Name: Mielinización in vitro de axones periféricos en un cocultivo de explantes de ganglio de raíz dorsal de rata y células de Schwann (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Aprende a estudiar la mielinización periférica in vitro mediante un cocultivo de ganglios de raíz dorsal y células de Schwann de rata. Este modelo permite cuantificar la mielina y evaluar compuestos terapéuticos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos al Prof. Dr. Ralf Gold y a la PD Dra. Gisa Ellrichmann por sus consejos y apoyo.

Todos los procedimientos se realizaron de conformidad con la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
1. Cultivo celular de Schwann
<ol><li>Recubrimiento para cultivo celular de Schwann<ol><li>Cubra las placas de cultivo celular en condiciones estériles. Aplicar 2 ml de poli-L-lisina (PLL) al 0,01% en dos placas de cultivo de tejidos (CT) de 60 mm cada una e incubar durante la noche a 4 °C.</li>
		<li>Retirar el PLL, lavar los platos TC 2x con agua destilada e incubar con 2 mL de laminina 1 μg/cm2 durante la noche a 4 °C. Lave los platos TC 2x con aqua dest y deje que los platos se sequen al aire.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación del medio para el cultivo celular de Schwann<ol><li>Prepare 50 ml de medio celular de Schwann agregando 10% de suero fetal de ternera (FCS) inactivado por calor, 2 μM de forskolina, 10 nM de neuregulina y 50 μg / ml de gentamicina al medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) / F-12 (glucosa alta) en condiciones estériles.</li>
		<li>Preparar 70 ml de medio L-15 de Leibovitz con 50 μg/ml de gentamicina en condiciones estériles.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación del nervio ciático NOTA: Todos los pasos de preparación del nervio ciático se realizan bajo un banco limpio.<ol><li>Prepare un plato de TC de 100 mm con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco helada sin Ca 2+ y Mg2+, un plato de TC de 100 mm con 5 ml de medio L-15 de Leibovitz helado y un plato TC de 100 mm con 5 ml de medio L-15 de Leibovitz helado y 50 μg/ml de gentamicina.</li>
		<li>Limpie todos los instrumentos en autoclave. Rocíe los instrumentos y el área de trabajo con etanol al 70%.</li>
		<li>Eutanasia de cinco ratas Sprague Dawley macho de 3 semanas de edad usando inhalación y decapitación deCO2 . Rocíe el torso de la rata con etanol al 70%.</li>
		<li>Abra la extremidad inferior izquierda dorsal con tijeras y retire el músculo bíceps femoral con cuidado. Afloje el nervio ciático mediante una elevación suave con fórceps curvos, asegurándose de no magullar el nervio.</li>
		<li>Sostenga la parte más proximal del nervio con los fórceps curvos para enderezar el nervio y sujete el nervio lo más alto posible con tijeras. Luego, recorte el nervio cerca del plexo sacro y la pata con tijeras. Repita los pasos 1.3.4-1.3.5 para el lado derecho. NOTA: Al abrir la extremidad, tenga cuidado de no magullar ningún vaso sanguíneo.</li>
		<li>Usando fórceps, coloque los nervios ciáticos izquierdo y derecho en una placa TC de 100 mm con DPBS helado.</li>
	</ol></li>
	<li>Renovación del nervio ciático<ol><li>Use fórceps para transferir todos los nervios a una placa TC de 100 mm con medio L-15 de Leibovitz helado y gentamicina de 50 μg/ml. Continúe usando un microscopio estereoscópico y elimine la grasa, los músculos y los vasos sanguíneos de los nervios con dos pares de pinzas finas. Agarre los nervios con fórceps y transfiéralos a un plato TC de 100 mm con el medio L-15 de Leibovitz helado.</li>
		<li>Identificar los extremos proximal y distal del nervio ciático. Retire el epineuro con un par de pinzas finas en dirección proximal a distal, mientras sostiene el extremo del nervio proximal con el segundo par de pinzas finas.</li>
		<li>Transfiera los nervios purificados a una placa TC de 100 mm con medio L-15 de Leibovitz helado y gentamicina de 50 μg/ml. Realice burlas de los fascículos nerviosos aislados para separar y aislar fibras nerviosas individuales usando dos pares de pinzas finas.</li>
		<li>Transfiera las fibras nerviosas a un tubo de 50 ml utilizando una pipeta serológica de 10 ml y tome el menor medio posible. Agregue 50 ml de medio L-15 de Leibovitz con 50 μg / ml de gentamicina a las fibras nerviosas y lea varias veces en el tubo de 50 ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Digestión enzimática del nervio ciático NOTA: Los siguientes pasos (pasos 1.5-1.8, 2.1 y 2.2) se realizan en condiciones estériles.<ol><li>Prepare la solución de digestión enzimática que contiene 0,25% de dispasa II, 0,05% de colagenasa tipo I y 50 μg/ml de gentamicina en 10 ml de DMEM (glucosa alta).</li>
		<li>Centrifugar el tubo a 188 x g durante 5 min a 4 °C, extraer el sobrenadante con una pipeta serológica de 25 ml y transferir el pellet con el medio L-15 restante de Leibovitz a una placa TC de 60 mm utilizando una pipeta de 1.000 ml.</li>
		<li>Enjuague el tubo de 50 ml con 10 ml de la solución de digestión enzimática y agréguelo al plato que contiene las fibras nerviosas. Distribuya el tejido en el plato cuidadosamente con la punta de una pipeta para maximizar la superficie accesible para la digestión.</li>
		<li>Incubar a 37 °C y 5% deCO2 durante 18 h, y detener la digestión añadiendo 10 ml de FCS al 40% en la solución salina equilibrada de Hanks, sin Ca2 y Mg2+ (HBSS).</li>
	</ol></li>
	<li>Separación celular<ol><li>Transfiera los nervios digeridos a un tubo de 50 ml utilizando una pipeta serológica y centrifugar a 188 x g durante 10 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 10 ml de DMEM que contenga 10% de FCS y 50 μg/ml de gentamicina. Vuelva a suspender el pellet 20 veces posteriormente, utilizando una punta de pipeta de 10 ml, 5 ml, 2 ml, 1 ml y 200 μl.</li>
		<li>Filtrar la suspensión celular a través de un filtro celular de 100 μm y centrifugar a 188 x g durante 10 min a 4 °C. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet con 4 mL de DMEM que contenga 10% de FCS y 50 μg/ml de gentamicina.</li>
		<li>Añadir 2 ml de la suspensión celular a cada una de las dos placas de TC de 60 mm recubiertas de PLL y laminina, e incubar a 37 °C y 5% deCO2. Deje las placas intactas durante 2 días en la incubadora para proteger las células del estrés mecánico y para apoyar la adherencia.</li>
	</ol></li>
	<li>Diferenciación celular de Schwann<ol><li>Después de 2 días, retire el medio y enjuague cuidadosamente las placas 2x con DMEM (glucosa alta), 10% FCS y 50 μg / ml de gentamicina. Después, agregue 2 ml de medio celular de Schwann. Reemplace el medio celular de Schwann cada2º día, y observe la apariencia y confluencia celular usando un microscopio. NOTA: Las células de Schwann y los explantes DRG deben prepararse de manera oportuna y coordinada para el cocultivo. Asegúrese de que una rata con embriones en E 13.5 esté disponible para la preparación de DRG cuando las células de Schwann estén cerca de una confluencia del 80%.</li>
	</ol></li>
	<li>Tripsinización celular y separación magnética NOTA: Para obtener imágenes ejemplares de diferentes etapas de cultivo celular de Schwann, ver Figura complementaria 1.<ol><li>Cuando las células alcancen una confluencia de aproximadamente 80% (6-12 días de cultivo), lavar cuidadosamente las placas 2x con 3 mL de DPBS e incubar con 2 mL de tripsina/EDTA al 0,05% (precalentado a 37 °C) durante 3 min. Cuando las células se desprenden del fondo de la placa, inactivar la digestión mediante la adición de 2 ml de DMEM con 10% de FCS y 50 μg / ml de gentamicina. NOTA: Apéguese a un tiempo de tripsinización de estrictamente 3 minutos, y proceda rápidamente después.</li>
		<li>Resuspender el pellet celular en 2 ml de tampón de separación celular magnética que contenga DPBS con 0,5% de albúmina sérica bovina (BSA) y 2 nM EDTA. Combine 10 μL de la suspensión celular con 10 μL de azul de tripano y cuente las células utilizando una cámara de tinción.</li>
		<li>Centrifugar la suspensión celular a 188 x g durante 10 min a 4 °C y resuspender el pellet celular en 90 μL de tampón magnético de separación celular por 1 x 107 células. Añadir 10 μL de microperlas Thy-1 por 1 x 107 células. Vuelva a suspender la solución varias veces e incubar durante 15 minutos en la oscuridad a 8 °C.</li>
		<li>Añadir 2 ml del tampón de separación de células magnéticas a la suspensión celular y centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 500 μL de tampón de separación de células magnéticas.</li>
		<li>Humedezca la columna de separación de células magnéticas con 1 ml de tampón de separación de células magnéticas. Coloque la columna de separación de células magnéticas en el separador de células magnéticas. Aplique las celdas a la columna de separación de células magnéticas. Recoger el flujo y centrifugar a 300 x g a 4 °C durante 10 min. NOTA: Los fibroblastos se seleccionan positivamente y permanecen en la columna, mientras que las células de Schwann pasan por la columna. Los fibroblastos se pueden recolectar con un sello (por ejemplo, como control negativo para los protocolos de tinción de células de Schwann).</li>
		<li>Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 ml del medio de cocultivo (ver paso 3.1.1). Cuente las células después de la tinción con azul de tripano y una cámara de tinción.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Cultivo de explante DRG
<ol><li>Preparación del medio de crecimiento DRG<ol><li>Prepare el medio de crecimiento DRG agregando 2% de B27, 2% de suero de caballo, 1% de L-glutamina, 0.5% de penicilina/estreptomicina y 10 ng / ml de factor de crecimiento nervioso (NGF) al medio neurobasal. Conservar el medio de cultivo a 4 °C. NOTA: El medio de crecimiento se puede utilizar durante 2 días.</li>
	</ol></li>
	<li>Recubrimiento para explantes DRG<ol><li>Incubar los cubedores en etanol al 70% durante 1 h y colóquelos en los pocillos de los platos de 4 pocillos utilizando pinzas curvas. Después de que el etanol se haya secado, aplicar 300 μL de 0,2 mg/ml de poli-D-lisina (PDL) por pocillo e incubar durante la noche a 37 °C y 5% deCO2.</li>
		<li>Lave los cubreobjetos 3 veces durante 5 minutos cada uno con DPBS consecutivamente. Retire el DPBS, aplique 300 μL de laminina de 1 μg/ml a los cubreobjetos e incube durante la noche a 37 °C y 5% deCO2.</li>
		<li>Después de tres pasos de lavado con DPBS durante 5 minutos, reemplace el DPBS con 190 μL de medio de crecimiento DRG. Colocar las placas de 4 pocillos en la incubadora a 37 °C y al 5% deCO2.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación DRG NOTA: Coseche el DRG de ratas embrionarias bajo un banco limpio.<ol><li>Antes de la preparación, limpie todos los instrumentos con etanol al 70%. Llene 10 (dos por embrión) platos de TC de 35 mm con 2 ml de HBSS helado por plato, y dos platos de TC de 100 mm con 5 ml de HBSS helado por plato.</li>
		<li>Eutanasia de las ratas preñadas (hembras adultas de ratas Sprague Dawley, E13.5) por inhalación y decapitación deCO2 .</li>
		<li>Rocíe el cuerpo con etanol al 70% y abra el torso ventral de la rata. Retire con cuidado el útero y colóquelo en una placa TC de 100 mm con HBSS helado.</li>
		<li>Sostenga el útero con fórceps curvos y abra la pared del útero con fórceps finos. Retire un saco amniótico y ábralo cuidadosamente pellizcando un orificio con fórceps finos.</li>
		<li>Retire el embrión de los tejidos circundantes, corte el cordón umbilical y decapite el embrión con fórceps finos. Coloque el torso en una placa TC de 100 mm llena de HBSS usando pinzas curvas y una espátula.</li>
		<li>Retire rápidamente todos los embriones del útero y transfiéralos a una placa TC de 100 mm llena de HBSS. Si hay más de cinco embriones, preparar una placa adicional de 35 mm TC con 2 ml de HBSS, de acuerdo con el paso 2.3.1.</li>
		<li>Coloque suavemente el torso de un embrión en una placa TC de 35 mm llena de HBSS usando una espátula y pinzas curvas. Bajo un microscopio estereoscópico, abra la parte dorsal del torso para dividir el embrión en dos mitades usando fórceps finos y microtijeras. Gire una mitad hacia un lado e identifique la hebra de DRG ubicada en una línea en la parte dorsal del embrión.</li>
		<li>Corte el DRG como una hebra completa usando pinzas finas y micro tijeras. Coloque el DRG en una placa fresca de TC de 35 mm llena de 2 ml de HBSS y separe un solo DRG del tejido restante con pinzas finas y microtijeras.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultivo celular DRG<ol><li>Tome placas de 4 pocillos que contengan 190 μL de medio de crecimiento DRG de la incubadora al banco limpio donde se preparará el DRG. Transfiera un solo DRG cuidadosamente a un pocillo de una placa de cultivo de 4 pocillos usando fórceps finos y una espátula. Coloque el DRG en el centro de cada pozo, ya que una posición central es importante para la fijación del DRG.</li>
		<li>Trabaje en condiciones estériles a partir de ahora. Colocar los cultivos de explante en la incubadora a 37 °C y 5% deCO2. Al día siguiente, añadir 50 μL del medio de crecimiento DRG cuidadosamente a cada pocillo con una pipeta de 100 ml.</li>
		<li>Observe la adherencia al explante de DRG y el crecimiento de axones usando un microscopio diariamente, y deseche los explantes de DRG que se hayan desprendido del cubreobjetos o no hayan superado los axones en el día 3 de cultivo. NOTA: Los explantes DRG son muy frágiles en los primeros días de cultivo y deben manejarse con cuidado, especialmente cuando se mueven las placas dentro y fuera de la incubadora cuando se cambia el medio, o incluso cuando se cierra la puerta de la incubadora. El volumen preciso de 190 μL de medio por pocillo es crucial para mantener los explantes DRG en su lugar durante el primer día de cultivo. Los explantes DRG sueltos se pueden identificar fácilmente durante el control diario, ya que nadan en el medio en lugar de adherirse al cubreobjetos.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Cocultura
<ol><li>Transferencia de células de Schwann al cultivo de explante DRG<ol><li>Preparar el medio de cocultivo añadiendo ácido ascórbico al 0,1% al medio de crecimiento DRG.</li>
		<li>En el día 3 del cultivo de explante de DRG, reemplace cuidadosamente el medio de crecimiento DRG con 250 μL del medio de cocultivo que contiene 30,000 células de Schwann (del paso 1.8) por pocillo.</li>
		<li>Mantenga el cocultivo de los explantes DRG y las células de Schwann hasta por 22 días. Reemplace 250 μL del medio de cocultivo cuidadosamente cada dos días y observe la apariencia de las células con un microscopio. NOTA: Para ver un ejemplo de axones DRG y células de Schwann en el cocultivo en los primeros días de cultivo, ver Figura 1.</li>
	</ol></li>
	<li>Tinción inmunocitoquímica NOTA: Manipule las muestras de cocultivo con mucho cuidado durante el procedimiento de tinción, ya que pueden dañarse fácilmente.<ol><li>Para fijar las células en los cubreobjetos, retire el medio lentamente, lave 3 veces con DPBS cuidadosamente e incube en paraformaldehído al 4% (PFA) durante 10 min. Reemplace el PFA con DPBS y almacene las celdas fijas a 4 °C durante un máximo de 1 semana. PRECAUCIÓN: Cuando manipule PFA al 4%, use el equipo de protección personal recomendado.</li>
		<li>Lave los cubreobjetos 3 veces con DPBS durante 5 minutos, luego bloquee con solución de bloqueo (10% de suero de cabra, 10% de albúmina sérica bovina [BSA], 0,1% de gelatina y Triton X-100 al 0,05%) en DPBS durante 1 h. Diluir los anticuerpos primarios βIII-tubulina (1:7.500) y la proteína básica de mielina (MBP) (1:750) en la solución bloqueante, e incubar durante la noche a 4 °C.</li>
		<li>Lave las celdas 3 veces con DPBS durante 5 min. Utilice anticuerpos secundarios conjugados con colorante fluorescente en una dilución de 1:1.000 en solución de bloqueo e incube durante 2 h a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Lave las celdas 3 veces con DPBS durante 5 minutos y monte las células en portaobjetos microscópicos con medio de montaje de fluorescencia, incluido el 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Conservar los portaobjetos en la oscuridad a 4 °C hasta que estén documentados de forma microscópica. PRECAUCIÓN: Cuando manipule un medio de montaje de fluorescencia, use el equipo de protección personal recomendado.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis<ol><li>Tome fotografías de ocho regiones definidas que rodean el explante de DRG en el centro con un microscopio invertido.</li>
		<li>Utilice una aplicación de software de análisis de imágenes para cuantificar las áreas de axones βIII-tubulina positivos y mielinización teñidos por MBP.</li>
		<li>Calcular el porcentaje de mielinización como una relación entre los axones mielinizados y los axones no mielinizados.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., Coggeshall, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+cell+body+size%2C+axon+size%2C+and+signal+conduction+velocity+for+individually+labelled+dorsal+root+ganglion+cells+in+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat.</a> The Journal of Comparative Neurology. 243 (3), 335-346 (1986).</li>
<li>Taveggia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cells-axon+interaction+in+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Schwann cells-axon interaction in myelination.</a> Current Opinion in Neurobiology. 39, 24-29 (2016).</li>
<li>Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve+regeneration+and+muscle+reinnervation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve regeneration and muscle reinnervation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8652(2020).</li>
<li>Nocera, G., Jacob, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Schwann+cell+plasticity+involved+in+peripheral+nerve+repair+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (20), 3977-3989 (2020).</li>
<li>Modrak, M., Talukder, M. A. H., Gurgenashvili, K., Noble, M., Elfar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve+injury+and+myelination%3A+Potential+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve injury and myelination: Potential therapeutic strategies.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (5), 780-795 (2020).</li>
<li>Salzer, J. L., Bunge, R. P., Glaser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+Schwann+cell+proliferation.+III.+Evidence+for+the+surface+localization+of+the+neurite+mitogen%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Studies of Schwann cell proliferation. III. Evidence for the surface localization of the neurite mitogen.</a> The Journal of Cell Biology. 84 (3), 767-778 (1980).</li>
<li>Wood, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+sensory+axons+are+mitogenic+for+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells.</a> Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).</li>
<li>Eldridge, C. F., Bunge, M. B., Bunge, R. P., Wood, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+axon-related+Schwann+cells+in+vitro.+I.+Ascorbic+acid+regulates+basal+lamina+assembly+and+myelin+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of axon-related Schwann cells in vitro. I. Ascorbic acid regulates basal lamina assembly and myelin formation.</a> The Journal of Cell Biology. 105 (2), 1023-1034 (1987).</li>
<li>Paivalainen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+in+mouse+dorsal+root+ganglion%2FSchwann+cell+cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 37 (3), 568-578 (2008).</li>
<li>Clark, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-cultures+with+stem+cell-derived+human+sensory+neurons+reveal+regulators+of+peripheral+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination.</a> Brain. 140 (4), 898-913 (2017).</li>
<li>Taveggia, C., Bolino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DRG+neuron%2FSchwann+cells+myelinating+cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">DRG neuron/Schwann cells myelinating cocultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1791, 115-129 (2018).</li>
<li>Andersen, N. D., Srinivas, S., Pinero, G., Monje, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+versatile+method+for+the+isolation%2C+purification+and+cryogenic+storage+of+Schwann+cells+from+adult+rodent+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A rapid and versatile method for the isolation, purification and cryogenic storage of Schwann cells from adult rodent nerves.</a> Scientific Reports. 6, 31781(2016).</li>
<li>Pitarokoili, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+triamcinolone+acetonide+exerts+anti-inflammatory+effects+on+Lewis+rat+experimental+autoimmune+neuritis+and+direct+anti-oxidative+effects+on+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Intrathecal triamcinolone acetonide exerts anti-inflammatory effects on Lewis rat experimental autoimmune neuritis and direct anti-oxidative effects on Schwann cells.</a> Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 58(2019).</li>
<li>Grüter, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+and+anti-oxidative+effect+of+the+direct+TRPV1+receptor+agonist+capsaicin+on+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory and anti-oxidative effect of the direct TRPV1 receptor agonist capsaicin on Schwann cells.</a> Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 145(2020).</li>
<li>Lehmann, H. C., Höke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cells+as+a+therapeutic+target+for+peripheral+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+%26+Neurological+Disorders+-+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Schwann cells as a therapeutic target for peripheral neuropathies.</a> CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 9 (6), 801-806 (2010).</li>
<li>Joshi, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Schwann+cell+plasticity+in+chronic+inflammatory+demyelinating+polyneuropathy+%28CIDP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Loss of Schwann cell plasticity in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP).</a> Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 255(2016).</li>
<li>Klimas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-dependent+immunomodulatory+effects+of+bortezomib+in+experimental+autoimmune+neuritis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Communications%22%5BJournal%5D)">Dose-dependent immunomodulatory effects of bortezomib in experimental autoimmune neuritis.</a> Brain Communications. 3 (4), (2021).</li>
<li>Szepanowski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPA1+signaling+drives+Schwann+cell+dedifferentiation+in+experimental+autoimmune+neuritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">LPA1 signaling drives Schwann cell dedifferentiation in experimental autoimmune neuritis.</a> Journal of Neuroinflammation. 18 (1), 293(2021).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Aquí, presentamos un protocolo rápido y fácil para la generación de mielinización in vitro mediante la fusión de dos cultivos de tipo celular separados, células de Schwann y explantes ganglionares de la raíz dorsal.
Un paso crítico del protocolo es el cultivo de explantes DRG, especialmente en los primeros días de cultivo. Los DRG son muy frágiles antes de que se construya una red axonal fuerte y deben manejarse con mucho cuidado, por ejemplo, cuando se sacan de la incubadora o durant...

En el sistema nervioso periférico (SNP), la transducción rápida de información está mediada por axones envueltos en mielina. La mielinización de los axones es esencial para permitir la rápida propagación de los impulsos eléctricos, ya que la velocidad de conducción de las fibras nerviosas se correlaciona con el diámetro del axón y el grosor de la mielina1. La señalización sensorial desde la periferia hasta el sistema nervioso central (SNC) se basa en la activación de neuronas sensoriales de primer orden que residen en agrandamientos de la raíz dorsal, denominados ganglios de la raíz dorsal (GRD). Para la formación y el mantenimiento de la mielina, la comunicación continua entre los axones y las células de Schwann, que son las células gliales mielinizantes en el SNP, es obligatoria2.
Muchas enfermedades del SNP perturban la transducción de información por daño axonal primario o desmielinizante, lo que resulta en hipestesia o disestesia. Las neuronas sensoriales de primer orden tienen la capacidad de regenerarse en cierta medida después del daño neuronal, por una interacción compleja entre la neurona y las células de Schwann circundantes3. En este caso, las células de Schwann pueden someterse a una reprogramación celular para eliminar los desechos axonales y de mielina y promover la regeneración axonal, lo que resulta en la remielinización4. Comprender los mecanismos de mielinización en la salud y la enfermedad es importante, con el fin de encontrar posibles opciones de tratamiento para los trastornos desmielinizantes de la SNP. La mielina también puede ser dañada por neurotrauma agudo, y los enfoques para promover la mielinización para avanzar en la recuperación funcional después de la lesión del nervio periférico están bajo investigación5.
Nuestro conocimiento de la mielinización periférica se ha beneficiado en gran medida de los cocultivos mielinizantes de células de Schwann y neuronas sensoriales. Desde que se aplicaron los primeros abordajes 6,7,8, la mielinización ha sido intensamente estudiada con el uso de diferentes sistemas de cocultivo9,10,11. Aquí, proporcionamos un protocolo rápido y fácil para la mielinización in vitro robusta de los axones ganglionares de la raíz dorsal. El protocolo para la preparación de células de Schwann se basa en el protocolo de Andersen et al.12, publicado previamente en Pitarokoili et al.13. Utilizamos células de Schwann derivadas de ratas jóvenes y cultivos embrionarios de explante DRG para el cocultivo, en el que la mielinización ocurre alrededor del día 14. El objetivo del método es proporcionar un sistema para investigar la formación de mielina como resultado de la interacción directa axón-célula de Schwann, y estudiar los moduladores de la mielinización del SNP. En comparación con los cultivos celulares neuronales disociados, los explantes de DRG se conservan más anatómicamente y forman procesos axonales largos. La cuantificación del área del axón mielinizado proporciona una lectura suficiente para la mielinización en el cocultivo. El método es una herramienta valiosa para detectar compuestos terapéuticos por su efecto potencial sobre la mielinización del SNP, y también puede ser utilizado además de estudios in vivo en modelos animales14.

<table><tbody><tr><td>Anti-MBP, conejo</td><td>Novus Biologicals, Centannial, EE. UU.</td><td>ABIN446360</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&szlig; III-tubulina, ratón&nbsp;</td><td>Biolegend, San Diego, EE. UU</td>. <td>657402</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania &nbsp;</td><td>A4403-100MG</td><td></td></tr><tr><td>B27-suplemento</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania&nbsp;</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Punta de filtro de biosfera, 100 y micro; L</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Alemania &nbsp;</td><td></td><td></td>70760212</tr><tr><td>Punta de filtro Biosphere, 1250 y micro; L</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Alemania &nbsp;</td><td></td><td></td>701186210</tr><tr><td>Punta de filtro Biosphere, 20 y micro; L</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Alemania &nbsp;</td><td></td><td></td>701114210</tr><tr><td>Punta de filtro Biosphere, 300 y micro; L</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Alemania &nbsp;</td><td></td><td></td>70765210</tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemania&nbsp;</td><td>8076.4</td><td></td></tr><tr><td>Colador de células, 100 y micro; M</td><td>BD Bioscience, Heidelberg, Alemania</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5810-R</td><td>Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania</td><td>5811000015</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubadora Heracell</td><td>Heraeus Instruments, Hanau, Alemania&nbsp;</td><td></td><td></td>51017865</tr><tr><td>Cubreobjetos 12 mm</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemania&nbsp;</td><td>P231.1</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas finas curvadas&nbsp;</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemania</td><td>11370-42</td><td></td></tr><tr><td>DAPI fluoromount-G(R)</td><td>Biozol, Eching, Alemania</td><td>SBA-0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa II</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania&nbsp;</td><td></td><td></td>4942078001</tr><tr><td>Agua destilada (sistema de purificación de agua)&nbsp;</td><td>Millipore, Molsheim, Francia</td><td>ZLXS5010Y</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania&nbsp;</td><td></td><td></td>31331093</tr><tr><td>DPBS (sin Ca2+ y sin Mg2+)</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania&nbsp;</td><td>D8537-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Etanol&nbsp;</td><td>VWR, Radnor, Estados Unidos&nbsp;</td><td></td><td></td>1009862500</tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania&nbsp;</td><td>F7524</td><td>FCS debe probarse para el cultivo de células de Schwann</td></tr><tr><td>Pinzas finas (Dumont #5)</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemania</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemania</td><td>11370-40</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania&nbsp;</td><td>F6886-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania &nbsp;</td><td>G1393-20ML</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania</td><td>5710064</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania &nbsp;</td><td>A11036</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-conejo IgG Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania&nbsp;</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (sin Ca2+ y sin Mg2+)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania &nbsp;</td><td></td><td></td>14170138</tr><tr><td>Incubadora HERAcell</td><td>Heraeus Instruments, Hanau, Alemania &nbsp;</td><td></td><td></td>51017865</tr><tr><td>Heraguard ECO 1.2</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania&nbsp;</td><td></td><td></td>51029882</tr><tr><td>Suero de caballo</td><td>Pan-Biotech, Aidenbach, Alemania</td><td>P30-0712</td><td></td></tr><tr><td>Imagen J Software</td><td>HIH, Bethesda, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania &nbsp;</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&agudo; s L-15 Medio</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania &nbsp;</td><td></td><td></td>11415064</tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania &nbsp;</td><td></td><td></td>25030024</tr><tr><td>MACS Multistand&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania</td><td>130042303</td><td></td></tr><tr><td>Microscissors</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemania</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio&nbsp;</td><td>Motic, Wetzlar, Alemania</td><td>Motic BA 400</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Axio observador 7</td><td>Zeiss, Oberkochen, Alemania &nbsp;</td><td>491917-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>VWR, Radnor, EE. UU.&nbsp;</td><td>630-1985</td><td></td></tr><tr><td>Separador MiniMACS</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania</td><td>130091632</td><td></td></tr><tr><td>Columnas MS</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de recuento Neubauer&nbsp;</td><td>Asistente, Erlangen, Alemania</td><td>40441 &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Neuregulin</td><td>Peprotech, Rocky Hill, EE. UU</td>. <td>100-03</td><td></td></tr><tr><td>Medio neurobasal&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania &nbsp;</td><td></td><td></td>21103049</tr><tr><td>NGF</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania&nbsp;</td><td>N1408</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra normal</td><td>Biozol, Eching, Alemania</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon & Delta; multiplatos, 4 pocillos</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania&nbsp;</td><td>D6789</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Acros Organics, Nueva Jersey, EE. UU.&nbsp;</td><td></td><td></td>10342243</tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania&nbsp;</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pipetboy</td><td>Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania</td><td>4430000018&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania</td><td>2231300004</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania&nbsp;</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania&nbsp;</td><td>P4707-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de reacción, 15&nbsp; mL</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Alemania &nbsp;</td><td></td><td></td>62554502</tr><tr><td>Tubos de reacción, 50&nbsp; mL</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Alemania &nbsp;</td><td></td><td></td>62547254</tr><tr><td>Recipientes de reacción, 1,5 mL</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Alemania &nbsp;</td><td></td><td></td>72690001</tr><tr><td>armario de seguridad S2020 1.8</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania&nbsp;</td><td></td><td></td>51026640</tr><tr><td>Scissors</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemania</td><td>14083-08</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica, 10 mL</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Alemania &nbsp;</td><td></td><td></td>861254025</tr><tr><td>Pipeta serológica, 25 mL</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Alemania &nbsp;</td><td></td><td></td>861685001</tr><tr><td>Pipeta serológica, 5 mL</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Alemania &nbsp;</td><td></td><td></td>861253001</tr><tr><td>Espátula</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemania</td><td>10094-13</td><td></td></tr><tr><td>Descubrimiento de microscopio estereoscópico.V8</td><td>Zeiss, Oberkochen, Alemania&nbsp;</td><td>495015-0012-000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Alemania</td><td>14007-14</td><td></td></tr><tr><td>TC dish 100, célula +</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Alemania &nbsp;</td><td></td><td></td>833902300</tr><tr><td>Plato TC 35, celda +</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Alemania &nbsp;</td><td></td><td></td>833900300</tr><tr><td>Plato TC 60, celda +</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Alemania &nbsp;</td><td></td><td></td>833901300</tr><tr><td>Thy-1 Microbeads (MACS Kit)</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania</td><td>130-094-523</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania &nbsp;</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Solución de Azul de Tripán 0.4%&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania &nbsp;</td><td></td><td></td>15250061</tr><tr><td>tripsina (2,5%), rojo sin fenol</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania&nbsp;</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), rojo fenol</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Alemania&nbsp;</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa tipo I</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Alemania&nbsp;</td><td>C1639</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua tipo 1008</td><td>GFL, Burgwedel, Alemania&nbsp;</td><td>4285</td><td></td></tr></tbody></table>

mielinización in vitro de axones periféricos en un cocultivo de explantes de ganglio de raíz dorsal de rata y células de schwann

In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells

El proceso de mielinización es esencial para permitir una transducción de señal rápida y suficiente en el sistema nervioso. En el sistema nervioso periférico, las neuronas y las células de Schwann participan en una interacción compleja para controlar la mielinización de los axones. Las alteraciones de esta interacción y la ruptura de la vaina de mielina son características de las neuropatías inflamatorias y ocurren secundariamente en trastornos neurodegenerativos. Aquí, presentamos un modelo de cocultivo de explantes de ganglio de raíz dorsal y células de Schwann, que desarrolla una mielinización robusta de axones periféricos para investigar el proceso de mielinización en el sistema nervioso periférico, estudiar las interacciones axón-célula de Schwann y evaluar los efectos potenciales de los agentes terapéuticos en cada tipo de célula por separado. Metodológicamente, los ganglios de la raíz dorsal de ratas embrionarias (E13.5) fueron cosechados, disociados de su tejido circundante y cultivados como explantes enteros durante 3 días. Las células de Schwann se aislaron de ratas adultas de 3 semanas de edad, y los nervios ciáticos se digirieron enzimáticamente. Las células de Schwann resultantes se purificaron mediante clasificación celular activada magnéticamente y se cultivaron en condiciones enriquecidas con neuregulina y forskolina. Después de 3 días de cultivo de explante del ganglio de la raíz dorsal, se agregaron 30,000 células de Schwann a un explante del ganglio de la raíz dorsal en un medio que contenía ácido ascórbico. Los primeros signos de mielinización se detectaron en el día 10 de cocultivo, a través de señales dispersas para la proteína básica de mielina en la tinción inmunocitoquímica. A partir del día 14, se formaron vainas de mielina y se propagaron a lo largo de los axones. La mielinización se puede cuantificar mediante tinción de proteínas básicas de mielina como una relación entre el área de mielinización y el área del axón, para tener en cuenta las diferencias en la densidad axonal. Este modelo proporciona oportunidades experimentales para estudiar diversos aspectos de la mielinización periférica in vitro, lo cual es crucial para comprender la patología y las posibles oportunidades de tratamiento para la desmielinización y la neurodegeneración en enfermedades inflamatorias y neurodegenerativas del sistema nervioso periférico.

La mielinización en el cocultivo se evaluó en los días 10, 12, 14, 16, 18 y 20. Los explantes de DRG y las células de Schwann se tiñeron para MBP, βIII-tubulina y DAPI. La red axonal en el cocultivo fue densa y no cambió visiblemente en el curso temporal de la observación. Los primeros signos de mielina, en forma de pequeños fragmentos, fueron detectables el día 10 y aumentaron el día 12 (Figura 2). Las áreas positivas para MBP aumentaron con el tiempo hasta el día 20 de cultura. La mieliniz...

En el sistema de cocultivo de los ganglios de la raíz dorsal y las células de Schwann, se puede estudiar la mielinización del sistema nervioso periférico. Este modelo proporciona oportunidades experimentales para observar y cuantificar la mielinización periférica y estudiar los efectos de compuestos de interés en la vaina de mielina.

Mielinización in vitro de axones periféricos en un cocultivo de explantes de ganglio de raíz dorsal de rata y células de Schwann

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, ...

Este modelo proporciona oportunidades experimentales para estudiar diversos aspectos de la mielinización del sistema nervioso periférico in vitro. Permite la cuantificación de mielina y el examen de las interacciones de las células de Axon-Schwann. La co-cultura desarrolla una mielinización robusta desde el día 14 en adelante.Los cultivos de explante DRG proporcionan la ventaja de una arquitectura estructural intacta en comparación con los cultivos neuronales disociados. Este método está disponible para detectar compuestos tropóticos para enfermedades inflamatorias y neurodegenerativas del sistema nervioso periférico. Para comenzar, esterilice el área de trabajo en el torso de la rata sacrificada con etanol al 70%.Abra la extremidad inferior izquierda dorsal de la rata con tijeras y retire con cuidado el músculo femoroso del bíceps. Afloje el nervio ciático mediante una elevación suave con fórceps curvos, asegurándose de no magullar el nervio. Usando fórceps, Transfiera los nervios recortados a una placa de cultivo de tejidos con el medio L-15 de Leibovitz helado con 50 microgramos por mililitro de gentamicina.Luego, usando un microscopio estéreo, retire la grasa, el músculo y los vasos sanguíneos de los nervios con dos pares de pinzas finas. Identificar los extremos proximal y distal del nervio ciático y extraer el epineuro con un par de fórceps finos en dirección proximal a distal mientras se sostiene el extremo del nervio proximal con el segundo par de fórceps finos. Después de transferir los nervios purificados a otra placa de cultivo de tejidos con el medio L-15 de Leibovitz helado con gentamicina, realice burlas de los fascículos nerviosos aislados para separar y aislar fibras nerviosas individuales usando dos pares de pinzas finas.Transfiera las fibras nerviosas a un tubo de 50 mililitros utilizando una pipeta serológica de 10 mililitros y tome la menor cantidad de medio posible. Luego agregue 50 mililitros de medio L 15 de leibovitz con gentamicina a las fibras nerviosas varias veces. Centrifugar el tubo que contiene las fibras nerviosas a 188 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Después de retirar el sobrenadante, transfiera el pellet con el medio L-15 restante de Leibovitz a una placa de cultivo de tejidos de 60 milímetros. Enjuague el tubo de 50 mililitros con 10 mililitros de la solución de digestión enzimática y agréguelo al plato de fibras nerviosas. Distribuya las fibras nerviosas en el plato cuidadosamente con la punta de una pipeta.Incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 18 horas. Y detenga la digestión enzimática agregando 10 mililitros al 40% FCS en HBSS. Transfiera los nervios digeridos a un tubo de 50 mililitros para centrifugar a 188 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de DMEM que contengan 10% de FCS y 50 microgramos por mililitro de gentamicina. A continuación, filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 100 micrómetros. después de centrifugar a 188 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, vuelva a suspender el pellet con cuatro mililitros de DMEM que contengan FCS y gentamicina.Agregue dos mililitros de la suspensión celular a cada una de las dos placas de cultivo de tejido de 60 milímetros recubiertas de polilisina y laminina. Incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, dejando las placas intactas durante dos días en la incubadora. Centrifugar la suspensión de células de Schwann a 188 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, y volver a suspender la cápsula de células en 90 microlitros de tampón de separación de células magnéticas por una vez 10 a la séptima celda.Luego agregue 10 microlitros de micro perlas ti1 por una vez 10 a la séptima celda. Incubar la solución resuspendida durante 15 minutos en la oscuridad a ocho grados centígrados. A continuación, agregue dos mililitros en el tampón de separación de células magnéticas a la suspensión celular.Después de centrifugar a 300 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de tampón de separación de células magnéticas. Coloque la columna de separación de células magnéticas en el separador de celdas y humedezca la columna con un mililitro del tampón de separación de células magnéticas. Luego aplique las células a él para recoger el flujo a través de la centrifugación.Retire cuidadosamente el útero de una rata embarazada sacrificada y colóquelo en un plato de cultivo de tejido de 100 milímetros con HBSS helado. Sosteniendo el útero con fórceps curvos, abra la pared del útero con fórceps finos. Retire un saco amniótico y ábralo con cuidado pellizcando un agujero con fórceps finos.Retire rápidamente todos los embriones del útero y transfiéralos a un plato lleno de HBSS. Suavemente, coloque un torso de embrión en un plato de 35 milímetros lleno de HBSS. bajo un microscopio estéreo, abra la parte dorsal del torso para dividir el embrión en dos mitades.Gire una mitad hacia un lado e identifique la hebra de ganglios de la raíz dorsal, o DRG, ubicada en la línea en la parte dorsal del embrión. Corte el DRG como una hebra completa usando pinzas finas y micro tijeras. Después de colocar el DRG en un plato fresco lleno de dos mililitros de HBSS, separe un solo DRG del tejido restante con pinzas finas y microtijeras.Tome una placa de 4 pocillos que contenga 190 microlitros de medio de crecimiento DRG en cada pocillo y transfiera cuidadosamente un solo DRG al centro de cada pocillo usando pinzas finas y una espátula. Luego coloque los cultivos de explante DRG en la incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, agregue cuidadosamente 50 microlitros del medio de crecimiento DRG a cada pocillo y observe la adherencia al explante DRG y el crecimiento de axones con un microscopio diariamente.Para el cocultivo en el tercer día del cultivo de explante de DRG, reemplace cuidadosamente el medio de crecimiento de DRG con 250 microlitros del medio de cocultivo que contiene 30, 000 células de schwann por pocillo. Para realizar la tinción inmunocitoquímica, fije las células en los cubobjetos de cubierta incubando las células lavadas DPBS en paraformaldehído al 4% durante 10 minutos. Tome fotografías de las muestras teñidas inmunocitoquímicamente en ocho regiones definidas que rodean el explante de DRG en el centro utilizando un microscopio invertido.Aquí se representa la apariencia de células de schwann con una morfología alargada y en forma de huso y los delgados axones DRG en un cocultivo. La mielinización en el cocultivo se evaluó en diferentes días mediante la tinción de los explantes DRG y las células de Schwann para la proteína básica de mielina o MBP, beta tres tubulina y DAPI. La red axonal en el cocultivo fue densa y no cambió visiblemente en el curso temporal de la observación.Los primeros signos de mielinización fueron visibles en los días 10 y 12 de cocultura. A partir del día 14, la señal MVP fue más pronunciada y se detectaron axones envueltos en mielina. La mielinización aumentó con el tiempo de cocultivo hasta el día 20.La mielinización se cuantificó como una relación de las áreas positivas de MVP y beta tres tubulina. Se observó un aumento significativo de la mielinización en los días 18 y 20 en comparación con el día 10. Los cultivos de explante DRG son frágiles y deben manejarse con cuidado.Por ejemplo, cuando se saca de la incubadora o durante el cambio y la fijación del medio. Se puede formar un análisis de expresión génica de muestras de cocultivo para investigar la mielina con mayor detalle. Aquí, detectamos los marcadores de mielina PMP22, MAG, Oct6, Egr2, Olig1 el día 22.

in-vitro-myelination-peripheral-axons-coculture-rat-dorsal-root

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

A los protocolos de un sistema de cerebro de rata embrionaria cultura global se describe. Progenitoras multipotentes en los agregados pueden desarrollarse y diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos.

Preparación de las Culturas Rata total del cerebro de las neuronas y la glía de Estudios para el Desarrollo

Este video muestra un procedimiento para aislar neuronas del ganglio de la raíz dorsal (DRG) de embriones de rata y co-cultivarlas con precursores de células de Schwann para generar células de Schwann maduras. Los DRG aislados se procesan para aislar las neuronas y las células gliales. Las células aisladas se cultivan para purificar las neuronas, que luego se cultivan conjuntamente con células similares a las células de Schwann (SCLC) en un medio de cocultivo. La interacción con las neuronas...

Aislamiento de neuronas DRG y cocultivo con precursores de células de Schwann para generar células de Schwann

El video demuestra el co-cultivo de neuronas del ganglio de la raíz dorsal (DRG) con células de Schwann. Las neuronas DRG crecen primero en una membrana preestirada para el crecimiento de axones alineados. A continuación, se introducen las células de Schwann, que se adhieren a los axones, aislándolos y promoviendo la supervivencia y la función de las células neuronales.

Cocultivo de células de Schwann con neuronas DRG en una membrana preestirada

Este video muestra el modelo de coculturación de un explante de ganglio de raíz dorsal y células de Schwann. En condiciones de cocultivo, el ácido ascórbico promueve la diferenciación de las células de Schwann en formas mielinizantes. Las células de Schwann mielinizantes envuelven los axones varias veces para crear una vaina de mielina, que es esencial para la función nerviosa.

Co-cultivo de un explante de ganglios de raíz dorsal con células de Schwann para la mielinización de neuronas

Este video muestra un método para aislar células de Schwann de fibras del nervio ciático de ratón.

Separación magnética de las células de Schwann de los nervios ciáticos de ratón

Aquí presentamos protocolos que ofrecen una base flexible y estratégica para manipular viralmente células precursoras de oligodendrocitos para sobreexpresar proteínas de interés con el fin de interrogar específicamente su papel en oligodendrocitos a través del modelo in vitro de mielinización del sistema nervioso central.

Producción y Uso de lentivirus de células selectivamente la transducción primaria Oligodendrocyte precursor para In Vitro Ensayos de mielinización

Ganglios de la raíz dorsal (DRG) son estructuras que contienen las neuronas sensoriales del sistema nervioso periférico. Cuando disociado, pueden ser co-cultivadas con células madre-SC como derivadas de tejido adiposo (ASC), que proporciona un valioso modelo para estudiar la regeneración in vitro en los nervios y la mielinización, imitando el entorno en vivo en el sitio de la lesión.

Ganglios de raíz dorsal neuronas y las células madre derivadas de la adiposa diferenciada: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultivo modelo para estudiar la regeneración de los nervios periféricos

Este protocolo describe el aislamiento de neuronas del ganglio de la raíz dorsal (DRG) aisladas de ratas y el cultivo de neuronas DRG en un sistema de cultivo celular estático preestirado para mejorar la alineación de los axones, con el posterior cocultivo de células de Schwann (SC) para promover la mielinización.

Un Enfoque para Mejorar la alineación y la mielinización de las neuronas del ganglio de la raíz dorsal

Presentamos un modelo in vitro para evaluar la capacidad neurorregenerativa olfativa ensheathing glia (OEG), después de una lesión neuronal. Se basa en un cocultivo de neuronas ganglionas de retina adultas axotomizadas (RGN) en monocapas OEG y posterior estudio de regeneración axonal, mediante el análisis de marcadores axoales y somatodendriáticos RGN.

Cocultura de neuronas ganglionas retinal de rata axotomizada con glia olfativa, como modelo in vitro de regeneración axonal adulta

Este protocolo describe los métodos para establecer cultivos de montaje completo y disociados de ganglios de raíz dorsal de ratón (DRG) y su uso para evaluar las interacciones tumor-nervio.

Establecimiento de modelos in vitro del cultivo de ganglios de la raíz dorsal: enfoques complementarios para investigar la diafonía entre el cáncer y los nervios

Aprende a estudiar la mielinización periférica in vitro mediante un cocultivo de ganglios de raíz dorsal y células de Schwann de rata. Este modelo permite cuantificar la mielina y evaluar compuestos terapéuticos.

Mielinización in vitro de axones periféricos en un cocultivo de explantes de ganglio de raíz dorsal de rata y células de Schwann (Video) | JoVE Journal

Mielinización in vitro de axones periféricos en un cocultivo de explantes de ganglio de raíz dorsal de rata y células de Schwann

Explorar más videos