrana en los MCS ER-mitocondrias. Por ejemplo, utilizamos dos proteínas de transferencia de lípidos ancladas al RE, ORP5 y ORP8, que previamente se ha demostrado que interactúan y se localizan en las MCS de la mitocondria del RE y de la membrana plasmática del RE. Al asociar el PLA ORP5-ORP8 con el análisis de software de imágenes celulares, fue posible estimar la distancia del complejo ORP5-ORP8 desde la superficie mitocondrial y determinar que aproximadamente el 50% de la interacción ORP5-ORP8 PLA ocurre en los subdominios RE en las proximidades de las mitocondrias.

Utilizando el protocolo descrito anteriormente, detectamos los sitios de interacción de dos proteínas de transferencia de lípidos ancladas al RE, ORP5 y ORP8, y evaluamos su ocurrencia en los subdominios de la membrana del RE en contacto con otros orgánulos, en particular, con las mitocondrias. Para ello, se tiñó la red mitocondrial en las células HeLa con un marcador mitocondrial rojo, y se detectaron puntos verdes de PLA ORP5-ORP8 después de la fijación utilizando los anticuerpos primarios anti-ORP5 y anti-ORP8, cuya e...

La necesidad de nuevos enfoques para estudiar los sitios de contacto de membrana (MCS) ha crecido debido al creciente interés en el estudio de estas estructuras celulares y sus componentes. Aquí, presentamos un protocolo que integra tecnologías de microscopía previamente disponibles para identificar y cuantificar complejos de proteínas intra-orgánulos e inter-orgánulos que residen en los SQM.

Visualización y cuantificación de las interacciones endógenas de proteínas intraorgánulas en los sitios de contacto ER-mitocondrias mediante ensayos de ligadura de proximidad

Membrane contact sites (MCSs) are areas of close membrane proximity that allow and regulate the dynamic exchange of diverse biomolecules (i.e., calcium ...

Nuestro protocolo PLA permite identificar y cuantificar la interacción endógena entre proteínas en los sitios de contacto con la membrana. Lo hemos utilizado para estudiar la interacción entre dos proteínas del retículo endoplásmico en los sitios de contacto mitocondrial del retículo endoplásmico. Esta técnica combina el PLA con tinciones de orgánulos y análisis de distancias de orgánulos.Permite localizar y cuantificar en interacción entre proteínas en los sitios de contacto entre membranas de orgánulos. Después de realizar el ensayo de ligadura de proximidad, o PLA, y la adquisición de imágenes, configure el software de análisis celular para iniciar MATLAB e inicie una extensión haciendo clic en la opción Imaris en el sistema operativo Mac o en el menú de edición en Windows. Seleccione las preferencias, cambie al panel de herramientas personalizadas y establezca la ruta.Para importar las imágenes en el software, convierta las imágenes de la pila confocal en un archivo IMS, ya sea directamente a través de la sección arena o utilizando el convertidor de archivos independiente que permite la conversión por lotes. Después de la importación, haga clic en editar, vaya a las propiedades de la imagen y seleccione la geometría de la imagen para verificar la calibración de la imagen. Compruebe que el tamaño del vóxel se corresponde con el tamaño de píxel esperado para la imagen real en X e Y, y el paso aplicado por el microscopio para generar la pila Z en Z.To ajustar el contraste de los diferentes canales Haga clic en Editar en el menú, vaya al ajuste de pantalla y seleccione Mostrar ajuste de pantalla.Ajuste cada canal de forma independiente para optimizar la visualización de cada color. Este paso es esencial para establecer umbrales precisos o detectar objetos débiles. A continuación, haga clic en editar y seleccione recortar 3D para limitar el análisis a una sola celda recortando la imagen.Para analizar otra celda en el mismo campo de visión, vuelva a abrir la misma imagen y recórtela de forma diferente. Detecte las señales PLA generadas en la ubicación de la interacción de ORP5 y ORP8 haciendo clic en la opción agregar nuevos puntos, que crea un nuevo conjunto de objetos y abre el asistente de detección de puntos. Seleccione el canal en el que se debe realizar la detección puntual.Ajuste el diámetro XY estimado para ayudar al algoritmo de detección puntual a encontrar los objetos de interés. Si el valor elegido es demasiado alto, los objetos cercanos se fusionarán, y si el valor es demasiado pequeño, se pueden detectar señales aberrantes. Ahora, haga clic en la resta de fondo para eliminar el fondo de la imagen antes de la detección puntual para mejorar el contraste local alrededor de los objetos de interés.Ajuste el umbral de detección puntual manteniendo la calidad como parámetro de umbral en el umbral automático del software, o modifique ligeramente este valor para detectar todos los objetos. Una vez finalizada la detección puntual, guarde los parámetros de detección y reutilícelos para procesar otras imágenes. A continuación, detecte la red mitocondrial para generar una representación de superficie haciendo clic en añadir nuevas superficies para crear un nuevo objeto y abrir el asistente de detección de superficies.Seleccione el canal en el que se debe realizar la creación de superficies. Aplique el filtro gaussiano para obtener una superficie más suave haciendo clic en la casilla de verificación suavizar y estableciendo un umbral que indique los detalles menores observables en la superficie. Después, realice una resta de fondo para mejorar los contrastes locales y ajuste el umbral para detectar la red mitocondrial en función de la intensidad de la señal.Aplique un filtro en la superficie para eliminar pequeños residuos del umbral seleccionando el filtro de número de vóxeles en la ventana de clasificación de superficie y juegue con los umbrales superior e inferior para conservar solo los objetos de interés. Una vez finalizada la creación de la superficie, guarde los parámetros de creación y reutilícelos para procesar otras imágenes. Para generar un mapa de distancia fuera de la superficie mitocondrial creada, seleccione la superficie mitocondrial en el cuadro del árbol de escenas.Haga clic en procesamiento de imágenes y seleccione la función de superficies, seguida de la transformación de distancia. Aparecerá una extensión de MATLAB en la que se pide al usuario que elija si el mapa debe calcularse fuera o dentro de la superficie del objeto. Seleccione el objeto de la superficie exterior para medir la distancia entre los puntos de PLA y la superficie de las mitocondrias.Una vez que se genera el mapa, aparece como un nuevo canal en el panel de ajuste de visualización. En este canal, cada píxel tiene un valor correspondiente a la distancia a la mitocondria más cercana. Seleccione los puntos generados previamente en el cuadro del árbol de escenas para medir la distancia desde cada punto a la mitocondria más cercana, e identificar y visualizar los más cercanos.Ahora, seleccione los valores específicos y la intensidad central del canal correspondiente al mapa de distancia en las estadísticas y el registro detallado para medir el valor de cada centro de punto, que corresponde a su distancia a la mitocondria más cercana en el mapa de distancia. Exporte los datos como un archivo CSV haciendo clic en el icono del disquete en la parte inferior izquierda de la ventana. Para extraer una subpoblación de puntos en función de sus distancias a las mitocondrias, seleccione los puntos en el árbol de escenas y haga clic en la pestaña de filtros.Agregue un nuevo filtro basado en la intensidad central del canal correspondiente al mapa de distancia en esta ventana y extraiga los puntos a menos de 380 nanómetros de distancia de las mitocondrias estableciendo el umbral inferior en cero micrómetros y el umbral superior en 0,380 micrómetros. Realice un paso de duplicación pulsando el botón duplicar selección a nuevas tintas para enfocar las tintas seleccionadas. Las imágenes confocales del PLA endógeno ORP5-ORP8 mostraron interacciones en las células HeLa en los subdominios reticular RE, RE cortical y RE en estrecho contacto con las mitocondrias, comúnmente conocidas como membranas RE asociadas a mitocondrias.El análisis de imágenes en 3D reveló que alrededor del 50% de las interacciones endógenas de ORP5-ORP8 PLA se detectaron en las membranas del RE asociadas a las mitocondrias. El porcentaje de interacciones ORP5-ORP8 PLA que ocurren en las membranas del RE asociadas a mitocondrias en células que co-sobreexpresan ORP5 y ORP8 fue similar al observado en células donde estas proteínas se expresaron a niveles endógenos. La regulación negativa de ORP5 y ORP8 indujo una disminución masiva en el número total de señales de PLA, mientras que su co-sobreexpresión aumentó el PLA.Las señales de PLA se detectaron en las parejas ORP5-PTPIP51 y ORP8-PTPIP51, y sus números promedio fueron similares a los de la pareja ORP5-ORP8 PLA, lo que confirma la localización de ORP5 y ORP8 en los sitios de contacto entre el ER y la membrana mitocondrial. Además, la interacción de ORP5-ORP8 PLA en los contactos de la membrana plasmática del RE en un sitio de contacto de tres vías entre las mitocondrias, el RE y las gotas de lípidos se identifica utilizando células HeLa transfectadas con PHPLCD-RFP o mCherry-PLN1. Como en cualquier método de análisis de imágenes, la calidad de la imagen es un punto clave, por lo que la optimización de la señal es determinante para la detección automática de los objetos.Esta técnica también se puede utilizar para estudiar las asociaciones entre dos o múltiples orgánulos celulares, como hicimos en nuestro reciente estudio sobre la función de ORP5 y ORP8 en los sitios de contacto de ER, mitocondrias y gotas de lípidos de tres partes. Esta técnica puede ser útil en otros estudios en el campo de la comunicación intracelular para identificar nuevas asociaciones multipartitas entre orgánulos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video describe el ensayo de ligadura de proximidad para estudiar in situ las interacciones proteína-proteína en células de nematodos. La proximidad de las proteínas de interés genera la plantilla circular de ADN con la ayuda de una sonda de PLA unida a un anticuerpo secundario. La sonda se amplifica aún más utilizando la solución de amplificación, que produce un ADN monocatenario largo seguido de la hibridación de la sonda detectora, lo que permite la localización de las interacciones...

Ensayo de ligadura de proximidad para estudiar in situ las interacciones proteína-proteína

A continuación, describimos un procedimiento para visualizar y cuantificar con alta sensibilidad las interacciones endógenas entre el retículo endoplasmático y las mitocondrias en las células fijadas. El protocolo cuenta con una optimizada en el ensayo de ligamiento por proximidad situ la orientación del inositol receptor / proteína 1,4,5-trifosfato regulada por glucosa 75 / D compleja canal de aniones / ciclofilina dependiente de la tensión en la interfase membrana de la mitocondria asociada.

Estudio del retículo endoplasmático y las mitocondrias por Interacciones<em&gt; In Situ</em&gt; Proximidad ligadura de ensayo en células fijadas

Las interacciones proteína-proteína pueden ocurrir tanto en el núcleo como en el citoplasma de una célula. Para investigar estas interacciones, se aplica la coinmunoprecipitación tradicional y el ensayo moderno de ligadura de proximidad. En este estudio, comparamos estos dos métodos para visualizar la distribución de las interacciones NF90-RBM3 en el núcleo y el citoplasma.

La visualización de la interacción proteína-proteína en las fracciones nucleares y citoplasmáticas de Co-inmunoprecipitación y<em&gt; In Situ</em&gt; Ligadura ensayo de proximidad

Aquí se demuestra cómo se puede usar el Ensayo de Ligación de Proximidad in situ (PLA) para detectar y visualizar las interacciones directas proteína-proteína entre ATM y p53 en cultivos de células en suspensión expuestos al estrés genotóxico.

Detección y visualización de los complejos de proteínas inducidos por daño de ADN en cultivos de células en suspensión usando el ensayo de ligación de proximidad

Aquí, mostramos cómo hacer un análisis de proximidad de la ligadura (PLA) visualizar heterodimerization MST1/MST2 en células fijas con alta sensibilidad.

Detección de Heterodimerization de isoformas de la proteína usando un análisis de ligadura in Situ proximidad

Presentamos un protocolo para estudiar la distribución de mitocondrias y retículo endoplasmático en células enteras después de la modificación genética utilizando microscopía electrónica correlativa de luz y volumen incluyendo ascorbato peroxidasa 2 y tinción de peroxidasa de rábano picante, seccionamiento en serie de células con y sin el gen objetivo en la misma sección, y la toma de imágenes en serie a través de microscopía electrónica.

Mitocondrias y endoplasmática retícula imagen por microscopía electrónica de luz y volumen correlativa

Las proteínas de dominio J de Cognate cooperan con el acompañante Hsp70 para ayudar en una miríada de procesos biológicos que van desde el plegado de proteínas hasta la degradación. Aquí, describimos un ensayo de ligadura de proximidad in situ, que permite el seguimiento de estas máquinas de chaperone formadas transitoriamente en células bacterianas, levaduras y humanas.

Monitoreo in situ de conjuntos de chaperona molecular formadas transitoriamente en bacterias, levaduras y células humanas

Aquí se describe un protocolo proteómico de etiquetado de proximidad de lisosomas neuronales para caracterizar el microambiente lisosomal dinámico en neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos. Las proteínas de membrana lisosomal y las proteínas que interactúan con los lisosomas (de forma estable o transitoria) se pueden cuantificar con precisión en este método con una excelente resolución espacial intracelular en neuronas humanas vivas.

Caracterización del interactoma de lisosoma neuronal con proteómica de etiquetado de proximidad

Hemos establecido un ensayo de reensamblaje de luciferasa dividida para monitorear los contactos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias en células vivas. Con este ensayo, describimos un protocolo para medir cuantitativamente el nivel de estos acoplamientos interorgánulos en HEK293T células, bajo la condición de tratamiento químico.

Ensayo de reensamblaje de luciferasa dividida para medir los contactos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias en células vivas

Este protocolo describe cómo la imagen de interacciones proteína-proteína mediante un ensayo basado en la proximidad FRET.

Imágenes de interacciones proteína-proteína In vivo</em

Aprende a visualizar y cuantificar interacciones proteicas endógenas en sitios de contacto ER-mitocondrias mediante ensayos de ligadura de proximidad. Este método permite estudiar la dinámica de proteínas ORP5 y ORP8 en membranas asociadas a mitocondrias.

Visualización y cuantificación de las interacciones endógenas de proteínas intraorgánulas en los sitios de contacto ER-mitocondrias mediante ensayos de ligadura de proximidad (Video) | JoVE Journal

Visualización y cuantificación de las interacciones endógenas de proteínas intraorgánulas en los sitios de contacto ER-mitocondrias mediante ensayos de ligadura de proximidad

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