Mielinización in vitro de axones periféricos en un cocultivo de explantes de ganglio de raíz dorsal de rata y células de Schwann

Este modelo proporciona oportunidades experimentales para estudiar diversos aspectos de la mielinización del sistema nervioso periférico in vitro. Permite la cuantificación de mielina y el examen de las interacciones de las células de Axon-Schwann. La co-cultura desarrolla una mielinización robusta desde el día 14 en adelante.

Los cultivos de explante DRG proporcionan la ventaja de una arquitectura estructural intacta en comparación con los cultivos neuronales disociados. Este método está disponible para detectar compuestos tropóticos para enfermedades inflamatorias y neurodegenerativas del sistema nervioso periférico. Para comenzar, esterilice el área de trabajo en el torso de la rata sacrificada con etanol al 70%.

Abra la extremidad inferior izquierda dorsal de la rata con tijeras y retire con cuidado el músculo femoroso del bíceps. Afloje el nervio ciático mediante una elevación suave con fórceps curvos, asegurándose de no magullar el nervio. Usando fórceps, Transfiera los nervios recortados a una placa de cultivo de tejidos con el medio L-15 de Leibovitz helado con 50 microgramos por mililitro de gentamicina.

Luego, usando un microscopio estéreo, retire la grasa, el músculo y los vasos sanguíneos de los nervios con dos pares de pinzas finas. Identificar los extremos proximal y distal del nervio ciático y extraer el epineuro con un par de fórceps finos en dirección proximal a distal mientras se sostiene el extremo del nervio proximal con el segundo par de fórceps finos. Después de transferir los nervios purificados a otra placa de cultivo de tejidos con el medio L-15 de Leibovitz helado con gentamicina, realice burlas de los fascículos nerviosos aislados para separar y aislar fibras nerviosas individuales usando dos pares de pinzas finas.

Transfiera las fibras nerviosas a un tubo de 50 mililitros utilizando una pipeta serológica de 10 mililitros y tome la menor cantidad de medio posible. Luego agregue 50 mililitros de medio L 15 de leibovitz con gentamicina a las fibras nerviosas varias veces. Centrifugar el tubo que contiene las fibras nerviosas a 188 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.

Después de retirar el sobrenadante, transfiera el pellet con el medio L-15 restante de Leibovitz a una placa de cultivo de tejidos de 60 milímetros. Enjuague el tubo de 50 mililitros con 10 mililitros de la solución de digestión enzimática y agréguelo al plato de fibras nerviosas. Distribuya las fibras nerviosas en el plato cuidadosamente con la punta de una pipeta.

Incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 18 horas. Y detenga la digestión enzimática agregando 10 mililitros al 40% FCS en HBSS. Transfiera los nervios digeridos a un tubo de 50 mililitros para centrifugar a 188 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.

Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de DMEM que contengan 10% de FCS y 50 microgramos por mililitro de gentamicina. A continuación, filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 100 micrómetros. después de centrifugar a 188 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, vuelva a suspender el pellet con cuatro mililitros de DMEM que contengan FCS y gentamicina.

Agregue dos mililitros de la suspensión celular a cada una de las dos placas de cultivo de tejido de 60 milímetros recubiertas de polilisina y laminina. Incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, dejando las placas intactas durante dos días en la incubadora. Centrifugar la suspensión de células de Schwann a 188 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, y volver a suspender la cápsula de células en 90 microlitros de tampón de separación de células magnéticas por una vez 10 a la séptima celda.

Luego agregue 10 microlitros de micro perlas ti1 por una vez 10 a la séptima celda. Incubar la solución resuspendida durante 15 minutos en la oscuridad a ocho grados centígrados. A continuación, agregue dos mililitros en el tampón de separación de células magnéticas a la suspensión celular.

Después de centrifugar a 300 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de tampón de separación de células magnéticas. Coloque la columna de separación de células magnéticas en el separador de celdas y humedezca la columna con un mililitro del tampón de separación de células magnéticas. Luego aplique las células a él para recoger el flujo a través de la centrifugación.

Retire cuidadosamente el útero de una rata embarazada sacrificada y colóquelo en un plato de cultivo de tejido de 100 milímetros con HBSS helado. Sosteniendo el útero con fórceps curvos, abra la pared del útero con fórceps finos. Retire un saco amniótico y ábralo con cuidado pellizcando un agujero con fórceps finos.

Retire rápidamente todos los embriones del útero y transfiéralos a un plato lleno de HBSS. Suavemente, coloque un torso de embrión en un plato de 35 milímetros lleno de HBSS. bajo un microscopio estéreo, abra la parte dorsal del torso para dividir el embrión en dos mitades.

Gire una mitad hacia un lado e identifique la hebra de ganglios de la raíz dorsal, o DRG, ubicada en la línea en la parte dorsal del embrión. Corte el DRG como una hebra completa usando pinzas finas y micro tijeras. Después de colocar el DRG en un plato fresco lleno de dos mililitros de HBSS, separe un solo DRG del tejido restante con pinzas finas y microtijeras.

Tome una placa de 4 pocillos que contenga 190 microlitros de medio de crecimiento DRG en cada pocillo y transfiera cuidadosamente un solo DRG al centro de cada pocillo usando pinzas finas y una espátula. Luego coloque los cultivos de explante DRG en la incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, agregue cuidadosamente 50 microlitros del medio de crecimiento DRG a cada pocillo y observe la adherencia al explante DRG y el crecimiento de axones con un microscopio diariamente.

Para el cocultivo en el tercer día del cultivo de explante de DRG, reemplace cuidadosamente el medio de crecimiento de DRG con 250 microlitros del medio de cocultivo que contiene 30, 000 células de schwann por pocillo. Para realizar la tinción inmunocitoquímica, fije las células en los cubobjetos de cubierta incubando las células lavadas DPBS en paraformaldehído al 4% durante 10 minutos. Tome fotografías de las muestras teñidas inmunocitoquímicamente en ocho regiones definidas que rodean el explante de DRG en el centro utilizando un microscopio invertido.

Aquí se representa la apariencia de células de schwann con una morfología alargada y en forma de huso y los delgados axones DRG en un cocultivo. La mielinización en el cocultivo se evaluó en diferentes días mediante la tinción de los explantes DRG y las células de Schwann para la proteína básica de mielina o MBP, beta tres tubulina y DAPI. La red axonal en el cocultivo fue densa y no cambió visiblemente en el curso temporal de la observación.

Los primeros signos de mielinización fueron visibles en los días 10 y 12 de cocultura. A partir del día 14, la señal MVP fue más pronunciada y se detectaron axones envueltos en mielina. La mielinización aumentó con el tiempo de cocultivo hasta el día 20.

La mielinización se cuantificó como una relación de las áreas positivas de MVP y beta tres tubulina. Se observó un aumento significativo de la mielinización en los días 18 y 20 en comparación con el día 10. Los cultivos de explante DRG son frágiles y deben manejarse con cuidado.

Por ejemplo, cuando se saca de la incubadora o durante el cambio y la fijación del medio. Se puede formar un análisis de expresión génica de muestras de cocultivo para investigar la mielina con mayor detalle. Aquí, detectamos los marcadores de mielina PMP22, MAG, Oct6, Egr2, Olig1 el día 22.